DetectSyn: een snelle, onbevooroordeelde fluorescerende methode om veranderingen in synapsdichtheid te detecteren

Synapsen zijn de fundamentele eenheid van communicatie tussen neuronen¹. Veel synapsen tussen neuronen binnen dezelfde regio’s geven aanleiding tot circuits die gedrag bemiddelen². Synapsen bestaan uit een presynaptische terminal van een neuron die neurotransmitters of neuropeptiden vrijgeeft die informatie doorgeven aan postsynaptische receptoren van een ander neuron. De som van presynaptische signalen bepaalt of het postsynaptische neuron een actiepotentiaal zal afvuren en de boodschap naar andere neuronen zal verspreiden.

Synaptopathologie, het afbreken van synapsen, ontstaat bij ziekten en aandoeningen die gekenmerkt worden door een verminderd neuraal volume, zoals de ziekte van Alzheimer en depressieve stoornis, waardoor circuits die niet meer optimaal presteren ^3,4,5. Het herstellen van de synapsdichtheid ligt waarschijnlijk ten grondslag aan de werkzaamheid van mogelijke behandelingen voor deze aandoeningen. Onlangs werd bijvoorbeeld aangetoond dat toenemende synapsen ten grondslag liggen aan de gedragsmatige werkzaamheid van snelle antidepressiva⁶. Om mogelijke synaptopathologische behandelingen snel te screenen, hebben onderzoekers technieken nodig die snel veranderingen in synapsnummers identificeren.

De huidige methodologieën zijn ofwel tijdrovend en duur (elektronenmicroscopie, arraytomografie), of ze onderzoeken alleen postsynaptische veranderingen zonder presynaptische betrokkenheid op te nemen (wervelkolomanalyses, immunofluorescentie / colocalisatie). Kleurstoffen zoals DiI of fluorescerende eiwitten zoals GFP helpen neuronen te visualiseren en postsynaptische stekels te karakteriseren. Wervelkolomanalyse maakt echter gebruik van door onderzoekers gedefinieerde verhoudingen om morfologie te bepalen, wat de reproduceerbaarheid kan verminderen⁷. Verder wordt nog steeds blootgelegd hoe de verschillende wervelkolomklassen zich verhouden tot functionele synapsen⁸. Wervelkolomvorming kan van voorbijgaande aard zijn en kan postsynaptische plasticiteit weerspiegelen, maar deze stekels kunnen worden geëlimineerd voordat ze stabiliseren in een synaps met een presynaptisch neuron⁹.

Colocalisatie biedt een betere proxy voor synapsen dan wervelkolomanalyse omdat men presynaptische en postsynaptische eiwitten kan immunostainen. Synaptische eiwitten kunnen echter lage colocalisatiewaarden opleveren omdat de eiwitten naast elkaar staan en mogelijk niet consistent overlappen. Dus, omdat de eiwitten niet volledig over elkaar heen liggen, kunnen colocalisatietechnieken veranderingen in synapsvorming niet nauwkeurig meten als gevolg van deze ontbrekende informatie. Ten slotte, hoewel zowel elektronenmicroscopie (EM) als arraytomografie beelden met hoge resolutie van synapsen bieden, zijn ze tijdrovend. EM vereist verder gespecialiseerde apparatuur en onderzoekers zijn beperkt tot kleine hoeveelheden weefsel voor een bepaald experiment. Hoewel arraytomografie elegant de mogelijkheid biedt om te screenen op veel eiwitten op ultradunne secties en kan worden gecombineerd met EM¹⁰, kan deze techniek te arbeidsintensief zijn en buiten het bereik van experimenten vallen die snel moeten scannen op veranderingen in synapsvorming.

DetectSyn is een specifieke toepassing van de Duolink Proximity Ligation Assay. De PLA-test maakt de algemene detectie van eiwit-eiwitinteracties mogelijk. DetectSyn overbrugt proxy postsynaptische metingen door een fluorescerend signaal te versterken dat wordt uitgezonden door gelabelde pre- en postsynaptische eiwitten binnen 40 nm van elkaar. Als de synaptische eiwitten zich binnen 40 nm bevinden, zoals in een synaptische spleet, dan zullen de secundaire antilichamen, die DNA-sondes bevatten, hybridiseren tot circulair DNA. Dit gehybridiseerde cirkelvormige DNA drukt een fluorescerende sonde uit, die vervolgens wordt versterkt en gedetecteerd met standaard fluorescerende microscopietechnieken (zie figuur 1). Cruciaal is dat deze techniek, in tegenstelling tot EM- en arraytomografie, geen gespecialiseerde apparatuur vereist en ongeveer evenveel tijd in beslag neemt als standaard immunohistochemie. De toegankelijkheid van deze techniek stelt onderzoekers buiten onderzoeksintensieve instellingen dus in staat om deel te nemen aan synaptopathologisch onderzoek. Verder kan deze techniek veranderingen in synaptische dichtheid in meerdere hersengebieden binnen één experiment onderzoeken, waardoor een meer holistische weergave van synaptische veranderingen als gevolg van ziekte of behandeling wordt geboden.