DetectSyn: un método fluorescente rápido e imparcial para detectar cambios en la densidad de la sinapsis

Las sinapsis son la unidad fundamental de comunicación entre neuronas¹. Muchas sinapsis entre neuronas dentro de las mismas regiones dan lugar a circuitos que median el comportamiento². Las sinapsis consisten en un terminal presináptico de una neurona que libera neurotransmisores o neuropéptidos que transmiten información a los receptores postsinápticos de otra neurona. La suma de señales presinápticas determina si la neurona postsináptica disparará un potencial de acción y propagará el mensaje a otras neuronas.

La sinaptopatología, la descomposición de las sinapsis, surge en enfermedades y trastornos marcados por la disminución del volumen neural, como la enfermedad de Alzheimer y el trastorno depresivo mayor, lo que resulta en circuitos que ya no funcionan de manera óptima ^3,4,5. La restauración de la densidad de la sinapsis probablemente subyace a la eficacia de los posibles tratamientos para estos trastornos. Por ejemplo, recientemente se demostró que el aumento de las sinapsis subyace a la eficacia conductual de los antidepresivos rápidos⁶. Para detectar rápidamente posibles tratamientos de sinaptopatología, los investigadores requieren técnicas que identifiquen rápidamente los cambios en los números de sinapsis.

Las metodologías actuales consumen mucho tiempo y son costosas (microscopía electrónica, tomografía de matriz), o solo examinan los cambios postsinápticos sin incorporar el compromiso presináptico (análisis de la columna vertebral, inmunofluorescencia / colocalización). Los colorantes como DiI o las proteínas fluorescentes como GFP ayudan a visualizar las neuronas y caracterizar las espinas postsinápticas. Sin embargo, el análisis de la columna vertebral utiliza proporciones definidas por el investigador para determinar la morfología, lo que puede disminuir la reproducibilidad⁷. Además, todavía se está descubriendo cómo las diferentes clases de columna vertebral se relacionan con las sinapsis funcionales⁸. La formación de la columna vertebral puede ser transitoria y puede reflejar plasticidad postsináptica, pero estas espinas podrían eliminarse antes de estabilizarse en una sinapsis con una neurona presináptica⁹.

La colocalización proporciona un mejor indicador de las sinapsis que el análisis de la columna vertebral porque se puede inmunotintar las proteínas presinápticas y postsinápticas. Sin embargo, las proteínas sinápticas pueden producir valores bajos de colocalización porque las proteínas se yuxtaponen y pueden no superponerse consistentemente. Por lo tanto, debido a que las proteínas no están totalmente superpuestas, las técnicas de colocalización pueden no medir con precisión los cambios en la formación de sinapsis debido a esta información faltante. Finalmente, aunque tanto la microscopía electrónica (EM) como la tomografía de matriz proporcionan imágenes de alta resolución de sinapsis, consumen mucho tiempo. La EM requiere además equipo especializado, y los investigadores están limitados a pequeños volúmenes de tejido para cualquier experimento dado. Si bien la tomografía de matriz proporciona elegantemente la capacidad de detectar muchas proteínas en secciones ultrafinas y se puede combinar con EM¹⁰, esta técnica puede ser demasiado laboriosa y estar más allá del alcance de los experimentos que necesitan escanear rápidamente en busca de cambios en la formación de sinapsis.

DetectSyn es una aplicación específica del ensayo de ligadura de proximidad Duolink. El ensayo de PLA permite la detección general de interacciones proteína-proteína. DetectSyn une las medidas postsinápticas proxy amplificando una señal fluorescente emitida por proteínas pre y postsinápticas etiquetadas dentro de los 40 nm entre sí. Si las proteínas sinápticas están dentro de los 40 nm, como dentro de una hendidura sináptica, entonces los anticuerpos secundarios, que contienen sondas de ADN, se hibridarán en ADN circular. Este ADN circular hibridado expresa una sonda fluorescente, que luego se amplifica y detecta con técnicas estándar de microscopía fluorescente (ver Figura 1). Crucialmente, a diferencia de la EM y la tomografía de matriz, esta técnica no requiere equipo especializado y toma aproximadamente la misma cantidad de tiempo que la inmunohistoquímica estándar. La accesibilidad de esta técnica, por lo tanto, permite a los investigadores fuera de las instituciones intensivas en investigación participar en la investigación sinaptopatología. Además, esta técnica puede examinar los cambios en la densidad sináptica en múltiples regiones del cerebro dentro de un solo experimento, ofreciendo una representación más holística de los cambios sinápticos debido a una enfermedad o tratamiento.