DetectSyn: быстрый, непредвзятый флуоресцентный метод обнаружения изменений плотности синапсов
Summary
DetectSyn – это непредвзятый, быстрый флуоресцентный анализ, который измеряет изменения относительного числа синапсов (до- и постсинаптического взаимодействия) между методами лечения или болезненными состояниями. Этот метод использует технику бесконтактной лигации, которая может быть использована как в культивируемых нейронах, так и в фиксированной ткани.
Abstract
Синапсы являются местом связи между нейронами. Сила нейронной цепи связана с синаптической плотностью, а разрушение синапсов характерно для таких болезненных состояний, как большое депрессивное расстройство (MDD) и болезнь Альцгеймера. Традиционные методы исследования чисел синапсов включают генетическую экспрессию флуоресцентных маркеров (например, зеленого флуоресцентного белка (GFP)), красителей, которые заполняют нейрон (например, карбоцианиновый краситель, DiI), и иммунофлуоресцентное обнаружение маркеров позвоночника (например, постсинаптическая плотность 95 (PSD95)). Основным предостережением к этим прокси-методам является то, что они идентифицируют только постсинаптические изменения. Тем не менее, синапс является связью между пресинаптическим терминалом и постсинаптическим позвоночником. Золотой стандарт для измерения образования/элиминации синапсов требует трудоемкой электронной микроскопии или методов массивной томографии. Эти методы требуют специализированной подготовки и дорогостоящего оборудования. Кроме того, только ограниченное количество нейронов может быть оценено и используется для представления изменений во всей области мозга. DetectSyn – это быстрый флуоресцентный метод, который идентифицирует изменения в образовании или устранении синапсов из-за болезненного состояния или активности препарата. DetectSyn использует быстрый анализ бесконтактного лигирования для обнаружения сопоставленных пре- и постсинаптических белков и стандартной флуоресцентной микроскопии, метода, легко доступного для большинства лабораторий. Флуоресцентное обнаружение полученной пункты позволяет проводить быстрый и непредвзятый анализ экспериментов. DetectSyn дает более репрезентативные результаты, чем электронная микроскопия, потому что могут быть проанализированы большие области, чем ограниченное количество флуоресцентных нейронов. Кроме того, DetectSyn работает для культивируемых in vitro нейронов и фиксированных срезов тканей. Наконец, предоставляется метод анализа данных, собранных с помощью этой техники. В целом, DetectSyn предлагает процедуру обнаружения относительных изменений плотности синапсов при лечении или болезненных состояниях и является более доступной, чем традиционные методы.
Introduction
Синапсы являются фундаментальной единицей связи между нейронами1. Многие синапсы между нейронами в пределах одних и тех же областей порождают цепи, которые опосредуют поведение2. Синапсы состоят из пресинаптического терминала от одного нейрона, который высвобождает нейротрансмиттеры или нейропептиды, которые передают информацию постсинаптическим рецепторам другого нейрона. Суммирование пресинаптических сигналов определяет, будет ли постсинаптический нейрон запускать потенциал действия и распространять сообщение на другие нейроны.
Синаптопатология, разрушение синапсов, возникает при заболеваниях и расстройствах, отмеченных уменьшением нервного объема, таких как болезнь Альцгеймера и большое депрессивное расстройство, в результате чего цепи больше не выполняютоптимально 3,4,5. Восстановление плотности синапсов, вероятно, лежит в основе эффективности потенциальных методов лечения этих расстройств. Например, недавно было продемонстрировано, что увеличение синапсов лежит в основе поведенческой эффективности быстрых антидепрессантов6. Чтобы быстро отсеять возможные методы лечения синаптопатологии, исследователям требуются методы, которые быстро идентифицируют изменения в количестве синапсов.
Современные методологии либо трудоемки и дороги (электронная микроскопия, массивная томография), либо они исследуют только постсинаптические изменения без включения пресинаптического участия (анализ позвоночника, иммунофлуоресценция / колокализация). Красители, такие как DiI, или флуоресцентные белки, такие как GFP, помогают визуализировать нейроны и характеризуют постсинаптические шипы. Тем не менее, анализ позвоночника использует определенные исследователями соотношения для определения морфологии, которая может снизить воспроизводимость7. Кроме того, как различные классы позвоночника связаны с функциональными синапсами, все еще раскрывается8. Образование позвоночника может быть преходящим и может отражать постсинаптическую пластичность, но эти шипы могут быть устранены до стабилизации в синапс с пресинаптическим нейроном9.
Колокализация обеспечивает лучший показатель для синапсов, чем анализ позвоночника, потому что можно иммуноразмношить пресинаптические и постсинаптические белки. Тем не менее, синаптические белки могут давать низкие значения колокализации, потому что белки сопоставляются и могут не последовательно перекрываться. Таким образом, поскольку белки не накладываются полностью, методы колокализации могут не точно измерять изменения в образовании синапсов из-за этой недостающей информации. Наконец, хотя и электронная микроскопия (ЭМ), и массивная томография обеспечивают изображения синапсов с высоким разрешением, они отнимают много времени. ЭМ также требует специализированного оборудования, и исследователи ограничены небольшими объемами ткани для любого данного эксперимента. В то время как массивная томография элегантно обеспечивает возможность скрининга многих белков на ультратонких срезах и может сочетаться с EM10, этот метод может быть слишком трудоемким и выходить за рамки экспериментов, которые необходимо быстро сканировать на предмет изменений образования синапсов.
DetectSyn является специфическим применением анализа близости лигирования Duolink. Анализ PLA позволяет в целом обнаруживать белково-белковые взаимодействия. DetectSyn мостит прокси-постсинаптические меры путем усиления флуоресцентного сигнала, излучаемого помеченными пре- и постсинаптическими белками в пределах 40 нм друг от друга. Если синаптические белки находятся в пределах 40 нм, как в синаптической щели, то вторичные антитела, которые содержат ДНК-зонды, будут гибридизоваться в круговую ДНК. Эта гибридизированная круговая ДНК экспрессирует флуоресцентный зонд, который затем амплифицируется и обнаруживается с помощью стандартных методов флуоресцентной микроскопии (см. Рисунок 1). Важно отметить, что в отличие от ЭМ и массивной томографии, эта методика не требует специализированного оборудования и занимает примерно столько же времени, сколько и стандартная иммуногистохимия. Таким образом, доступность этого метода позволяет исследователям за пределами научно-исследовательских учреждений участвовать в исследованиях синаптопатологии. Кроме того, этот метод может исследовать изменения синаптической плотности в нескольких областях мозга в рамках одного эксперимента, предлагая более целостное представление синаптических изменений из-за болезни или лечения.
Protocol
Representative Results
Discussion
DetectSyn – это быстрый анализ, который использует анализ бесконтактного лигирования для обнаружения белков в пределах 40 нм друг от друга, что позволяет обнаруживать образование синапсов. Этот метод улучшает текущие флуоресцентные анализы, которые служат только в качестве прокси-измерени?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения NINDS R01 NS105005 (KRG) и NS105005-03S1 (KRG), Министерством обороны USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH), а также грантом от FRAXA Research (CFH) и Ассоциации Альцгеймера, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG).
Materials
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP39920 | PBS made in house works, as well. |
| 24 well plates | Fisher Scientific | FB012929 | For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary. |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Aluminium foil | Fisher Scientific | 15-078-290 | |
| Chicken anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Other clear nail polish works, as well. |
| Cold block | Fisher Scientific | 13131012 | |
| Computer workstation | HP | ||
| Confocal or fluorescent microscope | Nikon | A1R HD25 | |
| Donkey anti-chicken FITC | Fisher Scientific | SA1-72000 | |
| Duolink donkey anti-Mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink donkey anti-Rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Far Red | Sigma | DUO92013 | Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase. |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B. |
| Fine-tipped paintbrush | Fisher Scientific | NC9691026 | Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12545MP | Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 1255015 | For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary. |
| Freezer, -20°C | VWR | 76449-108 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 125480 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Image processing software | e.g. NIS Elements, ImageJ | ||
| Incubator | Fisher Scientific | 15-015-2633 | |
| Large petri dish, 100mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP24701 | |
| Mouse anti-Synapsin1 antibody | Synaptic Systems | 106-011 | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 02-106-1013 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-025 | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | Working volumes range from 3 µL to 500 µL |
| Plastic pasteur pipette | Fisher Scientific | 02-708-006 | |
| Precision tweezers/foreceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Rabbit anti-PSD95 antibody | Abcam | ab18258 | Other antibody pairs may work, as well, with optimization. |
| Refrigerator | VWR | 76470-402 | |
| Small petri dish, 60 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
- Südhof, T. C. Towards an understanding of synapse formation. Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
- Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder. The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis. , 510-532 (2018).
- Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 9, 91-99 (2006).
- van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease. Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).
- Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation. Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).
- Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31 (2020).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).
- Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling. Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).
- Li, N., et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists. Science. 329 (5994), 959-964 (2010).
