Detection of Neutralization-sensitive Epitopes in Antigens Displayed on Virus-Like Particle (VLP)-Based Vaccines Using a Capture Assay

Jamila Franca Rosengarten; Stefanie Schatz; J&#246;rn Stitz

doi:10.3791/63137

JoVE Journal > Immunology and Infection

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Immunology and Infection

Detección de epítopos sensibles a la neutralización en antígenos mostrados en vacunas basadas en partículas similares a virus (VLP) utilizando un ensayo de captura

Published: February 10, 2022

doi:

10.3791/63137

Jamila Franca Rosengarten*^1,2, Stefanie Schatz*^1,2, Jörn Stitz¹

¹Research Group Pharmaceutical Biotechnology,TH Köln – University of Applied Sciences, ²Institute of Technical Chemistry,Leibniz University Hannover

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para detectar epítopos de neutralización en partículas similares a virus (VLP) que muestran antígenos. La inmunoprecipitación de las VLP derivadas del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) se realiza utilizando anticuerpos monoclonales específicos de glicoproteínas de la envoltura acoplados a perlas magnéticas conjugadas con proteína g. Las VLP capturadas se someten posteriormente a SDS-PAGE y western blot-análisis empleando anticuerpos específicos de gag de la proteína del núcleo viral.

Abstract

El ensayo de captura de partículas similares a virus (VLP) es un método de inmunoprecipitación, comúnmente conocido como “ensayo de extracción” utilizado para purificar y aislar VLP que muestran antígenos. Los anticuerpos específicos de antígeno de superficie se acoplan y, por lo tanto, se inmovilizan en una matriz sólida e insoluble, como las perlas. Debido a su alta afinidad con el antígeno objetivo, estos anticuerpos pueden capturar VLP decorados con el antígeno cognado anclado en la envoltura de membrana de los VLP. Este protocolo describe la unión de anticuerpos específicos de antígeno a perlas magnéticas conjugadas con proteínas A o G. En nuestro estudio, se examinan las VLP derivadas del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) formadas por la proteína precursora del núcleo viral del antígeno específico del grupo (Gag) p55 Gag y que muestran las glicoproteínas de la envoltura (Env) del VIH. Las VLP se capturan utilizando anticuerpos ampliamente neutralizantes (bNAbs) dirigidos contra epítopos sensibles a la neutralización en Env. El ensayo de captura de VLP descrito aquí representa un método sensible y fácil de realizar para demostrar que (i) las VLP están decoradas con el antígeno objetivo respectivo, (ii) el antígeno de superficie conservó su integridad estructural como lo demuestra la unión específica del epítopo de bNAbs utilizada en el ensayo y (iii) la integridad estructural de las VLP revelada por la detección de proteínas Gag en un análisis posterior de Western blot. En consecuencia, la utilización de bNAbs para la inmunoprecipitación facilita una predicción de si las vacunas VLP podrán provocar una respuesta neutralizante de células B en humanos vacunados. Anticipamos que este protocolo proporcionará a otros investigadores un enfoque experimental valioso y directo para examinar posibles vacunas basadas en VLP.

Introduction

Las partículas similares a los virus (VLP) se asemejan a la estructura de partículas de virus nativas mientras que carecen del genoma viral, proporcionando así un alto perfil de ^seguridad1,2. Las VLP representan una clase individual de vacunas cada vez más desarrolladas debido a su alta inmunogenicidad3,4,5,6,7. Este es particularmente el caso de las VLP envueltas en membrana, que permiten la visualización no solo de antígenos de superficie viral homólogos, sino también de antígenos heterólogos como los antígenos tumorales8,9,10. La Figura 1 proporciona una visión general ejemplar de la estructura de un VLP envuelto decorado con antígenos. Durante el proceso de desarrollo de vacunas basadas en VLP, los ensayos son indispensables para permitir el análisis del antígeno objetivo respectivo que se muestra en la superficie de VLP. Tales ensayos deben ser instrumentales para dilucidar la composición de una vacuna de partículas: (i) ¿Están las VLP decoradas con el antígeno de superficie respectivo? (ii) ¿Ha conservado el antígeno de superficie su estructura nativa como lo demuestra el reconocimiento del epítopo de anticuerpos neutralizantes (bNAbs) y (iii) se puede confirmar la integridad estructural de las VLP debido a la detección de la proteína viral mediadora de la formación de VLP?

Figura 1: Ilustración esquemática de un VLP envuelto en membrana. Las VLP están formadas por proteínas inmaduras precursoras del núcleo de Gag y rodeadas por una membrana lipídica derivada de la célula huésped. Los antígenos, por ejemplo, glicoproteínas de la envoltura, se incorporan a la membrana lipídica y se muestran en la superficie del VLP (a la derecha). Los anticuerpos específicos del antígeno reconocen el antígeno. A la izquierda, se muestra un VLP calvo sin decoración de antígenos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Especialmente las VLP formadas por la proteína precursora del núcleo del antígeno específico del grupo viral (Gag) p55 del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) son andamios preferidos para la visualización de antígenos en el desarrollo de vacunas, ya que hay numerosos anticuerpos, y hay kits ELISA disponibles, lo que permite la cuantificación de estas ^VLP11,12. Las glicoproteínas de la envoltura del VIH-1 (Env), a saber, la proteína transmembrana gp41 (gp41-TM) y la unidad de superficie soluble gp120 (gp120-SU) formando heterodímeros, se incorporan a la envoltura de membrana de partículas y son antígenos diana cruciales para el desarrollo de vacunas contra la infección por VIH13,14,15 . La visualización de epítopos sensibles a la neutralización en estos antígenos diana es un requisito previo para provocar una respuesta de anticuerpos ampliamente neutralizante en los vacunados. Además de una respuesta de las células T dirigida contra las proteínas Gag, esto se considera un correlato importante de protección contra la infección por ^VIH16. En consecuencia, y tras el diseño y la producción de VLP decorados con candidatos a antígenos objetivo, el análisis posterior de la calidad de los antígenos mostrados representa un paso crítico en el proceso de desarrollo de vacunas.

La inmunoprecipitación (IP) es una técnica ampliamente utilizada para la detección de interacciones proteína-proteína y la purificación de complejos proteicos a pequeña ^escala17. Barret et al. Se informó por primera vez sobre el desarrollo de la P.I. en 1960, sin embargo, este método se ha mejorado constantemente. IP permite la captura y aislamiento de un antígeno objetivo (presa) de una solución mediante el empleo de un anticuerpo específico de antígeno (cebo) inmovilizado por acoplamiento a ^perlas18,19. En este protocolo, demostramos una variación de la aplicación IP clásica utilizando VLP formadas por gag p55 envueltas en membrana como presa y bNAbs que reconocen epítopos sensibles a la neutralización en las proteínas de la envoltura que se muestran en la superficie de las VLP como proteínas de cebo. La aplicación exitosa de este ensayo de captura de VLP facilita la predicción de si las VLP positivas para antígenos probados podrán provocar una respuesta neutralizante de células B en personas vacunadas. Tales propiedades inmunogénicas de las vacunas candidatas basadas en VLP se demuestran con frecuencia en modelos de animales pequeños20,21,22.

Con el fin de evaluar la calidad de la vacuna candidata VLP recientemente desarrollada, se han utilizado con éxito ensayos de captura de VLP5,23,24. Sin embargo, el número de métodos publicados es limitado. El ensayo de captura de VLP presentado aquí comienza con la inmovilización de bNAbs específicos de Env en perlas conjugadas con proteína G, que se unen a la región Fc de anticuerpos derivados de mamíferos. Las matrices típicas para la inmovilización del anticuerpo de elección son la agarosa o las perlas magnéticas. Sin embargo, las perlas magnéticas son favorables para aplicaciones de alto ^{rendimiento25}. En el siguiente paso, las VLP que muestran el antígeno objetivo son capturadas por perlas recubiertas de bNAb. Los complejos inmunes formados que consisten en VLP env-positivos y bNAbs inmovilizados se enriquecen fácilmente con un imán. Los complejos inmunes aislados se eluyen en el paso final. Posteriormente, las VLP pueden ser caracterizadas bioquímicamente. Aquí, realizamos un análisis de Western blot empleando anticuerpos específicos de la proteína del núcleo viral p55 Gag para demostrar que los antígenos Env objetivo precipitados no solo albergaban los epítopos sensibles a la neutralización, sino que también se mostraban en VLP formados por Gag. Además, la detección de las proteínas Gag del núcleo viral aumenta la sensibilidad del ensayo de captura ya que las proteínas Gag son más abundantes que Env en un VLP. En el VIH-1, las proteínas Env solo están presentes en un número de uno o dos ^dígitos26, mientras que más de 3.500 moléculas de Gag forman el núcleo de una ^partícula27.

En comparación con otras técnicas para el examen de las interacciones proteína-proteína28,29, el ensayo de captura de VLP proporciona un método alternativo para los laboratorios de investigación que no tienen acceso a costosos instrumentos analíticos. Por ejemplo, el análisis microscópico electrónico de transmisión (TEM), la espectroscopia de resonancia de plasmón de superficie (SPR) y el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) pueden ser costosos. El ensayo de captura presentado aquí también permite la sujeción posterior de muestras de VLP positivas para antígenos capturados para una mayor caracterización de proteínas, por ejemplo, empleando electroforesis en gel, inmunoblotting, microscopía electrónica y espectrometría de masas (MS), respectivamente. Teniendo en cuenta que la estructura nativa del antígeno objetivo se conserva durante el ensayo de captura de VLP, también se puede utilizar el rendimiento de un PAGE nativo y las técnicas de inmunoblotting posteriores.

El ensayo de captura de VLP representa un método fácil de usar y sensible para examinar la decoración de VLP con antígenos objetivo que exponen epítopos sensibles a la neutralización y, por lo tanto, su utilidad como futuros candidatos a vacunas.

Protocol

1. Preparación de la muestra Sembrar las líneas celulares de suspensión productoras de VLP derivadas de células 293-F que expresan genes estructurales del VIH gag solos o en concierto con env 30 a una baja densidad celular de 0.5 x 106 células por ml en el medio de expresión 293-F. Deje que se expandan durante 3-4 días a 37 °C y 8% de CO2 en una rotación de incubadora agitadora con una órbita de 5 cm y 135 rondas por minuto (rpm). Pellet de las células productoras por centrifugación a 100 x g durante 5 min. Filtre el sobrenadante clarificado para eliminar las células residuales y los desechos celulares utilizando filtros de jeringa de membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de 0,45 μm para obtener sobrenadante de cultivo celular libre de células (CFSN).NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. CFSN se puede almacenar durante la noche a 4 °C. Utilice el CFSN directamente para el experimento o glp de pellets de 35 ml de CFSN empleando ultracentrifugación (112,700 x g, 4 ° C, 1.5 h). Tras la ultracentrifugación, deseche el sobrenadante y suspenda los gránulos de VLP en 200 μL de solución de trehalosa al 15% (p/v) por tubo de centrífuga.NOTA: El gránulo VLP a menudo no es visible a simple vista. El protocolo se puede pausar aquí. Las VLP se pueden almacenar a -80 °C. Antes del ensayo de captura de VLP, determine las concentraciones de proteínas del núcleo viral en las muestras que contienen VLP utilizando un ELISA. Este paso es importante para estandarizar la entrada del ensayo de captura. 2. Ensayo de captura VLP Nota : una descripción general del flujo de trabajo se muestra en la figura 2. Suspenda las perlas magnéticas mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo o mezclando en un rotador a 50 rpm durante al menos 5 minutos. Mientras tanto, prepare la solución de anticuerpos que contiene los bNAbs. Utilice 10 μg de cada bNAb en 200 μL de tampón de unión y lavado de anticuerpos (ver Tabla de Materiales) por reacción.NOTA: Las cantidades de anticuerpos pueden variar dependiendo de la afinidad del bNAb y la densidad de decoración del antígeno en las VLP utilizadas. Utilice 50 μL de la solución de perla magnética (ver Tabla de Materiales) por reacción y transfiera las perlas a un tubo de reacción de 1,5 mL. Coloque los tubos en el bastidor de separación magnética.NOTA: Alternativamente, se puede usar un solo imán fuerte para cada tubo para separar las cuentas del sobrenadante. Espere unos minutos hasta que las cuentas se reúnan en la pared del tubo para asegurarse de que todas las cuentas se recojan. Retire el sobrenadante. Retire el imán y suspenda las perlas en 200 μL de la solución de bNAb preparada en el paso 2.2. Incubar durante 30 min a 3 h mezclando en un rotador a 50 rpm a temperatura ambiente. Coloque los tubos de reacción en el bastidor de separación magnética nuevamente, espere y retire el sobrenadante. Retire los tubos del imán y lave las perlas resuspiendo en 200 μL de unión de anticuerpos y tampón de lavado. Repita el paso 2.4. Retire la mayor cantidad posible de tampón de lavado. Agregue las muestras a los bNAbs enlazados a cuentas.NOTA: La entrada de VLP para el ensayo de captura utilizando partículas derivadas del VIH debe ser de al menos 15 ng de proteína del núcleo viral por reacción. Las cantidades de VLP pueden variar dependiendo de la afinidad del bNAb y la densidad de decoración de antígenos en las VLP utilizadas. Si el volumen de muestra agregado en el paso 2.9 es inferior a 1 ml, agregue PBS para ajustar el volumen de muestra a 1 ml. Suspenda las cuentas suavemente mediante pipeteo. Incubar las muestras y las perlas durante 2,5 h en un rotador a temperatura ambiente. Asegúrese de que las perlas permanezcan en suspensión y que la solución se mezcle bien durante la incubación. Coloque los tubos en el imán y retire el sobrenadante. Lave las perlas magnéticas suspendiéndolas en 200 μL de tampón de lavado (ver Tabla de Materiales). Repita el paso de lavado tres veces. Suspenda las perlas en 100 μL de tampón de lavado y transfiera la suspensión a un tubo de reacción limpio (resistente al calor). Coloque el tubo en el bastidor de separación magnética (consulte la Tabla de materiales) y retire el sobrenadante por completo. Prepare muestras SDS-PAGE desnaturalizadas siguiendo los pasos 2.16.1-2.16.2 o muestras no desnaturalizadas eluyendo las VLP de las perlas magnéticas siguiendo los pasos 2.16.3-2.16.5. Para preparar muestras SDS-PAGE desnaturalizadas, suspenda las perlas en 20-80 μL de tampón Laemmli (0,8 μL de tampón Laemmli por 1 ng de entrada de ensayo p55 Gag) e incube a 95 °C durante 5 min. Proceda directamente con SDS-PAGE o almacene las muestras a -20 °C.PRECAUCIÓN: El tampón Laemmli contiene 2-mercaptoetanol y dodecil sulfato de sodio. Use guantes protectores y protección ocular. Evite el contacto con la piel, los ojos y la ropa. No inhale vapores. Trabaje en un espacio bien ventilado, por ejemplo, una campana extractora de humos.NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Alternativamente, realice un paso de elución no desnaturalizante para obtener VLP con estructura de proteína nativa preservada. Agregue 25 μL de tampón de elución (frecuentemente provisto con las perlas) a las cuentas magnéticas e incube durante 2-5 min a temperatura ambiente. Retire las perlas y transfiera el eluido a un tubo limpio. Utilice el eluido para ensayos posteriores o guárdelo a 4 °C.NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. 3. Análisis de muestras VLP capturadas NOTA: Para el análisis de los VLP capturados, realice un SDS-PAGE y posteriormente un análisis de Western blot31,32. Coloque los tubos de muestra en el bastidor magnético para separar las perlas de la solución. Cargue 10 μL de cada muestra en pocillos individuales del gel.NOTA: En este protocolo, las proteínas virales p55 Gag core se detectaron mediante el empleo de anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra HIV Gag y igG secundaria de pollo policlonal anti-conejo acoplada a anticuerpos de peroxidasa de rábano picante (HRP). Las proteínas del núcleo viral se visualizaron mediante la detección de quimioluminiscencia. Figura 2: Ilustración esquemática de los pasos clave del ensayo de captura VLP utilizando sobrenadantes libres de células. (1) El ensayo de captura de VLP comienza con la unión de los bNAbs del VIH-1 a las perlas magnéticas acopladas a proteína g. Mientras tanto, se prepara la solución VLP con una concentración definida de p55. El sobrenadante de cultivo libre de células consiste en una mezcla de VLP gag p55, proteínas de la célula huésped y ácidos nucleicos. (2) Las perlas magnéticas acopladas a bNAbs y la solución VLP se transfieren a un tubo de reacción de 1,5 ml seguido de incubación en rotación. (3) Las VLP que muestran antígenos son capturadas por las cuentas recubiertas de bNAbs. La separación de estos complejos inmunes de los contaminantes derivados de la célula huésped se realiza en un campo magnético. (4) El sobrenadante se elimina mediante pipeteo, y las perlas se lavan tres veces para eliminar las VLP no unidas. (5) En el siguiente paso, se agrega un tampón de carga de proteínas reductora a los complejos inmunes que consisten en perlas magnéticas recubiertas con bNAbs y VLP capturadas. (6) La ebullición de la muestra disocia los bNAbs y el antígeno objetivo de las perlas magnéticas y la lisis de las VLP. (7) Las perlas magnéticas se separan de la solución en un campo magnético. (8) Las muestras de proteínas se someten a SDS-PAGE. (9) El análisis de Western blot se realiza para detectar proteínas virales del núcleo de Gag p55. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Representative Results

La Figura 3 muestra un resultado representativo de las VLP capturadas por primera vez a partir de gránulos CFSN y VLP, respectivamente, utilizando bNAbs y posteriormente sometidas a análisis de Western blot para detectar proteínas del núcleo viral. Las perlas utilizadas para el ensayo de captura fueron recubiertas con tres bNAbs diferentes dirigidos contra epítopos sensibles a la neutralización de las glicoproteínas Env y anticuerpos isotipo que sirven como controles negativos, respectivamente. Utilizando perlas recubiertas de anticuerpos de isotipo, no se detectaron proteínas Gag en muestras que contenían VLP env-negativas (VLP calvas) o VLP que muestran Env empleando el análisis de Western blot. Esto demostró que la unión inespecífica de VLP a cuentas recubiertas con anticuerpos humanos no mediaba la captura de VLP. Las VLP calvas tampoco estaban unidas por cuentas recubiertas de bNAbs y, en consecuencia, nuevamente, no se detectaron proteínas Gag. En contraste, los tres bNAb capturaron VLP que mostraban proteínas Env (Env VLP) y, por lo tanto, las proteínas Gag se detectaron posteriormente fácilmente. Como se ve en la Figura 3, el ensayo de captura se puede utilizar para analizar el antígeno objetivo que muestra VLP en muestras CFSN y VLP granuladas, respectivamente. Figura 3: Detección de epítopos sensibles a la neutralización en glicoproteínas de la envoltura del VIH-1 que se muestran en VLP formadas por Gag p55 utilizando anticuerpos ampliamente neutralizantes. Resultados representativos del análisis de Western blot utilizando anticuerpos virales específicos de la proteína Gag core después de realizar un ensayo de captura de VLP que emplea tres anticuerpos diferentes ampliamente neutralizantes (bNAb 1, bNAb 2 y bnAb 3) dirigidos a epítopos dentro de las glicoproteínas de la envoltura del VIH-1 (Env). Los anticuerpos humanos de isotipo agrupados a partir de sueros humanos sirvieron como controles negativos. Los sobrenadantes de cultivo celular se recolectaron de cultivos celulares en suspensión que producían VLP con proteínas Env (VLP Env) y VLP calvas (Env-negativos), respectivamente, así como de células naïve que no expresaban ninguna proteína viral (simulacro). Tanto los sobrenadantes del cultivo celular productor de VLP calvo como del cultivo celular simulado sirvieron como controles negativos. Los sobrenadantes se liberaron de las células contaminantes mediante centrifugación de baja velocidad y posterior filtración para obtener sobrenadantes libres de células (CFSN) para el análisis. Tras la inmunoprecipitación, se realizó un análisis de Western blot utilizando anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra Gag y conjugados secundarios anti-conejo IgG-HRP. El peso molecular aparente en kilodaltons (kDa) como visible desde el marcador de peso molecular (MW) se representa a la izquierda. Las flechas indican la proteína precursora detectada p55 Gag. (A) Para cada muestra, se aplicó CFSN que contenía 100 ng de proteína Gag al ensayo de captura para estandarizar la cantidad de entrada de VLP. CFSN se incubó directamente con perlas recubiertas de anticuerpos. (B) Los gránulos de VLP se obtuvieron por ultracentrifugación de CFSN. Se aplicaron gránulos que contenían 100 ng de proteína Gag al ensayo de captura utilizando anticuerpos isotipo y bNAb 3. Las muestras de bNAb 1 y bNAb 2 contenían sólo 25 ng de Gag. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Antes del ensayo de captura de VLP, evalúe la formación de VLP y la expresión del antígeno objetivo en las líneas celulares productoras de VLP. Los métodos instrumentales son el análisis citométrico de flujo de la expresión de la superficie celular del antígeno, así como el ELISA específico del antígeno y la proteína del núcleo viral de CFSN y VLP granuladas.

Los pasos críticos del ensayo de captura de VLP son el recubrimiento de las perlas con anticuerpos de captura, aquí bNAbs, y la posterior captura de las VLP positivas para antígenos por las perlas recubiertas de anticuerpos. El recubrimiento exitoso de las perlas con anticuerpos depende de la elección de la proteína de unión a inmunoglobulina (Ig) conjugada. Las especies donantes, así como la clase Ig de los anticuerpos, determinan si las perlas conjugadas con proteína G o proteína A son preferibles. Para la mayoría de las especies y clases de Ig, la proteína G es el ligando de ^elección33. Como alternativa a las perlas conjugadas con proteína A/G, están disponibles perlas de estreptavidina para el recubrimiento con anticuerpos biotinilados. Las perlas también se pueden acoplar covalentemente con anticuerpos.

La captura de las VLP por perlas recubiertas de anticuerpos depende de una mezcla exhaustiva, un tiempo de incubación suficiente, la abundancia de antígenos y la afinidad del anticuerpo de captura. En nuestra experiencia, la mezcla exhaustiva de las perlas recubiertas de anticuerpos con las muestras de VLP se logra mejor mediante la utilización de volúmenes >500 μL en tubos de 1,5 ml en rotación durante al menos 2 h a temperatura ambiente o 4 ° C. Otro obstáculo potencial es la cantidad demasiado baja de VLP en la muestra. Para los anticuerpos que se unen fuertemente al antígeno objetivo, las entradas de VLP tan bajas como 15 ng de proteína Gag generalmente permiten cantidades fácilmente detectables de las proteínas del núcleo viral utilizando el análisis de Western blot. Sin embargo, los anticuerpos de baja afinidad requieren mayores cantidades de entrada, por ejemplo, 100 ng de proteína Gag, para obtener resultados concluyentes (Figura 3, bNAb 3).

Algunos antígenos de superficie son propensos a la degradación de la proteasa. Aquí, recomendamos la adición de inhibidores de la proteasa a las muestras de VLP y la incubación a 4 °C. La adhesión inespecífica de las proteínas de la célula huésped y las VLP a los anticuerpos unidos a la perla rara vez se observa y debe excluirse mediante la utilización de controles negativos apropiados, como demostramos aquí utilizando muestras de VLP simuladas y calvas y anticuerpos de control de isotipos. Las estrategias para reducir la unión inespecífica incluyen pasos de lavado prolongados y la adición de caseína en el tampón de ^lavado34. Además, el ensayo de captura también puede mejorarse determinando la proporción óptima de anticuerpos a la cantidad de VLP que muestra el antígeno.

En el último paso del ensayo de captura de VLP, describimos la elución de los complejos inmunes de las perlas por ebullición en la reducción del tampón de Laemmli. Durante este paso, las VLP se desmontan y los anticuerpos de captura y los antígenos diana se separan de las perlas. En particular, la especie donante del anticuerpo primario utilizado en el posterior análisis de Western blot tiene que diferir del donante del anticuerpo de captura para evitar la detección no intencionada del anticuerpo de captura por los anticuerpos conjugados secundarios igG HRP antidonante.

El ensayo de captura de VLP presentado aquí proporciona un método fácil de usar y sensible para detectar epítopos sensibles a la neutralización en antígenos objetivo estructurales intactos que se muestran en las superficies de VLP. Sin embargo, el ensayo de captura no permite la cuantificación directa del epítopo. Los ELISA realizados con bNAbs son fundamentales para este fin y deben realizarse en paralelo, especialmente si las VLP examinadas están destinadas a ser utilizadas en estudios preclínicos que emplean modelos ^animales35. Esto es fundamental, ya que la cantidad de antígeno puede correlacionarse directamente con la elicitación de una respuesta de anticuerpos neutralizantes en animales inmunizados, como se muestra para las vacunas contra circovirus porcinos tipo 2 (PCV2)³⁶.

Una vacuna ideal debe resultar en la elicitación de bNAbs dirigidos a los epítopos sensibles a la neutralización en la superficie del virión. El análisis de estos epítopos, especialmente en referencia a su plena integridad estructural en la superficie de la vacuna particulada, es crucial para identificar posibles candidatos a vacunas. Este no es solo el caso de las VLP derivadas del VIH, sino también de muchas otras vacunas VLP en ^desarrollo37. Las vacunas prominentes basadas en VLP son, por ejemplo, derivadas de virus parentales no envueltos o en cápside, como el virus del papiloma humano (VPH). A diferencia de las partículas del VIH-1, que están formadas por una sola proteína estructural del núcleo, a saber, p55 Gag, y envueltas por la membrana que se origina en la célula productora de VLP, las partículas del VPH consisten en solo una o dos proteínas estructurales del ^núcleo38,39. Del mismo modo, y como se presenta aquí para VLP envueltos, el ensayo de captura VLP también puede ser aplicable a la detección de epítopos sensibles a la neutralización de VLP no envueltos.

Como alternativa al ensayo de captura, las muestras de VLP se pueden someter directamente a PAGE nativo seguido de un análisis de Western blot utilizando bNAbs y anticuerpos secundarios apropiados acoplados a ^HRP40. Sin embargo, y para el análisis de VLP decoradas con VIH Env, este ensayo es menos sensible ya que solo se puede esperar un bajo número de proteínas de antígeno por VLP. Por el contrario, el ensayo de captura facilita la detección de las proteínas centrales abundantes en grandes cantidades por VLP, en el caso de las VLP derivadas del VIH más de 3.500 proteínas Gag forman un ^VLP27. Esto permite la detección indirecta muy sensible de epítopos en Env que se muestran incluso a bajas densidades en VLP.

El número de métodos bien establecidos para examinar los epítopos sensibles a la neutralización en los antígenos de superficie de las VLP es limitado. El etiquetado de los antígenos mostrados en las VLP es posible con conjugados anticuerpo-fluoróforo específicos del epítopo y la posterior detección mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), lo que permite la detección y cuantificación de VLP. Este método también ha sido desarrollado y optimizado con éxito para exosomas que presentan marcadores de superficie ^celular41. Además, la espectroscopia de resonancia de plasmón de superficie (SPR) permite el análisis de las interacciones entre los anticuerpos neutralizantes no conjugados y los epítopos afines presentados en las VLP. Aunque no es adecuado para análisis de mayor rendimiento, las VLP también se pueden etiquetar con bNAbs acoplados a partículas de oro y posterior transmisión electrónica microscópica (TEM)-^examen42.

En conclusión, el ensayo de captura de VLP proporciona algunas ventajas considerables: (i) Evaluación de la integridad estructural de epítopos sensibles a la neutralización en la superficie de VLP, (ii) detección sensible e indirecta de antígenos incluso cuando se muestran a bajas densidades en VLP, y (iii) el método no requiere equipos analíticos costosos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por una subvención del Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación, programa de financiación Forschung an Fachhochschulen, números de contrato 13FH767IA6 y 13FH242PX6 a JS. Las figuras 1 y 2 se crearon con BioRender.com.

Materials

1.5 mL reaction tubes	Eppendorf
10x PBS	gibco	70011044
4%–15% Mini-PROTEAN TGX stain-free protein gels	BioRad	4568085
Antibodies (bnAbs)	Polymun Scientic
Isotype control antibody	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	02-7102
Chemidoc XRS+ imaging system	BioRad	1708265
Chicken anti-rabbit IgG HRP-coupled	Life technologies	A15987	1:5000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk
Dynabeads Protein G Immunoprecipitation Kit	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	10007D	includes buffers and washing solutions
FreeStyle 293-F cells	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	R790-07
FreeStyle 293 Expression Medium	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	12338026
Gel blotting papers	Whatman	GB005
Glycine	Carl Roth	0079	blotting buffer
Magnetic separation rack	New England Biolabs	S1509S	for 12 x 1.5 mL or 6 x 1.5 mL tubes
Methanol	Carl Roth	4627	blotting buffer
Mini-PROTEAN Tetra Cell electrophoresis system	BioRad
Optima XE-90 ultracentrifuge	Beckman Coulter
PageRuler prestained protein ladder	Thermo Scientific	26616
Polyvinylidene fluoride (PVDF) syringe filters, 0.45 µm	Carl Roth	KC89.1
Powdered milk	Carl Roth	T145	blocking buffer
PVDF transfermembrane, 0.45 µm	Carl Roth	T830.1
QuickTiter HIV p24 ELISA	Cell Biolabs	VPK-108-H
Rabbit polyclonal to HIV1 p55 + p24 + p17	abcam	ab63917	1:2000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk
Rotator	Heidolph	REAX2
ROTI Load 1 (laemmli buffer)	Carl Roth	K929.1	4x concentrated reducing protein gel loading buffer
ROTIPHORESE 10x SDS-PAGE	Carl Roth	3060
Sodium chloride	Carl Roth	3957	TBS-T buffer
SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate	Thermo Scientific	34579
SW28 rotor	Beckman Coulter
Thermomixer	Cel Media	basic
Trans-Blot Turbo	BioRad
Trehalose dihydrate	Carl Roth	8897.2
TRIS	Carl Roth	5429	blotting buffer
TRIS hydrochloride	Carl Roth	9090	TBS-T buffer
Tween-20	Carl Roth	9127	TBS-T buffer
Ultra Clear centrifuge tubes	Beckman Coulter	344058

References

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Rosengarten, J. F., Schatz, S., Stitz, J. Detection of Neutralization-sensitive Epitopes in Antigens Displayed on Virus-Like Particle (VLP)-Based Vaccines Using a Capture Assay. J. Vis. Exp. (180), e63137, doi:10.3791/63137 (2022).

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