Qui, presentiamo un protocollo per rilevare epitopi di neutralizzazione su particelle simili a virus che visualizzano l’antigene (VLP). L’immunoprecipitazione dei VLP derivati dal virus dell’immunodeficienza umana (HIV) viene eseguita utilizzando anticorpi monoclonali specifici della glicoproteina dell’involucro accoppiati a perle magnetiche coniugate con proteina G. I VLP catturati vengono successivamente sottoposti all’analisi SDS-PAGE e Western blot utilizzando anticorpi specifici della proteina virale Gag.
Il test di cattura delle particelle simili al virus (VLP) è un metodo di immunoprecipitazione, comunemente noto come “test pull-down” utilizzato per purificare e isolare VLP che mostrano l’antigene. Gli anticorpi antigene-specifici di superficie sono accoppiati e quindi immobilizzati su una matrice solida e insolubile come le perline. A causa della loro elevata affinità con l’antigene bersaglio, questi anticorpi possono catturare VLP decorati con l’antigene affine ancorato nell’involucro di membrana dei VLP. Questo protocollo descrive il legame degli anticorpi antigene-specifici alle perle magnetiche coniugate con proteina A o G. Nel nostro studio, vengono esaminati i VLP derivati dal virus dell’immunodeficienza umana (HIV) formati dalla proteina precursore del nucleo virale dell’antigene specifico del gruppo (Gag) p55 Gag e che mostrano la glicoproteina dell’involucro (Env) dell’HIV. I VLP vengono catturati utilizzando anticorpi ampiamente neutralizzanti (bNAbs) diretti contro epitopi sensibili alla neutralizzazione in Env. Il test di cattura VLP qui delineato rappresenta un metodo sensibile e facile da eseguire per dimostrare che (i) i VLP sono decorati con il rispettivo antigene bersaglio, (ii) l’antigene di superficie ha mantenuto la sua integrità strutturale come dimostrato dal legame epitopo-specifico di bNAbs utilizzato nel test e (iii) l’integrità strutturale dei VLP rivelata dal rilevamento delle proteine Gag in una successiva analisi Western blot. Di conseguenza, l’utilizzo di bNAbs per l’immunoprecipitazione facilita una previsione se i vaccini VLP saranno in grado di suscitare una risposta neutralizzante delle cellule B negli esseri umani vaccinati. Prevediamo che questo protocollo fornirà ad altri ricercatori un approccio sperimentale prezioso e diretto per esaminare potenziali vaccini basati su VLP.
Le particelle simili ai virus (VLP) assomigliano alla struttura delle particelle virali native pur mancando del genoma virale, fornendo così un elevato profilo di sicurezza1,2. I VLP rappresentano una classe individuale di vaccini sempre più sviluppati a causa della loro elevata immunogenicità3,4,5,6,7. Ciò è particolarmente vero per i VLP avvolti da membrana, che consentono la visualizzazione non solo di antigeni virali di superficie omologhi, ma anche di antigeni eterologhi come gli antigeni tumorali8,9,10. La Figura 1 fornisce una panoramica esemplare della struttura di un VLP rivestito con antigene avvolto. Durante il processo di sviluppo dei vaccini basati su VLP, i saggi sono indispensabili per consentire l’analisi del rispettivo antigene bersaglio visualizzato sulla superficie VLP. Tali saggi dovrebbero essere strumentali per chiarire la composizione di un vaccino contro il particolato: (i) I VLP sono decorati con il rispettivo antigene di superficie? (ii) L’antigene di superficie ha mantenuto la sua struttura nativa come dimostrato dal riconoscimento epitopico degli anticorpi neutralizzanti (bNAbs) e (iii) l’integrità strutturale dei VLP può essere confermata grazie all’individuazione della proteina virale che media la formazione di VLP?
Figura 1: Illustrazione schematica di un VLP avvolto da membrana. I VLP sono formati da proteine gag precursori immature e circondati da una membrana lipidica derivata dalla cellula ospite. Gli antigeni, ad esempio le glicoproteine dell’involucro, sono incorporati nella membrana lipidica e visualizzati sulla superficie del VLP (a destra). Gli anticorpi antigene-specifici riconoscono l’antigene. A sinistra, viene mostrato un VLP calvo senza decorazione antigenica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Soprattutto i VLP formati dalla proteina precursore del nucleo dell’antigene virale specifico (Gag) p55 del virus dell’immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) sono scaffold preferiti per la visualizzazione dell’antigene nello sviluppo del vaccino poiché sono disponibili numerosi anticorpi e kit ELISA, che consentono la quantificazione di questi VLP11,12. Le glicoproteine dell’involucro HIV-1 (Env), vale a dire la proteina transmembrana gp41 (gp41-TM) e l’unità di superficie solubile gp120 (gp120-SU) che formano eterodimeri, sono incorporate nell’involucro di membrana delle particelle e sono antigeni bersaglio cruciali per lo sviluppo di vaccini contro l’infezione da HIV13,14,15 . La visualizzazione di epitopi sensibili alla neutralizzazione in questi antigeni bersaglio è un prerequisito per suscitare una risposta anticorpale ampiamente neutralizzante nei vaccinati. Oltre a una risposta delle cellule T diretta contro le proteine Gag, questo è considerato un importante correlato di protezione contro l’infezione da HIV16. Di conseguenza, e al momento della progettazione e della produzione di VLP decorati con candidati antigeni bersaglio, la successiva analisi della qualità degli antigeni visualizzati rappresenta un passo critico nel processo di sviluppo del vaccino.
L’immunoprecipitazione (IP) è una tecnica ampiamente utilizzata per la rilevazione delle interazioni proteina-proteina e la purificazione di complessi proteici su piccola scala17. Barret et al. ha riferito per la prima volta sullo sviluppo della PI nel 1960, tuttavia, questo metodo è stato costantemente ulteriormente migliorato. L’IP consente la cattura e l’isolamento di un antigene bersaglio (preda) da una soluzione impiegando un anticorpo antigene-specifico (esca) immobilizzato mediante accoppiamento alle perline18,19. In questo protocollo, dimostriamo una variazione della classica applicazione IP utilizzando VLP formati da gag p55 avvolti a membrana come preda e bNAbs che riconoscono epitopi sensibili alla neutralizzazione nelle proteine dell’involucro visualizzate sulla superficie dei VLP come proteine esca. L’applicazione di successo di questo test di cattura VLP facilita la previsione se i VLP antigene positivi testati saranno in grado di suscitare una risposta neutralizzante delle cellule B nelle persone vaccinate. Tali proprietà immunogeniche dei candidati vaccini a base di VLP sono spesso dimostrate in modelli di piccoli animali20,21,22.
Al fine di valutare la qualità del candidato vaccino VLP di nuova concezione, sono stati utilizzati con successo i test di cattura VLP5,23,24. Tuttavia, il numero di metodi pubblicati è limitato. Il test di cattura VLP qui presentato inizia con l’immobilizzazione di bNAbs env-specifici su perline coniugate con proteina G, che si legano alla regione Fc degli anticorpi derivati dai mammiferi. Le matrici tipiche per l’immobilizzazione dell’anticorpo di scelta sono agarosio o perline magnetiche. Tuttavia, le perle magnetiche sono favorevoli per applicazioni ad alta produttività25. Nella fase successiva, i VLP che mostrano l’antigene bersaglio vengono catturati da perline rivestite di bNAb. I complessi immunitari formati costituiti da VLP Env-positivi e bNAb immobilizzati sono facilmente arricchiti utilizzando un magnete. Gli immunocomplessi isolati vengono eluiti nella fase finale. Successivamente, i VLP possono essere caratterizzati biochimicamente. Qui, abbiamo eseguito l’analisi Western blot impiegando anticorpi specifici della proteina del nucleo virale p55 Gag per dimostrare che gli antigeni Env bersaglio precipitati non solo ospitavano gli epitopi sensibili alla neutralizzazione, ma venivano anche visualizzati su VLP formati da Gag. Inoltre, il rilevamento delle proteine Gag del nucleo virale aumenta la sensibilità del test di cattura poiché le proteine Gag sono più abbondanti di Env in un VLP. Nell’HIV-1, le proteine Env sono presenti solo a una o due cifre26, mentre più di 3.500 molecole Gag formano il nucleo di una particella27.
Rispetto ad altre tecniche per l’esame delle interazioni proteina-proteina28,29, il saggio di cattura VLP fornisce un metodo alternativo per i laboratori di ricerca che non hanno accesso a costosi strumenti analitici. Ad esempio, l’analisi al microscopio elettronico a trasmissione (TEM), la spettroscopia di risonanza plasmonica di superficie (SPR) e l’analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) possono essere costose. Il test di cattura qui presentato consente anche di sottoporre successivamente campioni VLP antigene-positivi catturati a un’ulteriore caratterizzazione proteica, ad esempio impiegando rispettivamente elettroforesi su gel, immunoblotting, microscopia elettronica e spettrometria di massa (MS). Considerando che la struttura nativa dell’antigene bersaglio viene preservata durante il test di cattura VLP, è possibile utilizzare anche le prestazioni di una PAGE nativa e le successive tecniche di immunoblotting.
Il test di cattura VLP rappresenta un metodo facile da usare e sensibile per esaminare la decorazione di VLP con antigeni bersaglio che espongono epitopi sensibili alla neutralizzazione e quindi la loro utilità come futuri candidati vaccini.
Prima del test di cattura VLP, valutare la formazione di VLP e l’espressione dell’antigene bersaglio nelle linee cellulari produttrici di VLP. I metodi strumentali sono l’analisi citometrica a flusso dell’espressione della superficie cellulare dell’antigene e l’ELISA antigene e virale specifico della proteina core di CFSN e VLP pellettati.
Le fasi critiche del test di cattura VLP sono il rivestimento delle perline con anticorpi di cattura – qui bNAbs – e la successiva cattura dei VLP antigene-positivi da parte delle perle rivestite di anticorpi. Il successo del rivestimento delle perline con anticorpi dipende dalla scelta della proteina legante le immunoglobuline coniugate (Ig). Le specie donatrici e la classe Ig degli anticorpi determinano se le perle coniugate con proteina G o proteina A sono preferibili. Per la maggior parte delle specie e delle classi di Ig, la proteina G è il ligando di scelta33. In alternativa alle perle coniugate A/G proteiche, sono disponibili perline di streptavidina per il rivestimento con anticorpi biotinilati. Le perline possono anche essere accoppiate covalentemente con anticorpi.
La cattura dei VLP da parte di perline rivestite di anticorpi dipende da una miscelazione accurata, da un tempo di incubazione sufficiente, dall’abbondanza di antigene e dall’affinità dell’anticorpo di cattura. Nella nostra esperienza, la miscelazione accurata delle perle rivestite di anticorpi con i campioni VLP si ottiene al meglio utilizzando volumi > 500 μL in tubi da 1,5 mL in rotazione per almeno 2 ore a temperatura ambiente o 4 °C. Un altro potenziale ostacolo è la quantità troppo bassa di VLP nel campione. Per gli anticorpi che legano fortemente l’antigene bersaglio, gli input VLP a partire da 15 ng di proteina Gag di solito consentono quantità prontamente rilevabili delle proteine del nucleo virale utilizzando l’analisi Western blot. Tuttavia, gli anticorpi a bassa affinità richiedono quantità di input più elevate, ad esempio 100 ng di proteina Gag, per ottenere risultati conclusivi (Figura 3, bNAb 3).
Alcuni antigeni di superficie sono soggetti a degradazione della proteasi. Qui, raccomandiamo l’aggiunta di inibitori della proteasi ai campioni VLP e l’incubazione a 4 °C. L’adesione non specifica delle proteine delle cellule ospiti e dei VLP agli anticorpi legati alle perline è raramente osservata e dovrebbe essere esclusa utilizzando appropriati controlli negativi, come abbiamo dimostrato qui utilizzando campioni VLP finti e calvi e anticorpi di controllo dell’isotipo. Le strategie per ridurre la rilegatura non specifica includono fasi di lavaggio estese e l’aggiunta di caseina nel tampone di lavaggio34. Inoltre, il test di cattura può anche essere migliorato determinando il rapporto ottimale tra anticorpo e quantità di VLP che mostra l’antigene.
Nell’ultima fase del test di cattura VLP, descriviamo l’eluizione dei complessi immunitari dalle perline mediante ebollizione nel ridurre il tampone di Laemmli. Durante questa fase, i VLP vengono smontati e gli anticorpi di cattura e gli antigeni bersaglio vengono separati dalle perline. In particolare, la specie donatrice dell’anticorpo primario utilizzato nella successiva analisi Western blot deve differire dal donatore dell’anticorpo di cattura per evitare il rilevamento involontario dell’anticorpo di cattura da parte degli anticorpi coniugati secondari IgG HRP anti-donatore.
Il test di cattura VLP qui presentato fornisce un metodo facile da usare e sensibile per rilevare epitopi sensibili alla neutralizzazione in antigeni bersaglio strutturali intatti visualizzati su superfici VLP. Tuttavia, il test di cattura non consente la quantificazione diretta dell’epitopo. Gli ELISA eseguiti con bNAbs sono strumentali a tale scopo e dovrebbero essere condotti in parallelo, in particolare se i VLP esaminati sono destinati ad essere utilizzati in studi preclinici che impiegano modelli animali35. Questo è fondamentale, in quanto la quantità di antigene può essere direttamente correlata con l’elicitazione di una risposta anticorpale neutralizzante negli animali immunizzati, come dimostrato per i vaccini contro il circovirus suino di tipo 2 (PCV2)36.
Un vaccino ideale dovrebbe portare all’elicitazione di bNAbs mirati agli epitopi sensibili alla neutralizzazione sulla superficie del virione. L’analisi di questi epitopi, in particolare per quanto riguarda la loro piena integrità strutturale sulla superficie del vaccino contro il particolato, è fondamentale per identificare potenziali candidati vaccini. Questo non è solo il caso dei VLP derivati dall’HIV, ma anche di molti altri vaccini VLP in fase di sviluppo37. Importanti vaccini basati su VLP sono, ad esempio, derivati da virus parentali non avvolti o capside come il papillomavirus umano (HPV). A differenza delle particelle di HIV-1, che sono formate da una sola proteina core strutturale, vale a dire p55 Gag, e avvolte dalla membrana proveniente dalla cellula produttrice di VLP, le particelle di HPV sono costituite da una o due proteine del nucleo strutturale38,39. Allo stesso modo e come presentato qui per i VLP avvolti, il test di cattura VLP può anche essere applicabile al rilevamento di epitopi sensibili alla neutralizzazione di VLP non avvolti.
In alternativa al test di cattura, i campioni VLP possono essere sottoposti direttamente a PAGE nativo seguito da analisi Western blot utilizzando bNAbs e anticorpi secondari appropriati accoppiati a HRP40. Tuttavia, e per l’analisi dei VLP decorati con HIV Env, questo test è meno sensibile in quanto ci si può aspettare solo un basso numero di proteine antigeniche per VLP. Al contrario, il test di cattura facilita il rilevamento delle proteine core abbondanti a grandi quantità per VLP, nel caso di VLP derivate dall’HIV più di 3.500 proteine Gag formano un VLP27. Ciò consente il rilevamento indiretto molto sensibile degli epitopi in Env visualizzati anche a basse densità sui VLP.
Il numero di metodi consolidati per esaminare gli epitopi sensibili alla neutralizzazione negli antigeni di superficie delle VLP è limitato. L’etichettatura degli antigeni visualizzati sui VLP è possibile con coniugati anticorpo-fluoroforo epitopo-specifici e la successiva rilevazione mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA), consentendo il rilevamento e la quantificazione dei VLP. Questo metodo è stato inoltre sviluppato e ottimizzato con successo per gli esosomi che presentano marcatori di superficie cellulare41. Inoltre, la spettroscopia di risonanza plasmonica di superficie (SPR) consente l’analisi delle interazioni tra anticorpi neutralizzanti non coniugati ed epitopi affini presentati su VLP. Sebbene non siano adatti per l’analisi a throughput più elevato, i VLP possono anche essere etichettati con bNAbs accoppiati a particelle d’oro e successivo esame al microscopio elettronico a trasmissione (TEM)42.
In conclusione, il saggio di cattura VLP offre alcuni vantaggi considerevoli: (i) valutazione dell’integrità strutturale degli epitopi sensibili alla neutralizzazione sulla superficie dei VLP, (ii) rilevamento sensibile e indiretto di antigeni anche se visualizzati a basse densità su VLP e (iii) il metodo non richiede apparecchiature analitiche costose.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del Ministero federale tedesco dell’Istruzione e della Ricerca, dal programma di finanziamento Forschung an Fachhochschulen, dai numeri di contratto 13FH767IA6 e 13FH242PX6 a JS. Le figure 1 e 2 sono state create con BioRender.com.
1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | ||
10x PBS | gibco | 70011044 | |
4%–15% Mini-PROTEAN TGX stain-free protein gels | BioRad | 4568085 | |
Antibodies (bnAbs) | Polymun Scientic | ||
Isotype control antibody | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 02-7102 | |
Chemidoc XRS+ imaging system | BioRad | 1708265 | |
Chicken anti-rabbit IgG HRP-coupled | Life technologies | A15987 | 1:5000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk |
Dynabeads Protein G Immunoprecipitation Kit | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 10007D | includes buffers and washing solutions |
FreeStyle 293-F cells | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | R790-07 | |
FreeStyle 293 Expression Medium | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 12338026 | |
Gel blotting papers | Whatman | GB005 | |
Glycine | Carl Roth | 0079 | blotting buffer |
Magnetic separation rack | New England Biolabs | S1509S | for 12 x 1.5 mL or 6 x 1.5 mL tubes |
Methanol | Carl Roth | 4627 | blotting buffer |
Mini-PROTEAN Tetra Cell electrophoresis system | BioRad | ||
Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
PageRuler prestained protein ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
Polyvinylidene fluoride (PVDF) syringe filters, 0.45 µm | Carl Roth | KC89.1 | |
Powdered milk | Carl Roth | T145 | blocking buffer |
PVDF transfermembrane, 0.45 µm | Carl Roth | T830.1 | |
QuickTiter HIV p24 ELISA | Cell Biolabs | VPK-108-H | |
Rabbit polyclonal to HIV1 p55 + p24 + p17 | abcam | ab63917 | 1:2000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk |
Rotator | Heidolph | REAX2 | |
ROTI Load 1 (laemmli buffer) | Carl Roth | K929.1 | 4x concentrated reducing protein gel loading buffer |
ROTIPHORESE 10x SDS-PAGE | Carl Roth | 3060 | |
Sodium chloride | Carl Roth | 3957 | TBS-T buffer |
SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34579 | |
SW28 rotor | Beckman Coulter | ||
Thermomixer | Cel Media | basic | |
Trans-Blot Turbo | BioRad | ||
Trehalose dihydrate | Carl Roth | 8897.2 | |
TRIS | Carl Roth | 5429 | blotting buffer |
TRIS hydrochloride | Carl Roth | 9090 | TBS-T buffer |
Tween-20 | Carl Roth | 9127 | TBS-T buffer |
Ultra Clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 |