Hier presenteren we een protocol om neutralisatie-epitopen te detecteren op antigeen-displaying virusachtige deeltjes (VLP’s). Immunoprecipitatie van het van het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) afgeleide VLP’s wordt uitgevoerd met behulp van envelop glycoproteïnen-specifieke monoklonale antilichamen gekoppeld aan eiwit G-geconjugeerde magnetische kralen. Gevangen VLP’s worden vervolgens onderworpen aan SDS-PAGE en Western blot-analyse met behulp van virale kerneiwit Gag-specifieke antilichamen.
De virusachtige deeltje (VLP) capture assay is een immunoprecipitatiemethode, algemeen bekend als een ‘pull-down assay’ die wordt gebruikt om antigeen-vertonende VLP’s te zuiveren en te isoleren. Oppervlakte-antigeenspecifieke antilichamen worden gekoppeld aan en dus geïmmobiliseerd op een vaste en onoplosbare matrix zoals kralen. Vanwege hun hoge affiniteit met het doelantigeen kunnen deze antilichamen VLP’s opvangen die zijn versierd met het verwante antigeen dat is verankerd in de membraanenvelop van de VLP’s. Dit protocol beschrijft de binding van antigeenspecifieke antilichamen aan eiwit A- of G-geconjugeerde magnetische kralen. In onze studie worden van het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) afgeleide VLP’s gevormd door het groepsspecifieke antigeen (Gag) virale kernprecursoreiwit p55 Gag en met de envelop glycoproteïnen (Env) van HIV onderzocht. De VLP’s worden gevangen met behulp van breed neutraliserende antilichamen (bNAbs) gericht tegen neutralisatiegevoelige epitopen in Env. De hier beschreven VLP-afvangtest vertegenwoordigt een gevoelige en gemakkelijk uit te voeren methode om aan te tonen dat (i) de VLP’s zijn versierd met het respectieve doelantigeen, (ii) het oppervlakteantigeen zijn structurele integriteit behield zoals aangetoond door de epitoopspecifieke binding van bNAbs die in de test werd gebruikt en (iii) de structurele integriteit van de VLP’s onthuld door de detectie van Gag-eiwitten in een daaropvolgende Western blot-analyse. Bijgevolg vergemakkelijkt het gebruik van bNAbs voor immunoprecipitatie een voorspelling of VLP-vaccins in staat zullen zijn om een neutraliserende B-celrespons op te wekken bij gevaccineerde mensen. We verwachten dat dit protocol andere onderzoekers een waardevolle en eenvoudige experimentele benadering zal bieden om potentiële op VLP gebaseerde vaccins te onderzoeken.
Virusachtige deeltjes (VLP’s) lijken op de inheemse virusdeeltjesstructuur terwijl ze het virale genoom missen, waardoor een hoog veiligheidsprofiel wordt geboden1,2. VLP’s vertegenwoordigen een individuele klasse van vaccins die in toenemende mate worden ontwikkeld vanwege hun hoge immunogeniciteit3,4,5,6,7. Dit is met name het geval voor membraanomhulde VLP’s, waardoor niet alleen homologe virale oppervlakte-antigenen kunnen worden weergegeven, maar ook heterologe antigenen zoals tumorantigenen8,9,10. Figuur 1 geeft een voorbeeldig overzicht van de structuur van een omhulde met antigeen versierde VLP. Tijdens het ontwikkelingsproces van op VLP gebaseerde vaccins zijn assays onmisbaar om de analyse van het respectieve doelantigeen op het VLP-oppervlak mogelijk te maken. Dergelijke testen moeten instrumenteel zijn om de samenstelling van een deeltjesvaccin op te helderen: (i) Zijn de VLP’s versierd met het respectieve oppervlakteantigeen? (ii) Heeft het oppervlakteantigeen zijn oorspronkelijke structuur behouden, zoals aangetoond door epitoopherkenning van neutraliserende antilichamen (bNAbs) en (iii) kan de structurele integriteit van de VLP’s worden bevestigd door de detectie van het virale eiwit dat VLP-vorming bemiddelt?
Figuur 1: Schematische illustratie van een VLP met membraanomhulde. VLP’s worden gevormd door onrijpe voorloper Gag-kerneiwitten en omgeven door een lipidemembraan afgeleid van de gastheercel. De antigenen, bijvoorbeeld envelop glycoproteïnen, worden opgenomen in het lipidemembraan en weergegeven op het oppervlak van de VLP (aan de rechterkant). Antigeenspecifieke antilichamen herkennen het antigeen. Links is een kale VLP zonder antigeenversiering te zien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Vooral VLP’s gevormd door het virale groepspecifieke antigeen (Gag) kernprecursoreiwit p55 van humaan immunodeficiëntievirus type 1 (HIV-1) zijn voorkeursteigers voor antigeenweergave bij vaccinontwikkeling, aangezien er tal van antilichamen en ELISA-kits beschikbaar zijn, waardoor de kwantificering van deze VLP’s11,12 mogelijk is. De HIV-1 envelop glycoproteïnen (Env), namelijk het transmembraaneiwit gp41 (gp41-TM) en de oplosbare oppervlakte-eenheid gp120 (gp120-SU) die heterodimeren vormen, zijn opgenomen in de membraanomhulling van deeltjes en zijn cruciale doelantigenen voor de ontwikkeling van vaccins tegen HIV-infectie13,14,15 . De weergave van neutralisatiegevoelige epitopen in deze doelantigenen is een voorwaarde voor het opwekken van een breed neutraliserende antilichaamrespons bij gevaccineerden. Naast een T-celrespons gericht tegen de Gag-eiwitten, wordt dit beschouwd als een belangrijke correlatie van bescherming tegen HIV-infectie16. Bijgevolg, en bij het ontwerp en de productie van VLP’s versierd met doelantigeenkandidaten, vormt de daaropvolgende analyse van de kwaliteit van de weergegeven antigenen een cruciale stap in het proces van vaccinontwikkeling.
Immunoprecipitatie (IP) is een veelgebruikte techniek voor de detectie van eiwit-eiwit interacties en de zuivering van eiwitcomplexen op kleine schaal17. Barret et al. voor het eerst gerapporteerd over de ontwikkeling van IP in 1960, maar deze methode is voortdurend verder verbeterd. IP maakt het mogelijk om een doelantigeen (prooi) uit een oplossing te vangen en te isoleren door gebruik te maken van een antigeenspecifiek antilichaam (lokaas) dat wordt geïmmobiliseerd door koppeling aan kralen18,19. In dit protocol demonstreren we een variatie op de klassieke IP-toepassing met behulp van membraan-omhulde p55 Gag-gevormde VLP’s als prooi en bNAbs die neutralisatiegevoelige epitopen herkennen in de envelopeiwitten die op het oppervlak van de VLP’s worden weergegeven als lokaaseiwitten. De succesvolle toepassing van deze VLP-capture-test vergemakkelijkt de voorspelling of de geteste antigeenpositieve VLP’s in staat zullen zijn om een neutraliserende B-celrespons bij gevaccineerde mensen uit te lokken. Dergelijke immunogene eigenschappen van op VLP gebaseerde vaccinkandidaten worden vaak aangetoond in kleine diermodellen20,21,22.
Om de kwaliteit van het nieuw ontwikkelde kandidaat-VLP-vaccin te beoordelen, zijn VLP-afvangtests met succes gebruikt5,23,24. Het aantal gepubliceerde methoden is echter beperkt. De hier gepresenteerde VLP-vangsttest begint met de immobilisatie van Env-specifieke bNAbs op eiwit G-geconjugeerde kralen, die binden aan het Fc-gebied van van zoogdier afgeleide antilichamen. Typische matrices voor de immobilisatie van het antilichaam naar keuze zijn agarose of magnetische kralen. Magnetische kralen zijn echter gunstig voor toepassingen met een hoge doorvoer25. In de volgende stap worden VLP’s die het doelantigeen weergeven, gevangen door bNAb-gecoate kralen. De gevormde immuuncomplexen bestaande uit Env-positieve VLP’s en geïmmobiliseerde bNAbs zijn eenvoudig te verrijken met behulp van een magneet. De geïsoleerde immuuncomplexen worden in de laatste stap geëlueerd. Vervolgens kunnen de VLP’s biochemisch worden gekarakteriseerd. Hier voerden we Western blot-analyse uit met behulp van p55 Gag virale kerneiwitspecifieke antilichamen om aan te tonen dat de neergeslagen doel-Env-antigenen niet alleen de neutralisatiegevoelige epitopen herbergden, maar ook werden weergegeven op Gag-gevormde VLP’s. Bovendien verhoogt de detectie van de virale kern Gag-eiwitten de gevoeligheid van de vangsttest, omdat Gag-eiwitten overvloediger zijn dan Env in een VLP. In HIV-1 zijn Env-eiwitten alleen aanwezig met een enkel- of dubbelcijferig getal26, terwijl meer dan 3.500 Gag-moleculen de kern van een deeltje vormen27.
Vergeleken met andere technieken voor het onderzoek van eiwit-eiwitinteracties28,29, biedt de VLP-afvangtest een alternatieve methode voor onderzoekslaboratoria die geen toegang hebben tot dure analytische instrumenten. Transmissie-elektronenmicroscopische analyse (TEM), oppervlakteplasmonresonantiespectroscopie (SPR) en nanodeeltjesvolgingsanalyse (NTA) kunnen bijvoorbeeld kostenintensief zijn. De hier gepresenteerde vangsttest maakt het ook mogelijk om later gevangen antigeenpositieve VLP-monsters te onderwerpen aan verdere eiwitkarakterisering, bijvoorbeeld met behulp van respectievelijk gel-elektroforese, immunoblotting, elektronenmicroscopie en massaspectrometrie (MS). Aangezien de native structuur van het doelantigeen behouden blijft tijdens de VLP-capture-test, kunnen ook de prestaties van een native PAGE en daaropvolgende immunoblotting-technieken worden gebruikt.
De VLP-vangsttest vertegenwoordigt een eenvoudig te gebruiken en gevoelige methode om de decoratie van VLP’s te onderzoeken met doelantigenen die neutralisatiegevoelige epitopen blootleggen, en dus hun nut als toekomstige vaccinkandidaten.
Evalueer voorafgaand aan de VLP-vangsttest de vorming van VLP’s en de expressie van het doelantigeen in de VLP-producentcellijnen. Instrumentele methoden zijn flowcytometrische analyse van de celoppervlakexpressie van het antigeen en antigeen- en virale kerneiwitspecifieke ELISA van CFSN en gepelleteerde VLP’s.
Kritische stappen van de VLP-vangsttest zijn het coaten van de kralen met vangantistoffen – hier bNAbs – en de daaropvolgende vangst van de antigeenpositieve VLP’s door de met antilichamen gecoate kralen. Succesvolle coating van de kralen met antilichamen hangt af van de keuze van het geconjugeerde immunoglobuline (Ig)-bindende eiwit. Zowel de donorsoort als de Ig-klasse van de antilichamen bepalen of eiwit G- of eiwit A-geconjugeerde kralen de voorkeur hebben. Voor de meeste soorten en Ig-klassen is eiwit G het ligand bij uitstek33. Als alternatief voor eiwit A/G-geconjugeerde kralen zijn streptavidin kralen voor de coating met gebiotinyleerde antilichamen beschikbaar. Kralen kunnen ook covalent gekoppeld zijn aan antilichamen.
De vangst van de VLP’s door met antilichamen gecoate kralen hangt af van grondige menging, voldoende incubatietijd, antigeenrijkdom en affiniteit van het vanvangantilichaam. In onze ervaring kan een grondige menging van de met antilichamen gecoate kralen met de VLP-monsters het beste worden bereikt door het gebruik van volumes >500 μL in buizen van 1,5 ml onder rotatie gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur of 4 °C. Een andere mogelijke hindernis is het te lage aantal VLP’s in de steekproef. Voor antilichamen die het doelantigeen sterk binden, zorgen VLP-inputs zo laag als 15 ng Gag-eiwit meestal voor gemakkelijk detecteerbare hoeveelheden van de virale kerneiwitten met behulp van Western blot-analyse. Antilichamen met een lage affiniteit vereisen echter hogere inputhoeveelheden, bijvoorbeeld 100 ng Gag-eiwit, om overtuigende resultaten te verkrijgen (figuur 3, bNAb 3).
Sommige oppervlakte-antigenen zijn gevoelig voor proteasedegradatie. Hier raden we de toevoeging van proteaseremmers aan de VLP-monsters en incubatie bij 4 °C aan. Niet-specifieke hechting van gastheerceleiwitten en VLP’s aan de kraalgebonden antilichamen wordt zelden waargenomen en moet worden uitgesloten door gebruik te maken van geschikte negatieve controles, zoals we hier hebben aangetoond met behulp van nep- en kale VLP-monsters en isotypecontrole-antilichamen. Strategieën om niet-specifieke binding te verminderen omvatten uitgebreide wasstappen en de toevoeging van caseïne in de wasbuffer34. Bovendien kan de afvangtest ook worden verbeterd door de optimale verhouding tussen antilichaam en antigeen-vertonende VLP-hoeveelheid te bepalen.
In de laatste stap van de VLP-vangsttest beschrijven we de elutie van de immuuncomplexen uit de kralen door te koken in het verminderen van de Laemmli-buffer. Tijdens deze stap worden de VLP’s gedemonteerd en worden de vangantistoffen en doelantigenen gescheiden van de kralen. Met name de donorsoort van het primaire antilichaam dat in de daaropvolgende Western blot-analyse wordt gebruikt, moet verschillen van de donor van het vanvangantilichaam om de onbedoelde detectie van het vanvangantilichaam door de secundaire antidonor IgG HRP-geconjugeerde antilichamen te voorkomen.
De hier gepresenteerde VLP-capture-test biedt een gebruiksvriendelijke en gevoelige methode om neutralisatiegevoelige epitopen te detecteren in structurele intacte doelantigenen die op VLP-oppervlakken worden weergegeven. De afvangtest maakt echter geen directe epitoopkwantificering mogelijk. ELISA’s uitgevoerd met bNAbs zijn instrumenteel voor dit doel en moeten parallel worden uitgevoerd, vooral als onderzochte VLP’s bedoeld zijn om te worden gebruikt in preklinische studies met diermodellen35. Dit is cruciaal, omdat de hoeveelheid antigeen direct kan correleren met de elicitatie van een neutraliserende antilichaamrespons bij geïmmuniseerde dieren, zoals aangetoond voor varkenscirccovirus type 2 (PCV2) vaccins36.
Een ideaal vaccin zou moeten resulteren in de elicitatie van bNAbs gericht op de neutralisatiegevoelige epitopen op het virionoppervlak. De analyse van deze epitopen, met name verwijzend naar hun volledige structurele integriteit op het oppervlak van het deeltjesvaccin, is cruciaal voor het identificeren van potentiële vaccinkandidaten. Dit is niet alleen het geval voor hiv-afgeleide VLP’s, maar ook voor veel andere VLP-vaccins in ontwikkeling37. Prominente op VLP gebaseerde vaccins zijn bijvoorbeeld afgeleid van niet-omhulde of capside ouderlijke virussen zoals humaan papillomavirus (HPV). In tegenstelling tot HIV-1-deeltjes, die worden gevormd door slechts één structureel kerneiwit, namelijk p55 Gag, en omhuld door het membraan afkomstig van de VLP-productiecel, bestaan HPV-deeltjes uit slechts één of twee structurele kerneiwitten38,39. Evenzo en zoals hier gepresenteerd voor omhulde VLP’s, kan de VLP-vangsttest ook van toepassing zijn op de detectie van neutralisatiegevoelige epitopen van niet-omhulde VLP’s.
Als alternatief voor de capture assay kunnen VLP-monsters direct worden onderworpen aan native PAGE gevolgd door Western blot-analyse met behulp van bNAbs en geschikte secundaire antilichamen gekoppeld aan HRP40. Voor de analyse van hiv-env-versierde VLP’s is deze test echter minder gevoelig omdat slechts een laag aantal antigeeneiwitten per VLP kan worden verwacht. Daarentegen vergemakkelijkt de vangsttest de detectie van de kerneiwitten die overvloedig aanwezig zijn in grote hoeveelheden per VLP, in het geval van HIV-afgeleide VLP’s vormen meer dan 3.500 Gag-eiwitten een VLP27. Dit maakt de zeer gevoelige indirecte detectie van epitopen in Env mogelijk, zelfs bij lage dichtheden op VLP’s.
Het aantal gevestigde methoden om neutralisatiegevoelige epitopen in oppervlakte-antigenen van VLP’s te onderzoeken, is beperkt. Het labelen van de antigenen die op de VLP’s worden weergegeven, is mogelijk met epitoopspecifieke antilichaam-fluorofoorconjugaten en daaropvolgende detectie door nanodeeltjestracking-analyse (NTA), waardoor detectie en kwantificering van VLP’s mogelijk is. Deze methode is ook met succes ontwikkeld en geoptimaliseerd voor exosomen die celoppervlakmarkers presenteren41. Ook maakt oppervlakte plasmon resonantie (SPR) spectroscopie de analyse van interacties tussen niet-geconjugeerde neutraliserende antilichamen en cognate epitopen gepresenteerd op VLP’s mogelijk. Hoewel niet geschikt voor analyse met een hogere doorvoer, kunnen VLP’s ook worden geëtiketteerd met bNAbs gekoppeld aan gouddeeltjes en vervolgens transmissie-elektronmicroscopisch (TEM)-onderzoek42.
Concluderend biedt de VLP-afvangtest enkele aanzienlijke voordelen: (i) Beoordeling van de structurele integriteit van neutralisatiegevoelige epitopen op het oppervlak van VLP’s, (ii) gevoelige en indirecte detectie van antigenen, zelfs wanneer weergegeven bij lage dichtheden op VLP’s, en (iii) de methode vereist geen kostenintensieve analytische apparatuur.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het Duitse federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek, financieringsprogramma Forschung an Fachhochschulen, contractnummers 13FH767IA6 en 13FH242PX6 aan JS. Figuren 1 en 2 zijn gemaakt met BioRender.com.
1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | ||
10x PBS | gibco | 70011044 | |
4%–15% Mini-PROTEAN TGX stain-free protein gels | BioRad | 4568085 | |
Antibodies (bnAbs) | Polymun Scientic | ||
Isotype control antibody | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 02-7102 | |
Chemidoc XRS+ imaging system | BioRad | 1708265 | |
Chicken anti-rabbit IgG HRP-coupled | Life technologies | A15987 | 1:5000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk |
Dynabeads Protein G Immunoprecipitation Kit | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 10007D | includes buffers and washing solutions |
FreeStyle 293-F cells | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | R790-07 | |
FreeStyle 293 Expression Medium | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 12338026 | |
Gel blotting papers | Whatman | GB005 | |
Glycine | Carl Roth | 0079 | blotting buffer |
Magnetic separation rack | New England Biolabs | S1509S | for 12 x 1.5 mL or 6 x 1.5 mL tubes |
Methanol | Carl Roth | 4627 | blotting buffer |
Mini-PROTEAN Tetra Cell electrophoresis system | BioRad | ||
Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
PageRuler prestained protein ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
Polyvinylidene fluoride (PVDF) syringe filters, 0.45 µm | Carl Roth | KC89.1 | |
Powdered milk | Carl Roth | T145 | blocking buffer |
PVDF transfermembrane, 0.45 µm | Carl Roth | T830.1 | |
QuickTiter HIV p24 ELISA | Cell Biolabs | VPK-108-H | |
Rabbit polyclonal to HIV1 p55 + p24 + p17 | abcam | ab63917 | 1:2000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk |
Rotator | Heidolph | REAX2 | |
ROTI Load 1 (laemmli buffer) | Carl Roth | K929.1 | 4x concentrated reducing protein gel loading buffer |
ROTIPHORESE 10x SDS-PAGE | Carl Roth | 3060 | |
Sodium chloride | Carl Roth | 3957 | TBS-T buffer |
SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34579 | |
SW28 rotor | Beckman Coulter | ||
Thermomixer | Cel Media | basic | |
Trans-Blot Turbo | BioRad | ||
Trehalose dihydrate | Carl Roth | 8897.2 | |
TRIS | Carl Roth | 5429 | blotting buffer |
TRIS hydrochloride | Carl Roth | 9090 | TBS-T buffer |
Tween-20 | Carl Roth | 9127 | TBS-T buffer |
Ultra Clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 |