捕捉アッセイを用いたウイルス様粒子(VLP)ベースワクチンに対する抗原中中和感受性エピトープの検出

1. サンプル準備 293-F発現培地において、ML当たり0.5 x 106細胞の低い細胞密度で、単独でまたはenv 30と一緒にギャグをギャグするHIV構造遺伝子を発現する293-F細胞に由来するVLPプロデューサー懸濁液細胞株をシードする。 37°Cで3〜4日間、シェーカーインキュベーター回転で8%のCO2 を、毎分5cmと135ラウンド(rpm)の軌道で回転させます。 ペレットは、5分間100xgで遠心分離することにより、プロデューサ細胞を。透明化した上清をフィルター処理し、フッ化ビニリデン(PVDF)膜シリンジフィルターを使用して残留細胞および細胞デブリを除去し、細胞を含まない細胞培養上清(CFSN)を得ます。注: プロトコルはここで一時停止することができます。CFSNは、4°Cで一晩保存することができます。 実験に直接CFSNを使用するか、または超遠心分離(112,700 x g、4°C、1.5時間)を採用したCFSNの35 mLからペレットVLPを使用してください。 超遠心分離時に、上清を捨て、遠心チューブ当たりのトレハロース溶液15%(w/v)の200 μLでVLPペレットを一時停止します。注:VLPペレットは、肉眼では見えないことが多いです。プロトコルはここで一時停止することができます。VLPは-80°Cで貯えることができる。 VLP捕獲アッセイの前に、ELISAを用いて、サンプルを含むVLP中のウイルスコアタンパク質濃度を決定する。このステップは、キャプチャアッセイ入力を標準化するために重要です。 2. VLPキャプチャアッセイ 注: ワークフローの概要を 図 2 に示します。 50 rpmでピペットを上下にピペットするか、50 rpmで混合して、少なくとも5分間、磁気ビーズを吊り下げます。 一方、bNAbsを含む抗体溶液を調製する。各bNAbの10μgを、抗体結合および洗浄バッファー( 材料表参照)の200 μLで反応ごとに使用します。注:抗体量は、使用するVLP上のbNAbおよび抗原装飾密度の親和性に応じて変化する可能性があります。 反応ごとに50μLの磁気ビーズ溶液( 材料表を参照)を使用し、1.5 mL反応チューブにビーズを移します。チューブを磁気分離ラックに置きます。注: また、強力な単一の磁石を各チューブに使用して、上清からビーズを分離することもできます。 ビーズがチューブウォールに集まるまで数分待って、すべてのビーズが収集されるようにします。上清を取り除く。 磁石を取り外し、ステップ2.2で調製したbNAb溶液の200 μLでビーズを一時停止します。室温で50rpmで回転器に30分間混合してインキュベートする。 反応管を磁気分離ラックに再度入れ、上清を待って取り外します。 マグネットからチューブを取り出し、200 μLの抗体結合と洗浄バッファーで再懸濁してビーズを洗浄します。 ステップ 2.4 を繰り返します。できるだけ多くの洗浄バッファーを取り外します。 ビーズバインド bNAbs にサンプルを追加します。注:HIV由来粒子を用いた捕獲アッセイのVLP入力は、反応ごとに少なくとも15ngのウイルスコアタンパク質であるべきである。VLP量は、bNAbの親和性、および使用するVLP上の抗原装飾密度に応じて変化し得る。 ステップ2.9で追加したサンプル量が1mL以下の場合は、PBSを追加してサンプル量を1mLに調整します。ピペットでビーズを軽く吊り下げます。 室温で回転器にサンプルとビーズを2.5時間インキュベートします。ビーズが懸濁状態に留まり、インキュベーション中に溶液が十分に混合されていることを確認します。 磁石の上にチューブを置き、上清を取り除きます。 磁気ビーズを200 μLの洗浄バッファーに吊り下げ、洗浄します( 材料表を参照)。洗浄工程を3回繰り返します。 100 μL の洗浄バッファーにビーズを吊り下げ、その懸濁液をクリーン(耐熱)反応管に移します。 チューブを磁気分離ラック( 材料表を参照)に置き、上清を完全に取り外します。 ステップ 2.16.1-2.16.2 またはステップ 2.16.3-2.16.5 に従って磁気ビーズから VLP を溶出させることによって、変性された SDS-PAGE サンプルを準備します。 変性されたSDS-PAGEサンプルを調製するには、20-80 μLのレムリバッファー(p55 Gagアッセイ入力の1ng当たり0.8 μL)でビーズを停止し、95°Cで5分間インキュベートします。 SDS-PAGEを直接進めるか、サンプルを-20 °Cで保管してください。注意:レムリバッファーは、2-メルカプトエタノールとドデシル硫酸ナトリウムが含まれています。保護手袋と目の保護を着用してください。皮膚、目、衣服との接触を避ける。蒸気を吸入しないでください。風通しの良い空間、例えば、ヒュームフードで働く。注: プロトコルはここで一時停止することができます。 あるいは、非変性溶出工程を行い、保存された天然タンパク質構造を有するVLPを得る。 25 μL の溶出バッファー(ビーズを頻繁に提供)を磁気ビーズに加え、室温で 2~5 分間インキュベートします。 ビーズを取り出し、溶出管をきれいなチューブに移します。その後のアッセイに溶出物を使用するか、4°Cで保管してください。注: プロトコルはここで一時停止することができます。 3. 捕捉されたVLPサンプルの分析 注: キャプチャした VLP の分析については、SDS-PAGE を実行し、その後、ウェスタン ブロット分析 31,32 を実行します。 サンプルチューブを磁気ラックに置き、ビーズを溶液から分離します。 各サンプル10 μLをゲルの個々のウェルに積み込みます。注:このプロトコルでは、ウイルスp55 Gagコアタンパク質は、HIV Gagに対して向けられたポリクローナルウサギ抗体と、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)抗体に結合された二次ポリクローナルチキン抗ウサギIgGを採用することによって検出されました。ウイルスコアタンパク質を化学発光検出を用いて可視化した。 図2:無細胞上清を用いたVLP捕獲アッセイの主要なステップの概略図。 (1) VLP捕獲アッセイは、タンパク質G結合磁気ビーズへのHIV-1 bNAbsの結合から始まります。一方、定義されたp55濃度のVLP溶液が調製される。無細胞培養上清は、p55 Gag VLP、宿主細胞タンパク質、および核酸の混合物からなる。(2)bNAbsとVLP溶液に結合された磁気ビーズは、1.5mL反応チューブに移され、その後回転下でインキュベーションが行われます。(3) 抗原表示 VLP は bNAbs コーティングビーズによって捕捉される。これらの免疫複合体を宿主細胞由来の汚染物質から分離することは、磁場中で行われる。(4)上清をピペットで除去し、 ビーズを3回洗浄して非結合VLPを除去する。(5)次のステップでは、bNAbsでコーティングされた磁気ビーズと捕捉されたVLPからなる免疫複合体にタンパク質ローディングバッファーを還元する。(8)タンパク質サンプルはSDS-PAGEに供される。(9)ウエスタンブロット分析は、ウイルスp55 Gagコアタンパク質を検出するために行われる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。