JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

Kwantificering van de potentiële impact van producten op basis van glyfosaat op microbiomen

Published: January 10, 2022
doi:
10.3791/63109
, , , , ,
1Biodiversity Unit,University of Turku, 2Department of Biology,University of Turku, 3Nutrition and Health Unit,Eurecat Technology Centre of Catalonia, 4Department of Biochemistry and Biotechnology,Rovira i Virgili University

Summary

Producten op basis van glyfosaat (GBP) zijn wereldwijd de meest voorkomende breedspectrumherbiciden. In dit artikel introduceren we algemene richtlijnen om het effect van GBP op microbiomen te kwantificeren, van veldexperimenten tot bioinformatica-analyses.

Abstract

Producten op basis van glyfosaat (GBP) zijn wereldwijd de meest voorkomende breedspectrumherbiciden. Het doelwit van glyfosaat is het enzym 5-enolpyruvylshikimaat-3-fosfaatsynthase (EPSPS) in de shikimaatroute, die vrijwel universeel is in planten. De remming van het enzym stopt de productie van drie essentiële aminozuren: fenylalanine, tyrosine en tryptofaan. EPSPS is ook aanwezig in schimmels en prokaryoten, zoals archaea en bacteriën; het gebruik van GBP kan dus een impact hebben op de samenstelling van het microbioom van bodems, planten, herbivoren en secundaire consumenten. Dit artikel is bedoeld om algemene richtlijnen te presenteren om het effect van GBP op microbiomen te beoordelen, van veldexperimenten tot bioinformatica-analyses en een paar testbare hypothesen te bieden. Twee veldexperimenten worden gepresenteerd om de GBP te testen op niet-doelorganismen. Eerst worden plant-geassocieerde microben van 10 gerepliceerde controle- en GBP-behandelingspercelen die no-till-teelt simuleren, bemonsterd en geanalyseerd. In het tweede experiment werden monsters verkregen van experimentele percelen die werden bemest door pluimveemest die glyfosaatresiduen of niet-behandelde controlemest bevatte. Bioinformatica-analyse van EPSPS-eiwitsequenties wordt gebruikt om de potentiële gevoeligheid van microben voor glyfosaat te bepalen. De eerste stap bij het schatten van het effect van GBP op microbiomen is het bepalen van hun potentiële gevoeligheid voor het doelenzym (EPSPS). Microbiële sequenties kunnen worden verkregen uit openbare opslagplaatsen of door middel van PCR-amplificatie. In de meeste veldstudies is de samenstelling van het microbioom echter bepaald op basis van universele DNA-markers zoals het 16S-rRNA en de interne getranscribeerde spacer (ITS). In deze gevallen kan de gevoeligheid voor glyfosaat alleen worden geschat door een probabilistische analyse van EPSPS-sequenties met behulp van nauw verwante soorten. De kwantificering van de potentiële gevoeligheid van organismen voor glyfosaat, gebaseerd op het EPSPS-enzym, biedt een robuuste aanpak voor verdere experimenten om doel- en niet-doelresistente mechanismen te bestuderen.

Introduction

Het zware gebruik van pesticiden in de moderne landbouw draagt duidelijk in belangrijke mate bij aan de achteruitgang van de biodiversiteit1. Dit artikel richt zich op glyfosaat omdat op glyfosaat gebaseerde producten (GBP’s) wereldwijd de meest gebruikte pesticiden zijn geworden vanwege hun efficiëntie en betaalbare prijs 2,3. Naast het doden van onkruid in landbouwvelden, worden GBP’s vaak gebruikt in bosbouw, stedelijke omgevingen en huistuinen; bovendien zijn ze verklaard als niet-toxisch voor niet-doelorganismen als ze worden gebruikt in overeenstemming met de instructies van de fabrikant. Uit een toenemend aantal recente studies is echter gebleken dat residuen van glyfosaat en de afbraakproducten daarvan in de bodem kunnen worden vastgehouden en getransporteerd, waardoor cascaderende effecten op niet-doelorganismenkunnen optreden 4,5,6,7,8 . De effecten van glyfosaat zijn niet alleen beperkt tot planten – de shikimaatroute is ook aanwezig in veel schimmels en prokaryoten. Glyfosaat richt zich op het enzym 5-enolpyruvylshikimaat-3-fosfaatsynthase (EPSPS) in de shikimaatroute, ook bekend als aroA9. Dit enzym bevindt zich in het centrum van de shikimaatroute in de synthese van de drie essentiële aromatische aminozuren (fenylalanine, tyrosine en tryptofaan) en is aanwezig in de meeste prokaryoten, planten en schimmels10,11. Sommige microbiële soorten hebben gedeeltelijke of absolute resistentie tegen glyfosaat ontwikkeld door middel van verschillende mechanismen, waaronder mutaties in de EPSPS-sequenties. Er is dus gesuggereerd dat het gebruik van GBP’s een direct effect kan hebben op plantaardige en dierlijke microbiomen, waaronder het menselijke darmmicrobioom 12,13,14. Niettemin kan het gebruik van GBP een negatieve invloed hebben op vrijwel elke ecosysteemfunctie en -dienst die afhankelijk is van microben en door microben gefaciliteerde processen. De daaruit voortvloeiende bedreigingen kunnen betrekking hebben op biochemische bodemprocessen, bestuivingsbiologie en het welzijn van dieren en mensen. Dit vraagt om een uitgebreider begrip van hoe glyfosaat shikimaatroutes en methoden beïnvloedt om de gevoeligheid van microben voor glyfosaat te beoordelen.

In dit protocol presenteren we een pijplijn om het effect van glyfosaat en GBP op het microbioom te testen, van veldexperimenten tot bioinformatica-analyses. We beschrijven in detail een recent gepubliceerde bioinformatica methode die kan worden gebruikt om de potentiële gevoeligheid van organismen voor glyfosaat12 te bepalen. Voor zover de onderzoekers weten, is dit het eerste en tot nu toe enige bioinformatica-instrument om de intrinsieke gevoeligheid van het enzym EPSPS voor het actieve bestanddeel van GBP’s te beoordelen. Deze bioinformatica methode is gebaseerd op de detectie van bekende aminozuurmarkers in het glyfosaat doelenzym (EPSPS)12. De pijplijn is verdeeld in vijf belangrijke werkfasen (figuur 1): 1) een korte inleiding tot twee veldexperimenten om het effect van GBP’s te testen, 2) een korte samenvatting van microbioomanalyses (16S rRNA, ITS en EPSPS-gen ), 3) het verzamelen van EPSPS-sequenties uit openbare opslagplaatsen, 4) het bepalen van de potentiële gevoeligheid van organismen voor glyfosaat en 5) het beoordelen van de EPSPS-klasse van universele microbiële markers (16S rRNA en ITS).

Protocol

1. Twee veldexperimenten om het effect van GBP’s te testen OPMERKING: Dit protocol presenteert twee voorbeelden van veldexperimentele ontwerpen om het effect van GBP’s op plant-geassocieerde microben te testen. Beide experimenten werden uitgevoerd in braakgelegde velden zonder voorgeschiedenis van herbiciden of landbouwtoepassingen aan de Botanische Tuin van Turku Ruissalo in Finland (60º26’N, 22º10’E). De bodem is zandige klei met een hoog aandeel organische stof. Experiment 1OPMERKING: Dit experiment is ontworpen om de algemene landbouwpraktijken van no-till landbouw te simuleren met GBP-toepassingen voor en na het groeiseizoen om onkruid te bestrijden. Verdeel het experimentele veld in 10 gerepliceerde controle- en GBP-behandelingspercelen (23 m x 1,5 m) met bufferstroken vegetatie tussen de percelen (in deze studie in het voorjaarvan 2014 15) (figuur 2). Zorg ervoor dat de percelen met een roterende helmstok tot een diepte van 5 cm worden bewerkt en twee keer per jaar worden behandeld. Hier werden de percelen behandeld in het begin (mei) en het einde (oktober) van het groeiseizoen. Behandel de controlepercelen met leidingwater (5 l/perceel) en de GBP-percelen met commerciële GBP (glyfosaatconcentratie 450 g· L-1, toedieningssnelheid 6,4 L·ha-1 in 5 L leidingwater per perceel) om de maximaal toegestane dosering van glyfosaat in landbouwpraktijken na te bootsen (3 kg·ha-1). Breng de behandelingen aan met een handbediende druktank met een handmatige sproeier. Twee weken na de GBP-toepassing zaait u haver (Avena sativa), fababonen (Vicia faba), raapzaad (Brassica rapa subsp. oleifera) en plantaardappelen (Solanum tuberosum) op de percelen volgens landbouwpraktijken. Tijdens het groeiseizoen, met de hand onkruid de percelen om de plant concurrentie en bodemstructuur zo gelijk mogelijk te houden in de controle en GBP-behandelde percelen. Bemonster de microbiota van experimentele planten. In deze studie werden de microbiota achtereenvolgens bemonsterd van 2017 tot en met 2020 in zowel de GBP-behandelde als de controlebehandelingspercelen eenmaal per groeiseizoen in de loop van het onderzoek. Verzamel tien replicaties van de plantenmonsters (wortel en blad) uit het veld, plaats ze onmiddellijk op ijs en breng ze naar het laboratorium voor verdere verwerking, zoals beschreven in punt 2.1. Experimenteer 2OPMERKING: Dit experiment is ontworpen om de risico’s van de circulaire voedseleconomie te testen; meer bepaald was het bedoeld om de gevolgen te onderzoeken van GBP-residuen in mest die als meststof aan gewasplanten wordt toegediend2 (figuur 3). Verzamel beddengoed, inclusief houtkrullen, uitwerpselen en wat gemorst voer, van kwartels die worden gevoed met GBP-verontreinigde of controlevoeders in een volière-experiment van 12 maanden16,17.OPMERKING: Het met GBP besmette voer bestond uit biologisch voer voor legkippen in combinatie met een equivalent van 160 mg glyfosaat/kg, wat overeenkomt met een dagelijkse inname van 12-20 mg glyfosaat per kilogram lichaamsgewicht in volwassen Japanse kwartels16,17. Stuur de monsters voor validatie naar een geaccrediteerd laboratorium voor glyfosaatconcentratiemetingen in zes partijen diervoeders. Meet bovendien de glyfosaatresiduen in kwarteluitwerpselenmonsters na 12 maanden blootstelling. De controlegroep kreeg hetzelfde biologische voer zonder GBP-toevoeging16,17. Tijdens het volière-experiment, verander het beddengoed tweewekelijks. Verzamel het gebruikte beddengoed regelmatig van 8-12 maanden blootstelling aan GBP-behandeling en -controles, pool per behandeling en bewaar in gesloten containers in een droge, donkere opslagruimte bij 6 ° C voordat u als meststof wordt gebruikt. Verdeel 12 L van het beddengoed handmatig over elk van de 18 GBP en 18 controlepercelen (grootte 1 m x 1 m) in een 6 x 6 schaakbordraster in het experimentele veld op twee tijdstippen. In deze studie werd het beddengoed verspreid in augustus 2018 en in mei 2019. Stuur de beddingmonsters direct na verspreiding naar een geaccrediteerd laboratorium voor de glyfosaatconcentratiemetingen (in deze studie in mei 2019). Plant meerjarige gras- en aardbeiplanten in elk perceel om hun wortel- en bladmicrobiota te bestuderen.OPMERKING: In deze studie werden vier meerjarige grasplanten (Festuca pratensis) en twee aardbeiplanten (Fragaria x vescana) op elk perceel geplant en bestudeerd voor hun wortel- en bladmicrobiota. 2. Microbioomanalyses (16S-rRNA, ITS – en EPSPS-gen ) OPMERKING: De meeste microbioomstudies zijn gebaseerd op de analyse van het 16S rRNA-gen voor bacteriële en interne getranscribeerde spacer (ITS) regio’s voor schimmelgemeenschappen met behulp van next-generation sequencing-technologieën. Het document bevat dus geen informatie over het type EPSPS. EPSPS-sequenties van duizenden soorten zijn beschikbaar in openbare opslagplaatsen (Protocol sectie 3) (Figuur 4). 16S rRNA-gen Identificeer uit de losse blad- en wortelmonsters die zijn verzameld in de hierboven beschreven experimenten de endofytische microben (d.w.z. microben die in plantenweefsels leven). Was de plantenmonsters met kraanwater en steriliseer ze vervolgens om de epifytische microben (d.w.z. microben op het oppervlak van plantenweefsels) te verwijderen. Steriliseer met 3% bleekmiddel gedurende 3 minuten, gevolgd door een 70% ethanoloplossing gedurende 1 minuut en was drie keer met geautoclaveerd ultrapuur water gedurende 1 minuut elk. Vries de monsters in bij -80 °C tot genomisch DNA-extractie. Voer genomische DNA-extractie uit met behulp van een in de handel verkrijgbare plant-DNA-extractiekit volgens het protocol van de fabrikant. Richt je op de variabele regio’s V6-V8 van het 16S-rRNA-gen uit geëxtraheerde DNA-monsters met behulp van een geneste benadering met discriminerende primers die specifiek binden aan bacterieel DNA18, waardoor de amplificatie van het DNA van waardplanten wordt geminimaliseerd. Na drie rondes polymerasekettingreactie (PCR) tagt u het doelgen met barcode- en adaptersequenties om het voor te bereiden als de sjabloon voor sequencing. Volg stappen 2.1.7- 2.1.11 voor PCR-versterking Bereid de PCR-mastermix voor het vereiste aantal monsters voor, zodat elke reactie een totaal volume van 30 μLof heeft en bestaat uit 30 ng DNA, 1x PCR-buffer, 0,2 mM dNTPs, 0,3 μM van elke primer en 2000 U/ml DNA-polymerase. Volg dezelfde stap voor de tweede en derde ronde van PCR. Gebruik voor de eerste ronde PCR primers 799F19 en 1492R (gewijzigd van20) (tabel 1). Stel het versterkingsprofiel in op de thermocycler (3 minuten initiële denaturatie bij 95 °C, gevolgd door 35 denatureringscycli bij 95 °C gedurende 45 s, gloeien bij 54 °C gedurende 45 s en verlenging bij 72 °C gedurende 1 minuut). Voer de laatste verlenging uit bij 72 °C gedurende 5 minuten. Controleer als sjabloon voor de tweede ronde van PCR de versterking door elektroforese (5 μL van de PCR-producten op 1,5% agarosegel) en verdun vervolgens de rest 25 μL van het PCR-product in geautoclaveerd ultrapuur water in de verhouding van 1:10. Herhaal PCR met de verdunde PCR-sjablonen en primers uni-1062F21 en uni-1390R22 (tabel 1). Behoud dezelfde PCR-reactiecondities en versterkingsprofiel (stap 2.1.8), behalve het verminderen van het aantal cycli tot 25. Verdun de resulterende PCR-producten in geautoclaveerd ultrapuur water in de verhouding 1:1. Voer de derde ronde PCR uit om de producten te labelen met de barcodes en P1-adaptervolgorde met 8 cycli van hetzelfde PCR-profiel zoals vermeld in stap 2.1.8. Bibliotheekvoorbereiding Controleer de concentratie en kwaliteit van PCR-producten op een bioanalysator en bundel de volumes die 30 ng DNA van elk monster vormen in een buis van 1,5 ml om een equimolaire bibliotheek te bereiden. Selecteer de amplicons van maat 350-550 bp op maatfractionering met behulp van een geautomatiseerd DNA-maatselectiesysteem op een agarose-gelcassette. Merk op dat dit ook niet-specifieke ampliconen en PCR-reagentia uit de bibliotheek elimineert. Verzamel de eluut bestaande uit ampliconen van de opgegeven grootte in een injectieflacon in de cassette, wat resulteert in een gezuiverde 16S rRNA-genenbibliotheek. Pipetteer de eluut in een buis van 1,5 ml en controleer de zuiverheid en concentratie op de bioanalysator. Verdun de DNA-bibliotheek met behulp van geautoclaveerd ultrapuur water tot een eindconcentratie van 26 pM; het monster is klaar voor sequencing. ZIJNOPMERKING: Het ITS-gebied wordt versterkt met ITS-specifieke primers (tabel 1) en het resulterende PCR-product is gelabeld met barcodes en een P1-adaptersequentie voor sequencing. Bereid de PCR-mastermix volgens hetzelfde protocol als vermeld in rubriek 2.1 met ITS-primers . Stel het versterkingsprofiel op de thermocycler in als 5 minuten initiële denaturatie bij 95 °C, gevolgd door respectievelijk 35 cycli denatureren, gloeien en verlengen bij 95 °C gedurende 30 s, 55 °C voor 30 s, 72 °C gedurende 1 min en laatste verlenging 72 °C gedurende 7 minuten. Analyseer 5 μL van het PCR-product op 1,5% agarosegel en verdun de resterende 25 μL tot 1:10 met geautoclaveerd ultrapuur water. Gebruik het verdunde PCR-product als sjabloon voor de tweede ronde van PCR. Bereid de PCR-mastermix voor het vereiste aantal monsters (zie stap 2.1.6) met voorwaartse primers met streepjescode en omgekeerde primers met P1-adapter. Versterken met hetzelfde versterkingsprofiel als in stap 2.3.2, behalve met 8 cycli. Bereid de resulterende PCR-producten voor op sequencing volgens de protocollen vermeld in paragraaf 2.2. EPSPS-gen Sequence en analyseer de EPSPS-genen van de microben.OPMERKING: Om te bepalen of GBP-blootstelling de samenstelling van glyfosaatgevoelige en resistente microben in de gemeenschap heeft veranderd, moeten de EPSPS-genen van de microben worden gesequenced en geanalyseerd. Zo werden 353 sequenties van EPSPS-genen uit een brede verzameling microbiële taxa in de Alignable Tight Genomic Clusters (ATGC) -database verzameld en werden alle eiwitsequenties uitgelijnd22. Deze uitlijningen zijn beschikbaar in ATGC database23 en kunnen worden gebruikt om primers te genereren uit geconserveerde regio’s. Een eenvoudig te gebruiken bioinformatica-tool is ontworpen om geconserveerde regio’s te identificeren vanuit een uitlijning van meerdere sequenties, en dit is beschikbaar op Pere Puigbo-onderzoekspagina24. Het valt echter buiten het bestek van deze publicatie om een gedetailleerde beschrijving van deze webserver te geven. Niettemin is een prospectief protocol om deze primers te gebruiken voor amplificatie van het EPSPS-gen om de gevoeligheid van het microbioom voor glyfosaat te vinden, weergegeven in figuur 4. 3. Epsps-eiwitsequenties verzamelen uit openbare opslagplaatsen EPSPS-sequenties voor gebruik in macro-evolutiestudies Verzamel EPSPS-eiwitten uit openbare opslagplaatsen zoals PFAM23 (een database van eiwitfamilies25), GenBank24 (een database van genen, genomen en eiwitten26 ), COG25 (clusters van orthologe groepen27; een database van orthologe eiwitten van archaea en bacteriën); en VOB26 (Protein Data Bank28; een database van eiwitstructuren).OPMERKING: Een recente studie uitgevoerd door de onderzoekers toonde aan dat deze eiwitten kunnen worden gebruikt om micro-evolutionaire en vergelijkende analyses uit te voeren van het potentiële effect van glyfosaat op organismen met de shikimaatroute12. De auteurs hebben een gebruiksvriendelijke website ontwikkeld die informatie verzamelt over tienduizenden EPSPS-eiwitsequenties29, inclusief een handmatig samengestelde dataset van eiwitten uit het menselijke darmmicrobioom12. De informatie in deze vooraf berekende datasets omvat de huidige EPSPS-classificatie in vermeende gevoelige en resistente tegen glyfosaat, taxonomische informatie over soorten, annotaties van de EPSPS-actieve site en links naar PDB- en NCBI-databases. Bovendien bevat de webserver de ID-codes van de EPSPS en koppelingen naar verschillende externe databases (tabel 2). EPSPS-sequenties voor gebruik in micro-evolutiestudies ATGCOPMERKING: Algemene opslagplaatsen van eiwitsequenties zijn nuttig voor het uitvoeren van vergelijkende studies tussen relatief verre organismen; het potentiële effect van glyfosaat is echter relatief recent vanuit evolutionair oogpunt. In sommige studies is het dus noodzakelijk om nauw verwante soorten (bijvoorbeeld verschillende stammen van dezelfde bacteriesoort) te vergelijken om het effect van glyfosaat14 te bepalen. In deze gevallen is de database van Alignable Tight Genomic Clusters (ATGC)30, die een uitgebreide lijst van nauw verwante archaeale en bacteriële genomen bevat, een meer geschikte bron. De ATGC-database bevat informatie over enkele miljoenen eiwitten uit duizenden genomen georganiseerd in honderden clusters30. Elk genoomcluster is uitlijnbaar (genomen delen synteny over ≥85% van hun lengte) en strak (met een synonieme substitutiesnelheid onder verzadiging). De onderzoekers gebruikten de ATGC-dataset in een recente studie om micro-evolutionaire veranderingen in EPSPS-eiwitten te analyseren14. De volgende stappen zijn nodig om epsps-eiwitsequentie in de ATGC te identificeren: Download de hele database van ATGC’s van link31 en alle eiwitten van de COG0128 (code die overeenkomt met EPSPS-eiwitten in de database)32 in een lokaal project.OPMERKING: Als de onderzoekers/experimentatoren in Finland zijn gevestigd, biedt het CSC-IT Center for Science33 opslag- en softwarefaciliteiten. Het is belangrijk om alle sequenties in FASTA-formaat te verzamelen. Bouwde een blast database van de COG0128 die orthologen van het EPSPS-eiwit bevatten in een representatieve set soorten prokaryoten. De CSC heeft het blast-programma34 vooraf geïnstalleerd, waardoor het commando makeblastdb -in COG0128.fa -dbtype prot kan worden gebruikt om een referentiedatabase van EPSPS-sequenties te maken. Wijs de ATGC-database toe aan de COG0128.fa (EPSPS-eiwitten) met behulp van een iteratieve blast search met het commando blastp -query [ATGC_X.fa] -db [COG0128.fa] -max_target_seqs 1 -outfmt 6 -out tmpfile -evalue 1e-150. Als gevolg hiervan creëert het een dataset van EPSPS-eiwitsequenties binnen elk. Een vooraf berekende dataset van nauw verwante EPSPS-eiwitsequenties uit de ATGC-database is beschikbaar29. 4. Algoritme om de potentiële gevoeligheid van organismen voor glyfosaat te bepalen (EPSPSClass webserver: inputs, processing en outputs) OPMERKING: De onderzoekers hebben een eenvoudig te gebruiken server geïmplementeerd die vrij beschikbaar is op 29 om de klasse van EPSPS-eiwitsequenties12,35 te bepalen. De server vereist alleen een invoer van eiwitsequentie in FASTA-indeling om het identiteitspercentage voor elk van de EPSPS-klassen en hun potentiële gevoeligheid voor glyfosaat te bepalen. Bovendien kunnen gebruikers de webserver gebruiken om hun eigen referentiesequenties en aminozuurmarkers te testen. Ten eerste lijnt het algoritme (figuur 5) querysequenties en referentiesequenties uit met behulp van een programma voor het uitlijnen van meerdere sequenties35 om aminozuurposities te bepalen. Vervolgens zoekt het naar de aanwezigheid van aminozuurmarkers om de EPSPS-klasse (I, II, III of IV) van de querysequentie te identificeren. Introduceer een EPSPS-eiwitsequentie in FASTA-indeling in het invoertekstvak om de klasse van het enzym te identificeren (figuur 6A) en druk op Verzenden. Beoordeel de potentiële gevoeligheid van de queryvolgorde voor glyfosaat (figuur 6B-E) van de door de server geleverde uitgangen:Output 1: Fractie van aminozuurmarkers (d.w.z. identiteit) aanwezig in de querysequenties (klasse I, II en IV) en het aantal motieven (klasse III).Uitvoer 2: Uitlijningen van de query- en referentiesequenties op basis van markerresiduen.Uitvoer 3: Volledige paarsgewijze uitlijningen van de query- en referentiesequenties.Output 4: EPSPS-referentiesequenties: Vibrio cholerae (vcEPSPS, klasse I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, klasse II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, klasse III), Streptomyces davawensis (sdEPSPS, klasse IV). Zoek aan het einde van de uitvoerpagina koppelingen naar externe hulpprogramma’s zoals blastp en geconserveerde domeinen om de EPSPS-reeks van de query verder te analyseren (figuur 6F). 5. Beoordeling van de EPSPS-klasse van universele microbiële markers (16S rRNA en ITS ) OPMERKING: De meeste microbioomstudies zijn gebaseerd op de analyse van het 16S-rRNA en/of ITS36. In dergelijke gevallen is het niet mogelijk om een directe analyse van de EPSPS-sequentie uit te voeren. Daarom is een probabilistische benadering om de potentiële gevoeligheid van organismen voor glyfosaat in te schatten noodzakelijk. Deze analyse is eenvoudig en geeft een redelijke schatting van het type EPSPS-sequenties in een microbioomproject. Het proces is verdeeld in 3 stappen (figuur 7 en figuur 8): Identificeer EPSPS-sequenties uit openbare opslagplaatsen. De EPSPS-klasse van een uitgebreide dataset van representatieve sequenties is samengesteld en vooraf berekend op basis van PFAM37, GenBank38, COG39, PDB40, ATGC30. Open deze datasets vanaf de hoofdpagina van de EPSPSClass-server, met taxonomische informatie en de EPSPS-klasse van meer dan 50.000 sequenties (figuur 7). Meet de hoogte van de experimentele planten tweewekelijks tijdens het groeiseizoen en weeg de bovengrondse biomassa van de planten aan het einde van het veldseizoen om de groei van de planten in GBP en controlepercelen te vergelijken.OPMERKING: De microbiota-analyses van de veldexperimenten zijn nog niet volledig geanalyseerd. Gebruik een spreadsheet om de bacteriële OTU’s (gebaseerd op 16S rRNA of ITS) van microbioomexperimenten in kaart te brengen in vooraf berekende datasets.OPMERKING: Eerdere studies hebben aangetoond dat de EPSPS-klasse (d.w.z. de intrinsieke gevoeligheid voor glyfosaat) sterk geconserveerd is binnen een fylogenetische groep14. Het is dus relatief veilig om aan te nemen dat nauw verwante soorten van sterk geconserveerde taxonen vergelijkbare EPSPS-reacties op glyfosaat kunnen hebben (figuur 8). Bereken in dezelfde spreadsheet de intrinsieke gevoeligheid voor glyfosaat, op basis van een probabilistische score (S = s / (s + r + u) waarbij S: Sensitivity Score; s: aantal potentieel gevoelige sequenties; r: aantal potentieel resistente sequenties; u: aantal niet-geclassificeerde sequenties) berekend op basis van bekende EPSPS-sequenties in openbare databases.OPMERKING: Deze score varieert van 0 (er worden geen gevoelige EPSPS-sequenties gevonden in een taxon) tot 1 (alle sequenties in een taxon zijn gevoelig voor glyfosaat) (figuur 8). Bovendien zijn er tussenwaarden, d.w.z. soorten met gevoelige, resistente of onbekende stammen.

Representative Results

Het doel van dit protocol is om een algemene pijplijn te bieden, van veldexperimenten tot bioinformatica-analyses, die de potentiële gevoeligheid van organismen voor het herbicide glyfosaat kwantificeert. In experiment 2 was de gemiddelde glyfosaatconcentratie in het kwartelvoer 164 mg/kg en de gemiddelde glyfosaatconcentratie van de uitwerpselenmonsters (urine en fecale stof gecombineerd) 199 mg/kg. Strooisel dat werd verzameld van kwartels die met GBP-besmet voer waren gevoed, had gemiddeld 158 mg/kg en controlebedden van 0,17 mg/kg glyfosaat (tabel 3). In de veldexperimenten reageerden plantensoorten verschillend op glyfosaatresiduen in de bodem (sectie 1). Biomassa van haver en raapzaad was groter in controlebodems in vergelijking met GBP-behandelde bodems. Fababonen en aardappelen bleken echter aan het einde van het groeiseizoen15 baat te hebben bij een GBP-behandeling. Glyfosaat in pluimveemest verminderde de plantengroei in gras (Festuca pratensis) en aardbei (Fragaria x vescana) (sectie 1). De microbiota-analyses van de veldexperimenten zijn nog niet volledig geanalyseerd en worden hier niet gepresenteerd (paragraaf 2). De resultaten van dit protocol, wanneer ze direct (zoals weergegeven in rubrieken 3 en 4) of indirect (rubriek 5) worden gelezen, geven een maat voor het aandeel potentieel gevoelige en resistente organismen tegen glyfosaat in een dataset (figuur 9). Het gebruik van deze methode werd getest met een verzameling EPSPS-eiwitsequenties van microbiële soorten van het kernmicrobioom van de menselijke darm die werden verkregen uit openbare opslagplaatsen12. In de studie werden 890 stammen van de 101 meest voorkomende bacteriesoorten geanalyseerd met de EPSPSClass-methode om het aandeel gevoelige en resistente bacteriën te kwantificeren. De resultaten toonden aan dat 54% van de soorten in het kernmicrobioom van de menselijke darm potentieel gevoelig zijn voor glyfosaat12. Deze trend wordt ook waargenomen in het grootste deel van de prokaryote wereld; bovendien is bij eukaryoten (voornamelijk planten en schimmels) het aandeel potentieel gevoelige soorten nog hoger12. Bovendien hebben we deze methode gebruikt om veranderingen in gevoeligheid in het EPSPS-eiwit op micro-evolutionair niveau te kwantificeren (figuur 10)14. We identificeerden veranderingen in gevoeligheidsstatus in 12 van de 32 nauw verwante groepen geanalyseerde prokaryoten (tabel 4)14. Het continue gebruik van de GBP’s kan dus microbiële dysbiose veroorzaken (d.w.z. een onbalans van gevoelige en resistente bacteriesoorten) in planten-, dier- en bodemmicrobiomen. Bovendien is verondersteld dat een toename van glyfosaatresistente bacteriën multiresistente microbiomen kan bevorderen 14,41,42. Dit protocol werpt dus licht op de interpretatie van al deze scenario’s, aangezien de EPSPS-classificatiemethode een directe schatting geeft van de intrinsieke gevoeligheid van microbiomen voor glyfosaat. Vanwege de intrinsieke gevoeligheid van het EPSPS-eiwit voor glyfosaat dat fylogenetisch geconserveerd is14, is het mogelijk om de resultaten uit bestaande datasets te extrapoleren naar onbekende microbiomen (figuur 8). Figuur 1: Algemene pijplijn Dit is een algemene pijplijn om de gevoeligheid voor GBP te analyseren van veldexperimenten tot bioinformatica-analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Veldexperiment 1 om de effecten van GBP-residuen op gewasplant-geassocieerde microben te testen. Het proefveld bestaat uit afwisselend 10 controlepercelen en 10 GBP-zuiveringspercelen (23 m x 1,5 m) met 1,5 m bufferstroken tussen percelen. Twee keer per jaar sinds 2014 werden de GBP-percelen behandeld met commerciële GBP (glyfosaatconcentratie 450 g L-1, toedieningssnelheid 6,4 L ha-1 in 5 L leidingwater per perceel) en de controlepercelen met dezelfde hoeveelheid leidingwater zonder glyfosaat. De behandelingen werden toegepast met een handbediende druktank met behulp van een plastic kap in de sprinklertip om GBP’s te beschermen tegen verspreiding buiten de behandelingspercelen. Na een veiligheidsperiode van twee weken na de GBP-toepassing werden haver (Avena sativa), fababonen (Vicia faba) en raapzaad (Brassica rapa subsp. oleifera) gezaaid en aardappelen (Solanum tuberosum) op de percelen geplant. Microbiotamonsters van de bestudeerde gewasplanten, bladeren en wortels werden sinds de start van het experiment in 2014 verschillende keren verzameld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Veldexperiment 2 testte de gevolgen van GBP-residuen in mestmeststof voor twee meerjarige gewassen en de bijbehorende microbiota. Beddengoed verzameld uit een 12 maanden durend volière-experiment met Japanse kwartels gevoed met controle- of GBP-besmet voer werd gebruikt als mestmeststof in een veldexperiment. Het experimentele veld bestond uit 18 besturings- en 18 GBP-percelen (1 m x 1 m) gerangschikt in een schaakbordraster van 6 x 6. Het beddengoed werd twee keer verspreid op het proefveld, in augustus 2018 en mei 2019 (25 L / plot). De controlepercelen werden bemest met strooisel dat werd verzameld van kwartels die werden gevoed met controlevoer en GBP-percelen met strooisel van kwartels die werden gevoed met met GBP besmet voer. Glyfosaatresiduen in controlebedden waren 0,17 mg /kg glyfosaat en in GBP-beddengoed was de hoeveelheid 158 mg / kg glyfosaat. Twee endofytensymbiotische (E+), twee endofytenvrije (E-) Festuca pratensis en twee Fragaria x vescana werden per perceel geplant in september 2018, ongeveer een maand na de verspreiding van de eerste beddingen. Metingen van de prestaties en fitheid van planten, evenals bemonstering voor wortel- en bladgerelateerde microbiota werden uitgevoerd tijdens twee opeenvolgende groeiseizoenen (2019 en 2020). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Analyse van de microbiële taxa met behulp van het 16S-rRNA-gen / ITS-gebied en gevoeligheid van microbiomen voor glyfosaat met behulp van het EPSPS-gen . (A) Analyse van 16S-rRNA- of ITS-sequenties om microbiële taxa te identificeren. (B) Analyse van EPSPS-sequenties om de gevoeligheid van microben voor glyfosaat te identificeren (GS-glyfosaatgevoelig/GR-glyfosaatresistent) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Algoritme om de klasse van EPSPS-eiwitsequenties te identificeren. De invoer is een EPSPS-eiwitsequentie in FASTA-formaat. Het algoritme voert vergelijkingen uit met bekende aminozuurmarkers in referentie-eiwitsequenties die de potentiële gevoeligheid voor glyfosaat bepalen. Het algoritme werd geïmplementeerd op de vrij toegankelijke webserver EPSPSClass29. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Basis in- en uitgangen van de EPSPSClass webserver. (A) Input: een EPSPS-eiwitsequentie in FASTA-formaat. (B) Output 1 – identiteit: fractie van aminozuurmarkers aanwezig in de querysequenties (klassen I-IV) en motieven (klasse III). (C) Output 2 – identiteit: uitlijningen van de query- en referentiesequenties. (D) Uitvoer 3 – paarsgewijze uitlijningen van de query- en referentiesequenties. (E) Referentie EPSPS-sequenties: Vibrio cholerae (vcEPSPS, klasse I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, klasse II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, klasse III), Streptomyces davawensis (sdEPSPS, klasse IV). (F) Links om add-blastp-zoekopdrachten uit te voeren en geconserveerde domeinen te identificeren Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7: Toegang tot vooraf berekende datasets van EPSPS-sequenties. Volg de aanwijzingen in de afbeelding om toegang te krijgen tot de vooraf berekende dataset van EPSPS-sequenties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 8: Voorbeeld van het schatten van de potentiële gevoeligheid in microbioomprojecten zonder EPSPS-sequenties. Het voorbeeld gebruikt waarden uit de database van Alignable Tight Genomic Clusters30, die sequenties van prokaryote soorten bevat. Hypothetische soorten uit een microbioomproject zijn Staphylococcus aureus, Corynebacterium diphtheriae, Campylobacter jejuni, Chlamydia psittaci en Sulfolobus islandicus. De gevoeligheidsscore voor glyfosaat wordt berekend als Number_Sensitive_Sequences/Total_Number_Of_Sequences. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 9: Schema van de interpretatie van de resultaten van dit protocol en hypothetische evolutionaire scenario’s. (A) In een microbioom is het aandeel potentiële gevoeligheid (in groen) en resistentie (in rood) bacteriën ongeveer 50:50. Zwarte stippen duiden op microbiële soorten die niet zijn geclassificeerd; hun gevoeligheid voor glyfosaat is dus onbekend. In sommige microbiomen is het aandeel gevoelige bacteriën iets hoger, zoals in het menselijke darmmicrobioom12. (B) Na verloop van tijd kan het gebruik van glyfosaat leiden tot microbiële dysbiose (d.w.z. een onbalans in het aandeel gevoelige en resistente bacteriën), wat leidt tot verschillende hypothetische scenario’s. (C) Hypothetisch geval 1 (geen selectie): Het gebruik van glyfosaat heeft geen invloed op het microbioom; zo blijft het aandeel gevoelige en resistente bacteriën constant. (D) Hypothetisch geval 2: Het gebruik van glyfosaat verwijdert bacteriën die gevoelig zijn voor glyfosaat uit de populatie. We speculeren dat dit scenario dosisafhankelijk kan zijn. (E) Hypothetisch geval 3: Selectiedruk door het gebruik van glyfosaat verbetert mutaties in het EPSPS-gen die de gevoeligheidsstatus van bacteriën veranderen. Zo wordt de hele microbiële populatie resistent tegen glyfosaat. Bovendien kan er in dit scenario een toename zijn van multiresistente bacteriën. (F) Hypothetisch geval 4: het gebruik van glyfosaat verandert de samenstelling van bepaalde bacteriesoorten, waardoor een onevenwicht ten opzichte van resistente bacteriën ontstaat, terwijl sommige bacteriesoorten ongewijzigd blijven, mogelijk als gevolg van aanvullende resistente mechanismen zoals effluxpompen of door overexpressie van het EPSPS-gen 13. Dit scenario kan ook leiden tot een toename van glyfosaatresistente bacteriën, evenals een toename van bacteriële resistentie tegen extra antibiotica. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 10: Verdeling van de voorspelde gevoeligheid voor glyfosaat over de soort boom. Cirkeldiagrammen geven het aandeel soorten aan dat vermoedelijk gevoelig (groen) of resistent (rood) is voor glyfosaat en niet geclassificeerd (zwart). Dit cijfer is aangepast met toestemming van Rainio et al.14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 11: In- en uitgangen van de EPSPSClass webserver om de eigen referentiesequentie van de gebruiker te testen. (A) Input 1: query sequence. (B) Ingang 2: referentievolgorde. (C) Input 3: aminozuurmarkers in de referentiesequenties. (D) Output: identiteit: fractie van aminozuurmarkers in de querysequenties (klasse I-IV en de eigen referentiesequenties van de gebruiker). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Tabel 1: Lijst van primers voor PCR-amplificatie van het 16S rRNA-gen en ITS-gebied in microbioomanalyse Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 2: Codes van het enzym 5-enolpyruvylshikimaat-3-fosfaatsynthase (EPSPS) in verschillende databases Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 3: Gemiddelde glyfosaatconcentratie Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 4: Overzichtstabel van het percentage soorten dat gevoelig/resistent is tegen glyfosaat. Deze tabel is aangepast met toestemming van Rainio et al.14. Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 5: Posities van de aminozuurmarkers in de referentiesequenties Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

Dit protocol biedt algemene richtlijnen voor het kwantificeren van het effect van GBP op microbiomen op basis van de analyse van het EPSPS-eiwit. Het protocol heeft drie belangrijke kritische stappen: (i) Kwantificering van het EPSPS-eiwit uit microbioomgegevens. Deze stap is van cruciaal belang omdat EPSPS het directe doelenzym van het herbicide is. Soorten die een kopie van het EPSPS-gen hebben, kunnen dus worden beïnvloed door het gebruik van GBP. Niettemin kunnen zelfs soorten die geen kopie van het EPSPS-gen hebben, door het herbicide worden beïnvloed via alternatieve niet-doelmechanismen43,44. (ii) Als de analyse van het EPSPS-gen niet is opgenomen in de opzet van het onderzoek, is het mogelijk om een goede schatting te krijgen door het 16S-rRNA (bacteriën) of ITS (schimmels) te analyseren. In dit geval is het essentieel om te vertrouwen op een uitgebreide referentietabel (de ATGC-database biedt bijvoorbeeld sequenties van het EPSPS-eiwit van verschillende nauw verwante soorten). iii) Het EPSPS-eiwit is verdeeld in potentieel gevoelig of resistent tegen glyfosaat, afhankelijk van bepaalde aminozuurresiduen van de werkzame plaats van het EPSPS. Mutaties die van invloed zijn op een enkel aminozuur kunnen deze classificatieechter veranderen 45 en overgangen tussen klassen kunnen in een relatief korte periode optreden14.

De potentiële gevoeligheid van organismen voor glyfosaat kan worden bepaald door referentiegenomen, aminozuurmarkers en sequentie-uitlijningen. i) Referentiegenomen: Het EPSPS-enzym kan worden ingedeeld als potentieel gevoelig (klasse I [alfa of bèta]46,47) of resistent (klasse II48,49, III50 en IV51) voor glyfosaat op basis van de aanwezigheid van aminozuurmarkers en -motieven (in het geval van klasse III). Deze aminozuurmarkers en -motieven zijn gebaseerd op de locatie van aminozuurresiduen in het EPSPS-eiwit van Vibrio cholerae (vcEPSPS, klasse I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, klasse II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, klasse III) en Streptomyces davawensis (sdEPSPS, klasse IV). (ii) Aminozuurmarkers: Glyfosaat interageert met het EPSPS-enzym en concurreert met fosfoenolpyruvaat (PEP, het tweede substraat van het EPSPS-enzym)52,53. Bij bepaalde soorten zorgen kleine aminozuurveranderingen in de EPSPS-sequentie voor een hogere affiniteit voor de PEP en een resistentie tegen glyfosaat 12,14,52,54,55. In andere sequenties bindt glyfosaat de EPSPS-sequentie in een niet-remmende conformatie 45. Hoewel veel resistente 12,14,48,49,52,54,55 en tolerante 56,57 EPSP-sequenties tegen glyfosaat zijn beschreven, is het huidige classificatiesysteem voor de EPSPS verdeeld in vier hoofdklassen (I-IV )12 (tabel 5 ). (iii) Sequentie-uitlijningen: Om een EPSPS-enzym te classificeren, voerden we paarsgewijze uitlijningen uit, met een programma voor meerdere sequentie-uitlijningsprogramma-standaardparameters35-, van de querysequentie tegen elk van de referentiesequenties (vcEPSPS, cbEPSPS, bvEPSPS en sdEPSPS). Deze uitlijningen zijn nodig om de posities van de aminozuurmarkers in de queryvolgorde te identificeren. Als gevolg hiervan wordt een enzym geclassificeerd als beschreven12-klasse I, II en /of IV op basis van de aanwezigheid van aminozuurmarkers en op klasse III gebaseerde motiefmarkers.

Het protocol is gebaseerd op vier bekende soorten EPSPS: één type is gevoelig, de andere drie zijn resistent). Ongeveer 10% van de EPSPS-sequenties in prokaryoten is echter nog niet geclassificeerd (16% in archaea en 8% in bacteriën)12. Verder onderzoek moet die sequenties dus analyseren om de gevoeligheid voor glyfosaat te bepalen. De EPSPSClass-server biedt een optie om nieuwe genetische markers te testen. De identificatie van bekende klassen van de EPSPS is eenvoudig, zoals aangegeven in punt 4.4. en figuur 5. Bovendien biedt de server in die gevallen waarin gebruikers hun eigen query- en referentie-eiwitten willen vergelijken, een optie om handmatig een referentiesequentie en een set aminozuurmarkers op te nemen (figuur 11). Deze optie kan worden gebruikt om nieuwe klassen van de EPSPS te identificeren, evenals om andere herbiciden en doelsequenties te testen.

De analyse van de EPSPS-klasse wordt bepaald door sequentieanalyse en de aan-/afwezigheid van aminozuurmarkers. Dit is een voorlopige schatting die kan worden gebruikt voor het testen van hypothesen in het veld. Aminozuurmarkers zijn bepaald in de literatuur op basis van empirische en observationele studies 46,47,48,49,50,51. Referentie-eiwitsequenties om de EPSPS-klasse te bepalen zijn echter slechts in een beperkt aantal soorten getest en kunnen af en toe de resistentie tegen glyfosaat niet verklaren. Het effect van compenserende mutaties en EPSPS-geassocieerde domeinen (meestal in schimmels) kan ook de gevoeligheid voor glyfosaatbeïnvloeden 58. De analyse van dit artikel is gebaseerd op vier EPSPS-klassen. Een onderzoek naar bacteriën in het menselijke darmmicrobioom toonde aan dat ongeveer 30% van hen niet geclassificeerd was (d.w.z. EPSPS-eiwitten van deze soorten behoren niet tot een van de bekende klassen), en aanvullende studies zijn nodig om andere EPSPS-klassen te identificeren. Ook moet worden opgemerkt dat de EPSPS-eiwitsequentie in bacteriën en planten unidomain is, terwijl schimmel EPSPS-eiwitten verschillende domeinen bevatten59. Een eiwitvouwing in schimmels kan dus leiden tot een andere reactie van het EPSPS-enzym op glyfosaat. Bovendien worden aanvullende niet-doelmechanismen van resistentie (bijv. effluxpompen en overexpressie van het EPSPS-gen 13) of gevoeligheid voor glyfosaat (bijv. het effect van glyfosaat op de mitochondriale transportketen12) niet in aanmerking genomen.

Hoewel GBP’s al sinds 1974 bestaan als herbicide en sinds 1991 op grote schaal worden gebruikt, is dit de eerste bio-informaticamethode om de potentiële gevoeligheid van organismen voor glyfosaat te bepalen. De methode is gebaseerd op de identificatie van bekende aminozuurresiduen in de doelsequentie. Onze methode geeft dus een basisschatting van het potentiële effect van glyfosaat op de soort. In de nabije toekomst moeten nieuwe bioinformaticamethoden aanvullende klassen van het EPSPS-eiwit omvatten om de potentiële gevoeligheid voor glyfosaat van niet-geclassificeerde sequenties te bepalen 12,54,55. Aangezien het exacte gedrag van het EPSPS-enzym kan variëren door afzonderlijke aminozuurveranderingen 12,14,52,54,55, moeten verdere in silico-experimenten rekening houden met kleine variaties in de vouwing van het EPSPS-eiwit, evenals het effect van de EPSPS-geassocieerde domeinen op de eiwitstructuur in schimmels58 . Bovendien is aangetoond dat tolerantie voor glyfosaat kan worden geproduceerd door overexpressie van het EPSPS-eiwit56,57; bioinformatica-analyses op basis van de verbetering van het codongebruik 60 kunnen dus worden gebruikt om nieuwe EPSPS-sequenties te identificeren die genexpressie maximaliseren of minimaliseren.

Boeren, politici en besluitvormers hebben dringend behoefte aan een grondig begrip van de risico’s die gepaard gaan met het zware gebruik van pesticiden. Dus zowel bioinformatische hulpmiddelen die de potentiële gevoeligheid van organismen voor pesticiden onthullen als goed gerepliceerde, gerandomiseerde en veldrealistische experimentele studies uitgevoerd in verschillende omgevingen zijn noodzakelijk. De gepresenteerde bioinformatische methode die is ontworpen om de gevoeligheid van organismen voor glyfosaat te onderzoeken, kan worden gemoduleerd voor andere pesticiden. Evenzo kunnen de methoden van experimentele ecologie worden toegepast om gerelateerde ecologische vragen te bestuderen. Samen kunnen de methoden worden gebruikt om slachtoffers tussen veldobservaties, genomische gegevens en pesticidengebruik aan te tonen. Alle gepresenteerde methoden zijn van onschatbare waarde bij de risicobeoordeling. Bioinformatische methoden kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt bij het monitoren van microbiële aanpassingen aan agrochemicaliën en om een kwantitatieve methode te bieden om de potentiële andere geassocieerde risico’s te testen, zoals een toename van de resistentie van pathogenen tegen agrochemicaliën, negatieve effecten op microben die worden gebruikt als biologische bestrijders in geïntegreerde plaagbestrijding (IPM) en antibioticaresistentie bij bacteriën.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gefinancierd door de Academie van Finland (subsidie nr. 311077 aan Marjo Helander).

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument INVITEK Molecular 1037100300 Genomic DNA extraction from plant tissues
dNTP mix (10 mM each) BIO-RAD 1852196 For PCR reactions
GoTaq G2 DNA Polymerase kit Promega M7848 PCR buffer and DNA Polymerase for PCR amplification
Invisorb Spin Plant Mini Kit Agilent G2939B To check the concentration and quality of PCR products
Ion Chip Minifuge sage science PIP0001 For size fractionation of PCR amplicons
Ion PGM System ThermoFisher Scientific 4462921 For targeted sequencing of microbial PCR products
Ion PGM Torrent Server ThermoFisher Scientific 4483643 For targeted sequencing of microbial PCR products
Pippinprep ThermoFisher Scientific 4479672 For targeted sequencing of microbial PCR products
Pressure tank Berthoud 102140 For sprayin glyphosate based products in field
Primers ThermoFisher Scientific R0192 For PCR amplification
Rotary tiller Grillo 984511 For tilling the soil in experimental plots
S1000 ThermalCycler Sigma-Aldrich Custom-made For PCR amplification
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams, G. M., Kroes, R., Munro, I. C. Safety evaluation and risk assessment of the herbicide Roundup and its active ingredient, glyphosate, for humans. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 31, 117-165 (2000).
  2. Muola, A., et al. Risk in the circular food economy: Glyphosate-based herbicide residues in manure fertilizers decrease crop yield. The Science of the Total Environment. 750, 141422 (2021).
  3. Helander, M., Saloniemi, I., Saikkonen, K. Glyphosate in northern ecosystems. Trends in Plant Science. 17 (10), 569-574 (2012).
  4. Fuchs, B., Saikkonen, K., Helander, M. Glyphosate-Modulated Biosynthesis Driving Plant Defense and Species Interactions. Trends in Plant Science. 26 (4), 312-323 (2021).
  5. Helander, M., Saloniemi, I., Omacini, M., Druille, M., Salminen, J. -. P., Saikkonen, K. Glyphosate decreases mycorrhizal colonization and affects plant-soil feedback. The Science of the Total Environment. 642, 285-291 (2018).
  6. Bai, S. H., Ogbourne, S. M. Glyphosate: environmental contamination, toxicity and potential risks to human health via food contamination. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (19), 18988-19001 (2016).
  7. Cuhra, M., Bøhn, T., Cuhra, P. Glyphosate: too much of a good thing. Frontiers in Environmental Science. 4, (2016).
  8. de Brito Rodrigues, L., et al. Impact of the glyphosate-based commercial herbicide, its components and its metabolite AMPA on non-target aquatic organisms. Mutation Research. 842, 94-101 (2019).
  9. Steinrücken, H. C., Amrhein, N. The herbicide glyphosate is a potent inhibitor of 5-enolpyruvylshikimic acid-3-phosphate synthase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 94 (4), 1207-1212 (1980).
  10. Bentley, R. The shikimate pathway–a metabolic tree with many branches. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 25 (5), 307-384 (1990).
  11. Richards, T. A., et al. Evolutionary origins of the eukaryotic shikimate pathway: gene fusions, horizontal gene transfer, and endosymbiotic replacements. Eukaryotic Cell. 5 (9), 1517-1531 (2006).
  12. Leino, L., et al. Classification of the glyphosate target enzyme (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) for assessing sensitivity of organisms to the herbicide. Journal Of Hazardous Materials. 408, 124556 (2021).
  13. Rainio, M. J., Ruuskanen, S., Helander, M., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Puigbò, P. Adaptation of bacteria to glyphosate: a microevolutionary perspective of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP) synthase. BioRxiv. , (2020).
  14. Rainio, M. J., Ruuskanen, S., Helander, M., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Puigbò, P. Adaptation of bacteria to glyphosate: a microevolutionary perspective of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase. Environmental Microbiology Reports. 13 (3), 309-316 (2021).
  15. Helander, M., Pauna, A., Saikkonen, K., Saloniemi, I. Glyphosate residues in soil affect crop plant germination and growth. Scientific Reports. 9 (1), 19653 (2019).
  16. Ruuskanen, S., Rainio, M. J., Uusitalo, M., Saikkonen, K., Helander, M. Effects of parental exposure to glyphosate-based herbicides on embryonic development and oxidative status: a long-term experiment in a bird model. Scientific Reports. 10 (1), 6349 (2020).
  17. Ruuskanen, S., et al. female preference and adverse developmental effects of glyphosate-based herbicides on ecologically relevant traits in Japanese quails. Environmental Science & Technology. 54 (2), 1128-1135 (2020).
  18. Mäki, A., Rissanen, A. J., Tiirola, M. A practical method for barcoding and size-trimming PCR templates for amplicon sequencing. Biotechniques. 60 (2), 88-90 (2016).
  19. Chelius, M. K., Triplett, E. W. The diversity of archaea and bacteria in association with the roots of Zea mays L. Microbial Ecology. 41 (3), 252-263 (2001).
  20. Lane, D. J. 16S/23S rRNA sequencing. Nucleic acid techniques in bacterial systematics. , 115-175 (1991).
  21. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. Plos One. 8 (8), 71360 (2013).
  22. Zheng, D., Alm, E. W., Stahl, D. A., Raskin, L. Characterization of universal small-subunit rRNA hybridization probes for quantitative molecular microbial ecology studies. Applied and Environmental Microbiology. 62 (12), 4504-4513 (1996).
  23. . JoVE Supplementary Material Available from: https://ppuigbo.me/programs/EPSPSClass/JOVE_SM (2021)
  24. . Alignments Conserved Positions Available from: https://ppuigbo.me/programs/primers (2021)
  25. . NCBI GenBank Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/genbank (2021)
  26. . COG Database Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/research/cog (2021)
  27. . Protein Data Bank Available from: https://www.rcsb.org (2021)
  28. . EPSPSClass Available from: https://ppuigbo.me/programs/EPSPSClass (2021)
  29. Kristensen, D. M., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. ATGC database and ATGC-COGs: an updated resource for micro- and macro-evolutionary studies of prokaryotic genomes and protein family annotation. Nucleic Acids Research. 45, 210-218 (2017).
  30. . CSC – IT CENTER FOR SCIENCE LTD Available from: https://www.csc.fi (2021)
  31. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).
  32. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research. 32 (5), 1792-1797 (2004).
  33. Tkacz, A., Hortala, M., Poole, P. S. Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples. Microbiome. 6 (1), 110 (2018).
  34. El-Gebali, S., et al. The Pfam protein families database in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 427-432 (2019).
  35. Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, 36-42 (2013).
  36. Galperin, M. Y., Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. Expanded microbial genome coverage and improved protein family annotation in the COG database. Nucleic Acids Research. 43, 261-269 (2015).
  37. Burley, S. K., Berman, H. M., Kleywegt, G. J., Markley, J. L., Nakamura, H., Velankar, S. Protein data bank (PDB): the single global macromolecular structure archive. Methods in Molecular Biology. 1607, 627-641 (2017).
  38. Raoult, D., Hadjadj, L., Baron, S. A., Rolain, J. -. M. Role of glyphosate in the emergence of antimicrobial resistance in bacteria. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76 (7), 1655-1657 (2021).
  39. Liu, J., Gefen, O., Ronin, I., Bar-Meir, M., Balaban, N. Q. Effect of tolerance on the evolution of antibiotic resistance under drug combinations. Science. 367 (6474), 200-204 (2020).
  40. Peixoto, F. Comparative effects of the Roundup and glyphosate on mitochondrial oxidative phosphorylation. Chemosphere. 61 (8), 1115-1122 (2005).
  41. Peillex, C., Pelletier, M. The impact and toxicity of glyphosate and glyphosate-based herbicides on health and immunity. Journal of Immunotoxicology. 17 (1), 163-174 (2020).
  42. Funke, T., Han, H., Healy-Fried, M. L., Fischer, M., Schönbrunn, E. Molecular basis for the herbicide resistance of Roundup Ready crops. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 13010-13015 (2006).
  43. Light, S. H., Krishna, S. N., Minasov, G., Anderson, W. F. An unusual cation-binding site and distinct domain-domain interactions distinguish Class II Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases. Biochemistry. 55 (8), 1239-1245 (2016).
  44. Firdous, S., Iqbal, S., Anwar, S., Jabeen, H. Identification and analysis of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) gene from glyphosate-resistant Ochrobactrum intermedium Sq20. Pest Management Science. 74 (5), 1184-1196 (2018).
  45. Barry, G. F., Kishore, G. M., Padgette, S. R., Stallings, W. C. Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases. United States Patient. , (1997).
  46. Priestman, M. A., Funke, T., Singh, I. M., Crupper, S. S., Schönbrunn, E. 5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Staphylococcus aureus is insensitive to glyphosate. FEBS Letters. 579, 728-732 (2005).
  47. Carozzi, N., Carr, B., Hammer, P. E. Identification of a new class of EPSP synthases. World Intellectual Property Organization Publ.of the Int.Appl. without Int.search. , (2006).
  48. Lira, J. M., Cicchillo, R. M., Nair, S. K. Novel class of glyphosate resistance genes. US Patent. , (2013).
  49. Funke, T., et al. Structural basis of glyphosate resistance resulting from the double mutation Thr97 -> Ile and Pro101 -> Ser in 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 284 (15), 9854-9860 (2009).
  50. Schönbrunn, E., et al. Interaction of the herbicide glyphosate with its target enzyme 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase in atomic detail. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (4), 1376-1380 (2001).
  51. Stalker, D. M., Hiatt, W. R., Comai, L. A single amino acid substitution in the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase confers resistance to the herbicide glyphosate. The Journal of Biological Chemistry. 260 (8), 4724-4728 (1985).
  52. Eschenburg, S., Healy, M. L., Priestman, M. A., Lushington, G. H., Schönbrunn, E. How the mutation glycine96 to alanine confers glyphosate insensitivity to 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli. Planta. 216 (1), 129-135 (2002).
  53. Achary, V. M. M., et al. Overexpression of improved EPSPS gene results in field level glyphosate tolerance and higher grain yield in rice. Plant Biotechnology Journal. 18 (12), 2504-2519 (2020).
  54. Huang, Z., Liu, Y., Zhang, C., Jiang, C., Huang, H., Wei, S. Molecular basis of natural tolerance to glyphosate in Convolvulus arvensis. Scientific Reports. 9 (1), 8133 (2019).
  55. Tall, T. . A census analysis of the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP) synthase and EPSP-associated domains. , (2020).
  56. Tall, T., Puigbò, P. The glyphosate target enzyme 5-Enolpyruvyl Shikimate 3-Phosphate Synthase (EPSPS) contains several EPSPS-associated domains in fungi. ATLA Summary of Proceedings. 76 (1), 6 (2020).
  57. Puigbò, P., Guzmán, E., Romeu, A., Garcia-Vallvé, S. OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Research. 35, 126-131 (2007).

Tags

GlyphosateMicrobiome16S RRNAExperimental DesignPlant SamplesQuail BeddingPCR AmplificationDNA ExtractionBioinformatics Workflow

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Mathew, S. A., Muola, A., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Helander, M., Puigbò, P. Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes. J. Vis. Exp. (179), e63109, doi:10.3791/63109 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image