JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

Glifosat Bazlı Ürünlerin Mikrobiyomlar Üzerindeki Potansiyel Etkisinin Ölçülmesi

Published: January 10, 2022
doi:
10.3791/63109
, , , , ,
1Biodiversity Unit,University of Turku, 2Department of Biology,University of Turku, 3Nutrition and Health Unit,Eurecat Technology Centre of Catalonia, 4Department of Biochemistry and Biotechnology,Rovira i Virgili University

Summary

Glifosat bazlı ürünler (GBP), dünya çapında en yaygın geniş spektrumlu herbisitlerdir. Bu makalede, GBP’nin mikrobiyomlar üzerindeki etkisini ölçmek için saha deneylerinden biyoinformatik analizlere kadar genel kılavuzlar sunuyoruz.

Abstract

Glifosat bazlı ürünler (GBP), dünya çapında en yaygın geniş spektrumlu herbisitlerdir. Glifosatın hedefi, bitkilerde neredeyse evrensel olan shikimate yolundaki 5-enolpiruvylshikimate-3-fosfat sentaz (EPSPS) enzimidir. Enzimin inhibisyonu üç esansiyel amino asidin üretimini durdurur: fenilalanin, tirozin ve triptofan. EPSPS ayrıca arkeler ve bakteriler gibi mantar ve prokaryotlarda da bulunur; Bu nedenle, GBP kullanımı toprakların, bitkilerin, otoburların ve ikincil tüketicilerin mikrobiyom bileşimi üzerinde bir etkiye sahip olabilir. Bu makale, GBP’nin saha deneylerinden biyoinformatik analizlere kadar mikrobiyomlar üzerindeki etkisini değerlendirmek için genel kılavuzlar sunmayı ve birkaç test edilebilir hipotez sunmayı amaçlamaktadır. GBP’yi hedef olmayan organizmalar üzerinde test etmek için iki saha deneyi sunulmuştur. İlk olarak, 10 çoğaltılmış kontrolden bitki ile ilişkili mikroplar ve no-till kırpmayı simüle eden GBP arıtma arazileri örneklenir ve analiz edilir. İkinci deneyde, glifosat kalıntıları içeren kanatlı hayvan gübresi veya işlenmemiş kontrol gübresi ile döllenmiş deneysel arazilerden örnekler elde edilmiştir. EPSPS protein dizilerinin biyoinformatik analizi, mikropların glifosata karşı potansiyel duyarlılığını belirlemek için kullanılır. GBP’nin mikrobiyomlar üzerindeki etkisini tahmin etmenin ilk adımı, hedef enzime (EPSPS) potansiyel duyarlılıklarını belirlemektir. Mikrobiyal sekanslar ya halka açık depolardan ya da PCR amplifikasyonu yoluyla elde edilebilir. Bununla birlikte, saha çalışmalarının çoğunda, mikrobiyom bileşimi, 16S rRNA ve dahili transkribe edilmiş aralayıcı (ITS) gibi evrensel DNA belirteçlerine dayanarak belirlenmiştir. Bu durumlarda, glifosata duyarlılık ancak yakından ilişkili türler kullanılarak EPSPS dizilerinin olasılıksal bir analizi ile tahmin edilebilir. EPSPS enzimine dayanan organizmaların glifosata karşı potansiyel duyarlılığının ölçülmesi, hedef ve hedef olmayan dirençli mekanizmaları incelemek için daha ileri deneyler için sağlam bir yaklaşım sağlar.

Introduction

Modern tarımda pestisitlerin yoğun kullanımı, biyolojik çeşitliliğin azalmasına açıkça büyük katkıdabulunmaktadır 1. Bu makale glifosata odaklanmaktadır, çünkü glifosat bazlı ürünler (GBP’ler), verimlilikleri ve uygun fiyatları nedeniyle küresel olarak en yaygın kullanılan pestisitler haline gelmiştir 2,3. Tarım alanlarındaki yabani otları öldürmenin yanı sıra, GBP’ler silvikültürde, kentsel ortamlarda ve ev bahçelerinde yaygın olarak kullanılmaktadır; Ek olarak, üreticinin talimatlarına uygun olarak kullanıldığında, hedef olmayan organizmalar için toksik olmayan olarak ilan edilmiştir. Bununla birlikte, giderek artan sayıda yeni çalışma, glifosat kalıntılarının ve bozunma ürünlerinin topraklarda tutulabileceğini ve taşınabileceğini, böylece hedef olmayan organizmalar üzerinde basamaklı etkilere sahip olabileceğini ortaya koymuştur 4,5,6,7,8 . Glifosatın etkileri sadece bitkilerle sınırlı değildir – shikimate yolu birçok mantar ve prokaryotta da mevcuttur. Glifosat, aroA9 olarak da bilinen shikimate yolundaki 5-enolpiruvylshikimate-3-fosfat sentaz (EPSPS) enzimini hedefler. Bu enzim, üç temel aromatik amino asidin (fenilalanin, tirozin ve triptofan) sentezinde shikimat yolunun merkezindedir ve çoğu prokaryotta, bitkide ve mantarda bulunur10,11. Bazı mikrobiyal türler, EPSPS dizilerindeki mutasyonlar da dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalar vasıtasıyla glifosata karşı kısmi veya mutlak direnç geliştirmiştir. Bu nedenle, GBP’lerin kullanımının, insan bağırsak mikrobiyomu12,13,14 de dahil olmak üzere bitki ve hayvan mikrobiyomları üzerinde doğrudan bir etkisi olabileceği öne sürülmüştür. Bununla birlikte, GBP kullanımı, mikroplara ve mikropların kolaylaştırdığı süreçlere dayanan hemen hemen her ekosistem işlevi ve hizmeti üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olabilir. Bunun sonucunda ortaya çıkan tehditler biyokimyasal toprak süreçleri, tozlaşma biyolojisi ve hayvan ve insan refahı ile ilgili olabilir. Bu, glifosatın shikimat yollarını nasıl etkilediğinin ve mikropların glifosata duyarlılığını değerlendirmek için yöntemlerin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını gerektirir.

Bu protokolde, glifosat ve GBP’nin mikrobiyom üzerindeki etkisini, saha deneylerinden biyoinformatik analizlere kadar test etmek için bir boru hattı sunuyoruz. Organizmaların glifosata karşı potansiyel duyarlılığını belirlemek için kullanılabilecek yakın zamanda yayınlanmış bir biyoinformatik yöntemini ayrıntılı olarak açıklıyoruz12. Araştırmacıların bilgisine göre, bu, EPSPS enziminin GBP’lerin aktif bileşenine içsel duyarlılığını değerlendiren ilk ve şimdiye kadarki tek biyoinformatik araçtır. Bu biyoinformatik yöntem, glifosat hedef enziminde (EPSPS) bilinen amino asit belirteçlerinin tespitine dayanmaktadır12. Boru hattı beş ana çalışma aşamasına ayrılmıştır (Şekil 1): 1) GBP’lerin etkisini test etmek için iki saha deneyine kısa bir giriş, 2) mikrobiyom analizlerinin kısa bir özeti (16S rRNA, ITS ve EPSPS geni), 3) halka açık depolardan EPSPS dizileri toplamak, 4) organizmaların glifosata potansiyel duyarlılığını belirlemek ve 5) EPSPS sınıfını evrensel mikrobiyal belirteçlerden (16S rRNA ve ITS) değerlendirmek.

Protocol

1. GBP’lerin etkisini test etmek için iki saha deneyi NOT: Bu protokol, GBP’lerin bitki ile ilişkili mikroplar üzerindeki etkisini test etmek için iki saha deney tasarımı örneği sunmaktadır. Her iki deney de Finlandiya’daki Turku Ruissalo Üniversitesi Botanik Bahçesi’nde (60º26’N, 22º10’E) daha önce herbisit veya tarımsal kullanım öyküsü olmayan ayrılmış alanlarda gerçekleştirildi. Toprak, yüksek oranda organik madde içeren kumlu kildir. Deney 1NOT: Bu deney, yabani otlarla mücadele etmek için büyüme mevsiminden önce ve sonra GBP uygulamaları ile no-till tarımın genel tarımsal uygulamalarını simüle etmek için tasarlanmıştır. Deney alanını, araziler arasında tampon bitki örtüsü şeritleri ile 10 çoğaltılmış kontrol ve GBP arıtma parseline (23 m x 1,5 m) bölün ( bu çalışmada 2014 ilkbaharında15) (Şekil 2). Arazilerin döner bir yeke ile 5 cm derinliğe kadar sürüldüğünden ve yılda iki kez işlendiğinden emin olun. Burada, arsalar büyüme mevsiminin başında (Mayıs) ve sonunda (Ekim) ele alındı. Kontrol parsellerini musluk suyuyla (5 L/arsa) ve GBP parsellerini ticari GBP (glifosat konsantrasyonu 450 g·) ile arıtın L-1, uygulama oranı arsa başına 5 L musluk suyunda 6.4 L·ha-1) tarımsal uygulamalarda izin verilen maksimum glifosat dozajını taklit etmek için (3 kg · ha-1). İşlemleri, manuel püskürtücüsü olan elle çalıştırılan bir basınç tankı ile uygulayın. GBP uygulamasından iki hafta sonra, tarımsal uygulamalara göre arazilere yulaf (Avena sativa), faba fasulyesi (Vicia faba), şalgam tecavüzleri (Brassica rapa subsp. oleifera) ve bitki patatesi (Solanum tuberosum) ekin. Büyüme mevsimi boyunca, bitki rekabetini ve toprak yapısını kontrol ve GBP ile işlenmiş arazilerde mümkün olduğunca benzer tutmak için arazileri elle temizleyin. Mikrobiyotayı deneysel bitkilerden örnekleyin. Bu çalışmada, mikrobiyota, çalışma boyunca büyüme mevsimi başına bir kez GBP ile tedavi edilen ve kontrol edilen tedavi arazilerinde 2017’den 2020’ye kadar ardışık olarak örneklenmiştir. Tarladan bitki örneklerinin (kök ve yaprak) on kopyasını toplayın, derhal buzun üzerine yerleştirin ve bölüm 2.1’de açıklandığı gibi daha fazla işlem için laboratuvara getirin. Deney 2NOT: Bu deney, döngüsel gıda ekonomisi ile ilişkili riskleri test etmek için tasarlanmıştır; daha doğrusu, mahsul bitkilerine gübre olarak uygulanan gübredeki GBP kalıntılarının sonuçlarını incelemek üzere tasarlanmıştır2 (Şekil 3). 12 aylık bir kuş kafesi deneyinde16,17 GBP ile kirlenmiş veya kontrol yemleriyle beslenen bıldırcınlardan odun talaşı, dışkı ve bazı dökülmüş yemler de dahil olmak üzere yatak takımlarını toplayın.NOT: GBP ile kirlenmiş yem, yetişkin Japon bıldırcınlarında kilogram vücut kütlesi başına günlük 12-20 mg glifosat alımına karşılık gelen 160 mg glifosat / kg eşdeğeri ile birlikte tavukların döşenmesi için organik yemden oluşuyordu16,17. Doğrulama için, numuneleri altı parti yemde glifosat konsantrasyonu ölçümleri için akredite bir laboratuvara gönderin. Ek olarak, 12 ay maruz kaldıktan sonra bıldırcın dışkı örneklerinde glifosat kalıntılarını ölçün. Kontrol grubu,16,17 GBP ilavesi olmadan aynı organik yemle beslendi. Büyük kuş kafesi deneyi sırasında, yatakları iki haftada bir değiştirin. Kullanılan yatakları GBP muamele ve kontrollerinden 8-12 ay maruz kaldıktan sonra düzenli olarak toplayın, tedavi başına havuzlayın ve gübre olarak kullanmadan önce 6 ° C’de kuru, karanlık bir depoda kapalı kaplarda saklayın. Yatakların 12 L’sini, deney alanındaki 6 x 6 satranç tahtası ızgarasında iki zaman noktasında 18 GBP ve 18 kontrol parselinin (boyut 1 m x 1 m) her birine manuel olarak yayın. Bu çalışmada, yataklar Ağustos 2018’de ve Mayıs 2019’da yayılmıştır. Yatak numunelerini, yayıldıktan hemen sonra glifosat konsantrasyon ölçümleri için akredite bir laboratuvara gönderin (Mayıs 2019’daki bu çalışmada). Kök ve yaprak mikrobiyotalarını incelemek için her arsaya çok yıllık çim ve çilek bitkileri ekin.NOT: Bu çalışmada her bir parsaraya dört çok yıllık çim bitkisi (Festuca pratensis) ve iki çilek bitkisi (Fragaria x vescana) ekilmiş ve kök ve yaprak mikrobiyotaları için çalışılmıştır. 2. Mikrobiyom analizleri (16S rRNA, ITS ve EPSPS geni) NOT: Mikrobiyom çalışmalarının çoğu, yeni nesil dizileme teknolojilerini kullanarak mantar toplulukları için bakteriyel ve dahili transkribe edilmiş ara parça (ITS) bölgeleri için 16S rRNA geninin analizine dayanmaktadır. Bu nedenle, makale EPSPS’nin türü hakkında bilgi sahibi değildir. Binlerce türden EPSPS dizileri halka açık depolarda mevcuttur (Protokol bölüm 3) (Şekil 4). 16S rRNA geni Yukarıda açıklanan deneylerde toplanan müstakil yaprak ve kök örneklerinden, endofitik mikropları (yani, bitki dokularının içinde yaşayan mikropları) tanımlayın. Bitki örneklerini musluk suyuyla yıkayın ve daha sonra epifitik mikropları (yani bitki dokularının yüzeyindeki mikropları) gidermek için sterilize edin. 3 dakika boyunca% 3 ağartıcı, ardından 1 dakika boyunca% 70’lik bir etanol çözeltisi kullanarak sterilize edin ve her biri 1 dakika boyunca otoklavlanmış ultra saf suyla üç kez yıkayın. Genomik DNA ekstraksiyonuna kadar örnekleri -80 ° C’de dondurun. Üreticinin protokolünü izleyerek ticari olarak temin edilebilen bir bitki DNA ekstraksiyon kiti kullanarak genomik DNA ekstraksiyonu gerçekleştirin. Ekstrakte edilen DNA örneklerinden 16S rRNA geninin V6-V8 değişken bölgelerini, özellikle bakteriyel DNA18’e bağlanan ayırt edici primerlerle iç içe geçmiş bir yaklaşım kullanarak hedefleyin, böylece konakçı bitki DNA’sından amplifikasyonu en aza indirin. Üç tur polimeraz zincir reaksiyonundan (PCR) sonra, hedef geni sıralama için şablon olarak hazırlamak üzere barkod ve adaptör dizileriyle etiketleyin. PCR amplifikasyonu için 2.1.7- 2.1.11 adımlarını izleyin PCR ana karışımını gerekli sayıda numune için hazırlayın, böylece her reaksiyon 30 μLof toplam hacme sahip olur ve 30 ng DNA, 1x PCR tamponu, 0.2 mM dNTP, her primerin 0.3 μM’si ve 2000 U / mL DNA polimerazdan oluşur. PCR’nin ikinci ve üçüncü turları için aynı adımı izleyin. PCR’nin ilk turu için, 799F 19 ve1492R primerlerini kullanın (20’den değiştirilmiş) (Tablo 1). Amplifikasyon profilini termosikler üzerinde ayarlayın (95 ° C’de 3 dakikalık ilk denatürasyon, ardından 45 s için 95 ° C’de 35 döngü denatürasyon, 45 s için 54 ° C’de tavlama ve 1 dakika boyunca 72 ° C’de uzatma). Son uzatmayı 72 °C’de 5 dakika boyunca gerçekleştirin. PCR’nin ikinci turu için şablon olarak, elektroforez (% 1.5 agaroz jeli üzerindeki PCR ürünlerinin 5 μL’si) ile amplifikasyonu doğrulayın ve daha sonra PCR ürününün geri kalan 25 μL’sini otoklavlanmış ultra saf suda 1:10 oranında seyreltin. Seyreltilmiş PCR şablonları ve uni-1062F 21 ve uni-1390R22 primerleri ile PCR’yi tekrarlayın (Tablo 1). Döngü sayısını 25’e düşürmek dışında aynı PCR reaksiyon koşullarını ve amplifikasyon profilini (adım 2.1.8) koruyun. Elde edilen PCR ürünlerini otoklavlanmış ultra saf suda 1:1 oranında seyreltin. Ürünleri barkodlarla ve P1 adaptör dizisiyle, adım 2.1.8’de belirtildiği gibi aynı PCR profilinin 8 döngüsüyle etiketlemek için PCR’nin üçüncü turunu gerçekleştirin. Kütüphane hazırlığı PCR ürünlerinin konsantrasyonunu ve kalitesini bir biyoanalizör üzerinde doğrulayın ve bir equimolar kütüphane hazırlamak için her numunenin 30 ng DNA’sını oluşturan hacimleri 1.5 mL’lik bir tüpte toplayın. Bir agaroz jel kaseti üzerinde otomatik bir DNA boyutu seçim sistemi kullanarak boyut fraksiyonasyonuna göre 350-550 bp boyuttaki amplikonları seçin. Bunun, belirli olmayan amplifikonları ve PCR reaktiflerini kütüphaneden de ortadan kaldırdığını unutmayın. Belirtilen boyuttaki amplikonlardan oluşan elüdü kasetteki bir şişe halinde toplayın, saflaştırılmış bir 16S rRNA gen kütüphanesi ile sonuçlanır. Eleute’yi 1,5 mL’lik bir tüpe pipetle çıkarın ve biyoanalizör üzerindeki saflığı ve konsantrasyonu doğrulayın. DNA kütüphanesini otoklavlanmış ultra saf su kullanarak 26 pM’lik son konsantrasyona kadar seyreltin; örnek sıralama için hazırdır. ONUNNOT: ITS bölgesi, ITS’ye özgü primerler kullanılarak büyütülür (Tablo 1) ve elde edilen PCR ürünü, sıralama için barkodlar ve bir P1 adaptör dizisi ile etiketlenir. PCR ana karışımını, ITS primerleri ile bölüm 2.1’de belirtilen protokole göre hazırlayın. Termosikler üzerindeki amplifikasyon profilini 95 ° C’de 5 dakikalık ilk denatürasyon, ardından 30 s için 95 ° C’de 35 döngü denatürasyon, tavlama ve uzatma, 30 s için 55 ° C, 1 dakika için 72 ° C ve 7 dakika boyunca son uzatma 72 ° C olarak ayarlayın. PCR ürününün 5 μL’sini % 1,5 agaroz jeli üzerinde analiz edin ve otoklavlanmış ultra saf su kullanarak kalan 25 μL’yi 1:10 arasında seyreltin. Seyreltilmiş PCR ürününü PCR’nin ikinci turu için şablon olarak kullanın. Barkod etiketli ileri astarlar ve P1 adaptörü etiketli geri astarlarla gerekli sayıda numune için PCR ana karışımını hazırlayın (adım 2.1.6’ya bakın). 8 döngü kullanmak dışında, adım 2.3.2’deki ile aynı amplifikasyon profiliyle yükseltin. Elde edilen PCR ürünlerini, bölüm 2.2’de belirtilen protokollere göre sıralama için hazırlayın. EPSPS geni Mikropların EPSPS genlerini sıralayın ve analiz edin.NOT: GBP maruziyetinin toplumdaki glifosata duyarlı ve dirençli mikropların bileşimini değiştirip değiştirmediğini bulmak için, mikropların EPSPS genlerinin sıralanması ve analiz edilmesi gerekir. Böylece, Hizalanabilir Sıkı Genomik Kümeler (ATGC) veritabanındaki geniş bir mikrobiyal takson koleksiyonundan 353 EPSPS gen dizisi toplandı ve tüm protein dizileri22 hizalandı. Bu hizalamalar ATGC veritabanı23’te mevcuttur ve korunan bölgelerden primerler oluşturmak için kullanılabilir. Kullanımı kolay bir biyoinformatik aracı, korunmuş bölgeleri çoklu dizi hizalamasından tanımlamak için tasarlanmıştır ve bu, Pere Puigbo araştırma sayfası24’te mevcuttur. Ancak, bu web sunucusunun ayrıntılı bir açıklamasını sağlamak bu yayının kapsamı dışındadır. Bununla birlikte, mikrobiyomun glifosata duyarlılığını bulmak için EPSPS geninin amplifikasyonu için bu primerleri kullanmak için prospektif bir protokol Şekil 4’te verilmiştir. 3. EPSPS protein dizilerinin kamu depolarından toplanması Makroevrim çalışmalarında kullanılacak EPSPS dizileri PFAM 23 (protein ailelerinin bir veritabanı 25), GenBank24 (genler, genomlar ve proteinlerin bir veritabanı26), COG 25 (Ortolog Grupların Kümeleri 27; arkea ve bakterilerden ortolog proteinlerin bir veritabanı); ve PDB26 (Protein Veri Bankası28; protein yapılarının bir veritabanı).NOT: Araştırmacılar tarafından yapılan yeni bir çalışma, bu proteinlerin, glifosatın shikimate yoluna sahip organizmalar üzerindeki potansiyel etkisinin mikroevrimsel ve karşılaştırmalı analizlerini yapmak için kullanılabileceğini göstermiştir12. Yazarlar, insan bağırsak mikrobiyomu12’den manuel olarak küratörlüğünde bir protein veri kümesi de dahil olmak üzere on binlerce EPSPS protein dizisi29 hakkında bilgi toplayan kullanıcı dostu bir web sitesi geliştirdiler. Bu önceden hesaplanmış veri kümelerindeki bilgiler, glifosata duyarlı ve dirençli olduğu varsayılan mevcut EPSPS sınıflandırmasını, türler hakkında taksonomik bilgileri, EPSPS aktif sitesinin ek açıklamalarını ve PDB ve NCBI veritabanlarına bağlantıları içerir. Ayrıca, web sunucusu EPSPS’nin kimlik kodlarını ve birkaç harici veritabanına bağlantılar içerir (Tablo 2). Mikroevrim çalışmalarında kullanılacak EPSPS dizileri ATGCNOT: Protein dizilerinin genel depoları, nispeten uzak organizmalar arasında karşılaştırmalı çalışmalar yürütmek için yararlıdır; Bununla birlikte, glifosatın potansiyel etkisi evrimsel açıdan nispeten yenidir. Bu nedenle, bazı çalışmalarda, glifosatın etkisini belirlemek için yakından ilişkili türleri (örneğin, aynı bakteri türünden farklı suşlar) karşılaştırmak gerekir14. Bu durumlarda, yakından ilişkili arkeal ve bakteriyel genomların kapsamlı bir listesini içeren Hizalanabilir Sıkı Genomik Kümeler (ATGC)30 veritabanı daha uygun bir kaynaktır. ATGC veritabanı, yüzlerce küme halinde organize edilmiş binlerce genomdan birkaç milyon proteinin bilgisini içerir30. Her genom kümesi hizalanabilir (genomlar, uzunluklarının% ≥85’inden fazlasında eş anlamlı bir ikame oranına sahip) ve sıkıdır (doygunluğun altında eş anlamlı bir ikame oranına sahiptir). Araştırmacılar, EPSPS proteinlerindeki mikroevrimsel değişiklikleri analiz etmek için yakın tarihli bir çalışmada ATGC veri setini kullandılar14. ATGC’deki EPSPS protein dizisini tanımlamak için aşağıdaki adımlar gereklidir: ATGC’lerin tüm veritabanınıbağlantı 31’den ve COG0128’in tüm proteinlerini (veritabanındaki EPSPS proteinlerine karşılık gelen kod)32’den yerel bir projeye indirin.NOT: Araştırmacılar/deneyciler Finlandiya’da bulunuyorsa, CSC-IT Bilim Merkezi33 depolama ve yazılım olanakları sağlar. Tüm dizileri FASTA formatında toplamak önemlidir. Temsili bir prokaryot türü kümesinde EPSPS proteininin ortologlarını içeren COG0128’in bir patlama veritabanı oluşturuldu. CSC, EPSPS dizilerinin referans veritabanını oluşturmak için makeblastdb -in COG0128.fa -dbtype prot komutunun kullanılmasına izin verenblast programı 34’ü önceden yüklemiştir. ATGC veritabanını, blastp -query [ATGC_X.fa] -db [COG0128.fa ] -max_target_seqs 1 -outfmt 6 -out tmpfile -evalue 1e-150 komutuyla yinelemeli bir blast araması kullanarak COG0128.fa (EPSPS proteinleri) ile eşleyin. Sonuç olarak, her birinde EPSPS protein dizilerinin bir veri kümesi oluşturur. ATGC veritabanından yakından ilişkili EPSPS protein dizilerinin önceden hesaplanmış bir veri kümesi mevcuttur29. 4. Organizmaların glifosata karşı potansiyel duyarlılığını belirlemek için algoritma (EPSPSClass web sunucusu: girişler, işleme ve çıktılar) NOT: Araştırmacılar, EPSPS protein dizilerinin 12,35 sınıfını belirlemek için 29’da serbestçe kullanılabilen kullanımı kolay bir sunucuuyguladılar. Sunucu, EPSPS sınıflarının her birinin kimlik yüzdesini ve glifosata karşı potansiyel duyarlılıklarını belirlemek için yalnızca FASTA formatında bir protein dizisi girişi gerektirir. Ayrıca, kullanıcılar kendi referans dizilerini ve amino asit belirteçlerini test etmek için web sunucusunu kullanabilirler. İlk olarak, algoritma (Şekil 5), amino asit konumlarını belirlemek için çoklu dizi hizalama programı35 kullanarak sorgu dizilerini ve referans dizilerini hizalar. Ardından, sorgu dizisinin EPSPS sınıfını (I, II, III veya IV) tanımlamak için amino asit belirteçlerinin varlığını arar. Enzimin sınıfını tanımlamak için giriş metin kutusuna FASTA formatında bir EPSPS protein dizisi girin (Şekil 6A) ve Gönder tuşuna basın. Sorgu dizisinin glifosata karşı potansiyel duyarlılığını değerlendirin (Şekil 6B-E) sağlanan çıktılar:Çıktı 1: Sorgu dizilerinde (sınıf I, II ve IV) bulunan amino asit belirteçlerinin fraksiyonu (yani kimlik) ve motiflerin sayısı (sınıf III).Çıktı 2: İşaretçi kalıntılarına dayalı sorgu ve başvuru dizilerinin hizalamaları.Çıktı 3: Sorgu ve başvuru dizilerinin çift yönlü tam hizalamaları.Çıktı 4: EPSPS referans dizileri: Vibrio cholerae (vcEPSPS, sınıf I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, sınıf II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, sınıf III), Streptomyces davawensis (sdEPSPS, sınıf IV). Çıktı sayfasının sonunda, sorgu EPSPS dizisini daha ayrıntılı çözümlemek için blastp ve korunmuş etki alanları gibi harici araçların bağlantılarını bulun (Şekil 6F). 5. EPSPS sınıfının evrensel mikrobiyal belirteçlerden (16S rRNA ve ITS) değerlendirilmesi NOT: Çoğu mikrobiyom çalışması, 16S rRNA ve / veya ITS36’nın analizine dayanmaktadır. Bu gibi durumlarda, EPSPS dizisinin doğrudan analizini yapmak mümkün değildir. Bu nedenle, organizmaların glifosata karşı potansiyel duyarlılığını tahmin etmek için olasılıkçı bir yaklaşım gereklidir. Bu analiz basittir ve bir mikrobiyom projesindeki EPSPS dizilerinin türünün makul bir tahminini sağlar. İşlem 3 adıma ayrılmıştır (Şekil 7 ve Şekil 8): Genel depolardan EPSPS dizilerini tanımlayın. Temsili dizilerden oluşan kapsamlı bir veri kümesinin EPSPS sınıfı, PFAM 37, GenBank 38, COG 39, PDB 40, ATGC 30’dan derlenmiş ve önceden hesaplanmıştır. Bu veri kümelerine, EPSPSClass sunucusunun taksonomik bilgileri ve 50.000’den fazla diziden oluşan EPSPS sınıfını içeren ana sayfasından erişin (Şekil 7). Büyüme mevsimi boyunca deneysel bitkilerin yüksekliğini iki haftada bir ölçün ve bitkilerin GBP cinsinden büyümesini karşılaştırmak ve arazileri kontrol etmek için tarla mevsiminin sonunda bitkilerin yer üstü biyokütlesini tartın.NOT: Saha deneylerinden elde edilen mikrobiyota analizleri henüz tam olarak analiz edilmemiştir. Bakteriyel OTU’ları (16S rRNA veya ITS’ye dayalı) mikrobiyom deneylerinden önceden hesaplanmış veri kümelerine eşlemek için bir elektronik tablo kullanın.NOT: Önceki çalışmalar, EPSPS sınıfının (yani, glifosata karşı içsel duyarlılık) filogenetik bir grup14 içinde yüksek oranda korunduğunu göstermiştir. Bu nedenle, yüksek oranda korunmuş taksonlardan yakından ilişkili türlerin glifosata benzer EPSPS yanıtlarına sahip olabileceğini varsaymak nispeten güvenlidir (Şekil 8). Aynı elektronik tabloda, genel veritabanlarındaki bilinen EPSPS dizilerinden hesaplanan olasılıksal bir skora (S = s / (s + r + u) dayanarak glifosata içsel duyarlılığı hesaplayın (burada S: Duyarlılık Puanı; s: potansiyel olarak hassas dizilerin sayısı; r: potansiyel olarak dirençli dizilerin sayısı; u: sınıflandırılmamış dizilerin sayısı).NOT: Bu puan 0 (bir taksonda hassas EPSPS dizileri bulunmaz) ile 1 (bir taksondaki tüm diziler glifosata duyarlıdır) arasında değişir (Şekil 8). Dahası, değerler arasında değerler vardır, yani hassas, dirençli veya bilinmeyen suşlara sahip türler.

Representative Results

Bu protokolün amacı, organizmaların herbisit glifosata karşı potansiyel duyarlılığını ölçen saha deneylerinden biyoinformatik analizlere kadar genel bir boru hattı sağlamaktır. Deney 2’de bıldırcın yemindeki ortalama glifosat konsantrasyonu 164 mg / kg ve dışkı örneklerinin (idrar ve dışkı maddesi kombinasyonu) ortalama glifosat konsantrasyonu 199 mg / kg idi. GBP ile kontamine yemle beslenen bıldırcınlardan toplanan yataklarda ortalama 158 mg/kg ve 0,17 mg/kg glifosat ölçülen kontrol yatakları vardı (Tablo 3). Saha deneylerinde, bitki türleri topraklardaki glifosat kalıntılarına farklı tepki vermiştir (bölüm 1). Yulaf ve şalgam tecavüzünün biyokütlesi, GBP ile muamele edilmiş topraklara kıyasla kontrol topraklarında daha fazlaydı. Bununla birlikte, faba fasulyesi ve patates, büyüme mevsimi15’in sonunda GBP tedavisinden fayda gördü. Kanatlı hayvan gübresindeki glifosat, çimlerde (Festuca pratensis) ve çilekte (Fragaria x vescana) (bölüm 1) bitki büyümesini azaltmıştır. Saha deneylerinden elde edilen mikrobiyota analizleri henüz tam olarak analiz edilmemiştir ve burada sunulmamıştır (bölüm 2). Bu protokolün sonuçları, doğrudan (bölüm 3 ve 4’te gösterildiği gibi) veya dolaylı olarak (bölüm 5) okunduğunda, potansiyel olarak hassas ve dirençli organizmaların bir veri kümesindeki glifosata oranının bir ölçüsünü sağlar (Şekil 9). Bu yöntemin kullanımı, halka açık depolardan elde edilen çekirdek insan bağırsak mikrobiyomunun mikrobiyal türlerinden EPSPS protein dizilerinin bir koleksiyonu ile test edilmiştir12. Çalışmada, hassas ve dirençli bakterilerin oranını ölçmek için en bol bulunan 101 bakteri türünden 890 suş EPSPSClass yöntemiyle analiz edildi. Sonuçlar, çekirdek insan bağırsak mikrobiyomundaki türlerin% 54’ünün glifosat12’ye potansiyel olarak duyarlı olduğunu göstermiştir. Bu eğilim prokaryotik dünyanın çoğunda da gözlenir; Ek olarak, ökaryotlarda (esas olarak bitkiler ve mantarlar), potansiyel olarak hassas türlerin oranı daha da yüksektir12. Ayrıca, bu yöntemi EPSPS proteinindeki duyarlılıktaki değişiklikleri mikroevrimsel düzeyde ölçmek için kullandık (Şekil 10)14. İncelenen yakından ilişkili 32 prokaryot grubundan 12’sinde duyarlılık durumundaki değişiklikleri tespit ettik (Tablo 4)14. Bu nedenle, GBP’lerin sürekli kullanımı, bitki, hayvan ve toprak mikrobiyomlarında mikrobiyoz (yani, hassas ve dirençli bakteri türlerinin dengesizliği) üretebilir. Ayrıca, glifosata dirençli bakterilerdeki bir artışın, çoklu ilaca dirençli mikrobiyomları14,41,42 teşvik edebileceği varsayılmıştır. Bu nedenle, bu protokol tüm bu senaryoların yorumlanmasına ışık tutmaktadır, çünkü EPSPS sınıflandırma yöntemi, mikrobiyomların glifosata karşı içsel duyarlılığının doğrudan bir tahminini sağlamaktadır. EPSPS proteininin glifosata karşı içsel duyarlılığı filogenetik olarak korunduğundan14, mevcut veri kümelerinden elde edilen sonuçları bilinmeyen mikrobiyomlara ekstrapolasyon yapmak mümkündür (Şekil 8). Şekil 1: Genel boru hattı Bu, saha deneylerinden biyoinformatik analizine kadar GBP’ye duyarlılığı analiz etmek için kullanılan genel bir boru hattıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: GBP kalıntılarının mahsul bitkisiyle ilişkili mikroplar üzerindeki etkilerini test etmek için saha deneyi 1. Deney alanı, alternatif 10 kontrol parseli ve 10 GBP arıtma parselinden (23 m x 1,5 m) ve parseller arasında 1,5 m tampon şeritlerinden oluşmaktadır. 2014’ten bu yana yılda iki kez, GBP arazileri ticari GBP (glifosat konsantrasyonu 450 g L-1, uygulama oranı arsa başına 5 L musluk suyunda 6.4 L ha-1) ve glifosatsız aynı miktarda musluk suyu içeren kontrol arazileri ile muamele edildi. Tedaviler, GBP’lerin arıtma alanlarının dışına yayılmasını önlemek için sprinkler ucunda plastik bir başlık kullanılarak elle çalıştırılan bir basınç tankı ile uygulandı. GBP uygulamasını takiben iki haftalık bir güvenlik döneminden sonra, yulaf (Avena sativa), faba fasulyesi (Vicia faba) ve şalgam tecavüzleri (Brassica rapa subsp. oleifera) ekildi ve patates (Solanum tuberosum) arazilere ekildi. İncelenen mahsul bitkileri, yaprakları ve köklerinden mikrobiyota örnekleri, deneyin 2014 yılında başlamasından bu yana birkaç kez toplandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Saha deneyi 2, iki çok yıllık ürün ve bunlarla ilişkili mikrobiyota için gübre gübresindeki GBP kalıntılarının sonuçlarını test etmiştir. Kontrol veya GBP ile kontamine yemle beslenen Japon bıldırcınlarıyla yapılan 12 aylık bir kuş kafesi deneyinden toplanan yataklar, bir tarla deneyinde gübre gübresi olarak kullanılmıştır. Deney alanı, 6 x 6 satranç tahtası ızgarasında düzenlenmiş 18 kontrol ve 18 GBP arsadan (1 m x 1 m) oluşuyordu. Yataklar, Ağustos 2018 ve Mayıs 2019’da (25 L / arsa) deneysel alana iki kez yayıldı. Kontrol arazileri, kontrol yemi ile beslenen bıldırcınlardan toplanan yataklarla ve GBP ile kirlenmiş yemle beslenen bıldırcınlardan gelen yataklarla GBP arazileriyle gübrelendi. Kontrol yataklarındaki glifosat kalıntıları 0.17 mg/kg glifosat, GBP yataklarında ise miktar 158 mg/kg glifosat idi. İki endofit-simbiyotik (E +), iki endofit içermeyen (E-) Festuca pratensis ve iki Fragaria x vescana , ilk yatakların yayılmasından yaklaşık bir ay sonra, Eylül 2018’de arsa başına ekildi. Bitki performansı ve uygunluğunun yanı sıra kök ve yaprak ile ilişkili mikrobiyota için örnekleme ölçümleri, iki ardışık büyüme mevsimi boyunca (2019 ve 2020) gerçekleştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: 16S rRNA geni/ITS bölgesi kullanılarak mikrobiyal taksonların analizi ve EPSPS genini kullanarak mikrobiyomların glifosata duyarlılığı. (A) Mikrobiyal taksonları tanımlamak için 16S rRNA veya ITS dizilerinin analizi. (B) Mikropların glifosata duyarlılığını tanımlamak için EPSPS dizilerinin analizi (GS-glifosata duyarlı/GR-glifosata dayanıklı) Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: EPSPS protein dizilerinin sınıfını tanımlayan algoritma. Girdi, FASTA formatında bir EPSPS protein dizisidir. Algoritma, glifosata potansiyel duyarlılığı belirleyen referans protein dizilerindeki bilinen amino asit belirteçleriyle karşılaştırmalar yapar. Algoritma, serbestçe erişilebilen EPSPSClass29 web sunucusunda uygulandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: EPSPSClass web sunucusunun temel giriş ve çıkışları. (A) Giriş: FASTA formatında bir EPSPS protein dizisi. (B) Çıktı 1 – kimlik: sorgu dizilerinde (Sınıf I-IV) ve motiflerde (Sınıf III) bulunan amino asit belirteçlerinin fraksiyonu. (C) Çıktı 2 – kimlik: sorgu ve başvuru dizilerinin hizalamaları. (D) Çıktı 3 – sorgu ve başvuru dizilerinin çift yönlü hizalamaları. (E) Referans EPSPS dizileri: Vibrio cholerae (vcEPSPS, sınıf I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, sınıf II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS , sınıf III), Streptomyces davawensis (sdEPSPS, sınıf IV). (F) Ek blastp aramaları yapmak ve korunan etki alanlarının tanımlanması için bağlantılar Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: EPSPS dizilerinin önceden hesaplanmış veri kümelerine erişim. EPSPS dizilerinin önceden hesaplanmış veri kümesine erişmek için şekildeki göstergeleri izleyin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 8: EPSPS dizileri olmadan mikrobiyom projelerinde potansiyel duyarlılığın nasıl tahmin edileceğine dair örnek. Örnek, prokaryotik türlerden diziler içeren Hizalanabilir Sıkı Genomik Kümeler30 veritabanındaki değerleri kullanır. Bir mikrobiyom projesinden varsayımsal türler Staphylococcus aureus, Corynebacterium diphtheriae, Campylobacter jejuni, Chlamydia psittaci ve Sulfolobus islandicus’tur. Glifosata duyarlılık skoru Number_Sensitive_Sequences/Total_Number_Of_Sequences olarak hesaplanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 9: Bu protokolden elde edilen sonuçların yorumlanması şeması ve varsayımsal evrim senaryoları. (A) Bir mikrobiyomda, potansiyel duyarlılık (yeşil renkte) ve direnç (kırmızı renkte) bakterilerin oranı yaklaşık 50:50’dir. Siyah noktalar, sınıflandırılmamış mikrobiyal türleri gösterir; bu nedenle, glifosata duyarlılıkları bilinmemektedir. Bazı mikrobiyomlarda, hassas bakterilerin oranı, insan bağırsak mikrobiyomu12’de olduğu gibi biraz daha yüksektir. (B) Zamanla, glifosat kullanımı mikrobiyoza (yani, hassas ve dirençli bakterilerin oranında bir dengesizlik) yol açabilir ve farklı varsayımsal senaryolara yol açabilir. (C) Varsayımsal durum 1 (seçim yok): Glifosat kullanımı mikrobiyomu etkilemez; böylece hassas ve dirençli bakterilerin oranı sabit kalır. (D) Varsayımsal durum 2: Glifosat kullanımı, glifosata duyarlı bakterileri popülasyondan uzaklaştırır. Bu senaryonun doza bağımlı olabileceğini düşünüyoruz. (E) Varsayımsal durum 3: Glifosat kullanımından kaynaklanan seçim baskısı, EPSPS genindeki bakterilerin duyarlılık durumunu değiştiren mutasyonları arttırır. Böylece, tüm mikrobiyal popülasyon glifosata dirençli hale gelir. Dahası, bu senaryoda, çoklu ilaca dirençli bakterilerde bir artış olabilir. (F) Varsayımsal durum 4: glifosat kullanımı, bazı bakteri türlerinin bileşimini değiştirerek dirençli bakterilere karşı bir dengesizlik yaratırken, bazı bakteri türleri, muhtemelen efflux pompaları gibi ek dirençli mekanizmalar veya EPSPS gen13’ün aşırı ekspresyonu nedeniyle değişmeden kalır. Bu senaryo aynı zamanda glifosata dirençli bakterilerde bir artışa ve ek antibiyotiklere karşı bakteriyel direncin artmasına neden olabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 10: Glifosata karşı öngörülen duyarlılığın tür ağacı boyunca dağılımı. Pasta grafikler, glifosata karşı varsayılan olarak hassas (yeşil) veya dirençli (kırmızı) ve sınıflandırılmamış (siyah) türlerin oranını gösterir. Bu rakam Rainio ve ark.14’ün izniyle uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 11: Kullanıcının kendi referans sırasını test etmek için EPSPSClass web sunucusunun giriş ve çıkışları. (A) Giriş 1: sorgu sırası. (B) Giriş 2: referans sırası. (C) Giriş 3: referans dizilerindeki amino asit belirteçleri. (D) Çıktı: kimlik: sorgu dizilerindeki amino asit belirteçlerinin fraksiyonu (sınıf I-IV ve kullanıcının kendi referans dizileri). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Tablo 1: Mikrobiyom analizinde 16S rRNA geninin ve ITS bölgesinin PCR amplifikasyonu için primerlerin listesi Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Tablo 2: Farklı veri tabanlarında 5-enolpiruvilshikimate-3-fosfat sentaz (EPSPS) enziminin kodları Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Tablo 3: Ortalama glifosat konsantrasyonu Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Tablo 4: Glifosata duyarlı/dirençli türlerin yüzdesinin özet tablosu. Bu tablo Rainio ve ark.14’ün izniyle uyarlanmıştır. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Tablo 5: Amino asit belirteçlerinin referans dizilerdeki konumları Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Bu protokol, EPSPS proteininin analizine dayanarak GBP’nin mikrobiyomlar üzerindeki etkisinin nasıl ölçüleceği konusunda genel rehberlik sağlar. Protokolün üç ana kritik adımı vardır: (i) EPSPS proteininin mikrobiyom verilerinden miktarının belirlenmesi. Bu adım kritiktir çünkü EPSPS herbisitin doğrudan hedef enzimidir. Bu nedenle, EPSPS geninin bir kopyasına sahip olan türler GBP kullanımından etkilenebilir. Bununla birlikte, EPSPS geninin bir kopyasından yoksun olan türler bile, alternatif hedef dışı mekanizmalar yoluyla herbisitten etkilenebilir43,44. (ii) EPSPS geninin analizi çalışmanın tasarımına dahil edilmemişse, 16S rRNA (bakteri) veya ITS’yi (mantarlar) analiz ederek iyi bir tahmin elde etmek mümkündür. Bu durumda, kapsamlı bir referans tablosuna güvenmek önemlidir (örneğin, ATGC veritabanı, yakından ilişkili birkaç türden EPSPS proteininin dizilerini sağlar). (iii) EPSPS proteini, EPSPS’nin aktif bölgesinin belirli amino asit kalıntılarına bağlı olarak glifosata potansiyel olarak duyarlı veya dirençli olarak ayrılır. Bununla birlikte, tek bir amino asidi etkileyen mutasyonlar bu sınıflandırmayı değiştirebilir45 ve sınıflar arasındaki geçişler nispeten kısa bir süre içinde gerçekleşebilir14.

Organizmaların glifosata karşı potansiyel duyarlılığı referans genomlar, amino asit belirteçleri ve dizi hizalamaları ile belirlenebilir. (i) Referans genomlar: EPSPS enzimi, amino asit belirteçlerinin ve motiflerinin varlığına (sınıf III durumunda) dayanarak glifosata potansiyel olarak duyarlı (sınıf I [alfa veya beta]46,47) veya dirençli (sınıf II48,49, III50 ve IV51) olarak sınıflandırılabilir. Bu amino asit belirteçleri ve motifleri, Vibrio kolerae (vcEPSPS, sınıf I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, sınıf II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, sınıf III) ve Streptomyces davawensis’in (sdEPSPS, sınıf IV) EPSPS proteinindeki amino asit kalıntılarının konumuna dayanmaktadır. (ii) Amino asit belirteçleri: Glifosat, EPSPS enzimi ile etkileşime girer ve fosfoenolpiruvat (PEP, EPSPS enziminin ikinci substratı) ile rekabet eder52,53. Bazı türlerde, EPSPS dizisindeki küçük amino asit değişiklikleri, PEP için daha yüksek bir afinite ve glifosat12,14,52,54,55’e karşı bir direnç sağlar. Diğer sekanslarda, glifosat EPSPS dizisini inhibitör olmayan bir konformasyona bağlar 45. Glifosata dirençli 12,14,48,49,52,54,55 ve toleranslı 56,57 EPSP dizileri tanımlanmış olmasına rağmen, EPSPS için mevcut sınıflandırma sistemi dört ana sınıfa ayrılmıştır (I-IV )12 (Tablo 5 ). (iii) Dizi hizalamaları: Bir EPSPS enzimini sınıflandırmak için, referans dizilerinin her birine (vcEPSPS, cbEPSPS, bvEPSPS ve sdEPSPS) karşı sorgu dizisinin çoklu dizi hizalama programı-varsayılan parametreleri35— ile ikili hizalamalar gerçekleştirdik. Bu hizalamalar, sorgu dizisindeki amino asit belirteçlerinin konumlarını tanımlamak için gereklidir. Sonuç olarak, bir enzim, amino asit belirteçlerinin ve sınıf III bazlı motif belirteçlerinin varlığına bağlı olarak tanımlanan12 sınıf I, II ve / veya IV olarak sınıflandırılır.

Protokol, bilinen dört EPSPS tipine dayanmaktadır: bir tip hassas, diğer üçü dirençlidir). Bununla birlikte, prokaryotlardaki EPSPS dizilerinin yaklaşık% 10’u henüz sınıflandırılmamıştır (arkelerde% 16 ve bakterilerde% 8)12. Bu nedenle, daha fazla araştırma glifosat duyarlılığını belirlemek için bu dizileri analiz etmelidir. EPSPSClass sunucusu yeni genetik belirteçleri test etmek için bir seçenek sunar. EPSPS’nin bilinen sınıflarının tanımlanması, bölüm 4.4’te gösterildiği gibi basittir. ve Şekil 5. Ayrıca, kullanıcıların kendi sorgularını ve referans proteinlerini karşılaştırmak istedikleri durumlarda, sunucu bir referans dizisini ve bir dizi amino asit belirtecini manuel olarak dahil etme seçeneği sunar (Şekil 11). Bu seçenek, EPSPS’nin yeni sınıflarını tanımlamanın yanı sıra diğer herbisitleri ve hedef dizileri test etmek için de kullanılabilir.

EPSPS sınıfının analizi, dizi analizi ve amino asit belirteçlerinin varlığı / yokluğu ile belirlenir. Bu, sahada hipotez testi için kullanılabilecek bir ön tahmindir. Amino asit belirteçleri literatürde ampirik ve gözlemsel çalışmalara dayanarak belirlenmiştir 46,47,48,49,50,51. Bununla birlikte, EPSPS sınıfını belirlemek için referans protein dizileri sadece sınırlı sayıda türde test edilmiştir ve bazen glifosata direnci açıklayamayabilir. Telafi edici mutasyonların ve EPSPS ile ilişkili alanların (çoğunlukla mantarlarda) etkisi de glifosat58’e duyarlılığı etkileyebilir. Bu makalenin analizi dört EPSPS sınıfına dayanmaktadır. İnsan bağırsak mikrobiyomundaki bakterilerin bir araştırması, bunların yaklaşık% 30’unun sınıflandırılmamış olduğunu (yani, bu türlerden EPSPS proteinlerinin bilinen sınıfların hiçbirine ait olmadığını) ve diğer EPSPS sınıflarını tanımlamak için ek çalışmalara ihtiyaç duyulduğunu göstermiştir. Ayrıca, bakteri ve bitkilerdeki EPSPS protein dizisinin tek alanlı olduğu, mantar EPSPS proteinlerinin ise birkaç alan içerdiği fark edilmelidir59. Bu nedenle, mantarlarda katlanan bir protein, EPSPS enziminin glifosata farklı bir tepkisine yol açabilir. Ayrıca, hedef olmayan ek direnç mekanizmaları (örneğin, efflux pompaları ve EPSPS gen13’ün aşırı ekspresyonu) veya glifosata duyarlılık (örneğin, glifosatın mitokondriyal taşıma zinciriüzerindeki etkisi 12) dikkate alınmaz.

GBP’ler 1974’ten beri herbisit olarak kullanılmasına ve 1991’den beri yaygın olarak kullanılmasına rağmen, bu, organizmaların glifosata karşı potansiyel duyarlılığını belirleyen ilk biyoinformatik yöntemdir. Yöntem, hedef dizilimdeki bilinen amino asit kalıntılarının tanımlanmasına dayanmaktadır. Bu nedenle, yöntemimiz glifosatın türler üzerindeki potansiyel etkisinin temel bir tahminini sağlar. Yakın gelecekte, yeni biyoinformatik yöntemler, sınıflandırılmamış dizilerin glifosatına potansiyel duyarlılığını belirlemek için EPSPS proteininin ek sınıflarını içermelidir 12,54,55. Ek olarak, EPSPS enziminin tam davranışının tek amino asit değişikliklerine göre değişebileceği göz önüne alındığında, 12,14,52,54,55, ayrıca siliko deneylerinde EPSPS proteininin katlanmasındaki küçük değişikliklerin yanı sıra EPSPS ile ilişkili alanların mantarlardaki protein yapısı üzerindeki etkisi de dikkate alınmalıdır 58 . Ayrıca, glifosata toleransın EPSPS proteini 56,57’nin aşırı ekspresyonu ile üretilebileceği gösterilmiştir; Bu nedenle, kodon kullanımı60’ın iyileştirilmesine dayanan biyoinformatik analizler, gen ekspresyonunu en üst düzeye çıkaran veya en aza indiren yeni EPSPS dizilerini tanımlamak için kullanılabilir.

Çiftçiler, politikacılar ve karar vericiler, pestisitlerin yoğun kullanımıyla ilişkili risklerin acilen tam olarak anlaşılmasına ihtiyaç duymaktadır. Bu nedenle, hem organizmaların pestisitlere karşı potansiyel duyarlılığını ortaya koyan biyoinformatik araçlar hem de farklı ortamlarda yürütülen iyi çoğaltılmış, randomize ve saha gerçekçi deneysel çalışmalar gereklidir. Organizmaların glifosata duyarlılığını incelemek için tasarlanan sunulan biyoinformatik yöntem, diğer pestisitler için modüle edilebilir. Benzer şekilde, deneysel ekoloji yöntemleri, ilgili ekolojik soruları incelemek için uygulanabilir. Birlikte, yöntemler saha gözlemleri, genomik veriler ve pestisit kullanımı arasındaki kayıpları göstermek için kullanılabilir. Sunulan tüm yöntemler risk değerlendirmesinde paha biçilmezdir. Biyoinformatik yöntemler, örneğin, zirai kimyasallara mikrobiyal adaptasyonların izlenmesinde ve patojenlerin zirai kimyasallara karşı direncinin artması, entegre haşere yönetiminde (IPM) biyolojik kontrol ajanları olarak kullanılan mikroplar üzerindeki olumsuz etkiler ve bakterilerde antibiyotik direnci gibi potansiyel diğer ilişkili riskleri test etmek için nicel bir yöntem sağlamak için kullanılabilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Finlandiya Akademisi tarafından finanse edilmiştir (Marjo Helander’a 311077 no. hibe).

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument INVITEK Molecular 1037100300 Genomic DNA extraction from plant tissues
dNTP mix (10 mM each) BIO-RAD 1852196 For PCR reactions
GoTaq G2 DNA Polymerase kit Promega M7848 PCR buffer and DNA Polymerase for PCR amplification
Invisorb Spin Plant Mini Kit Agilent G2939B To check the concentration and quality of PCR products
Ion Chip Minifuge sage science PIP0001 For size fractionation of PCR amplicons
Ion PGM System ThermoFisher Scientific 4462921 For targeted sequencing of microbial PCR products
Ion PGM Torrent Server ThermoFisher Scientific 4483643 For targeted sequencing of microbial PCR products
Pippinprep ThermoFisher Scientific 4479672 For targeted sequencing of microbial PCR products
Pressure tank Berthoud 102140 For sprayin glyphosate based products in field
Primers ThermoFisher Scientific R0192 For PCR amplification
Rotary tiller Grillo 984511 For tilling the soil in experimental plots
S1000 ThermalCycler Sigma-Aldrich Custom-made For PCR amplification
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams, G. M., Kroes, R., Munro, I. C. Safety evaluation and risk assessment of the herbicide Roundup and its active ingredient, glyphosate, for humans. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 31, 117-165 (2000).
  2. Muola, A., et al. Risk in the circular food economy: Glyphosate-based herbicide residues in manure fertilizers decrease crop yield. The Science of the Total Environment. 750, 141422 (2021).
  3. Helander, M., Saloniemi, I., Saikkonen, K. Glyphosate in northern ecosystems. Trends in Plant Science. 17 (10), 569-574 (2012).
  4. Fuchs, B., Saikkonen, K., Helander, M. Glyphosate-Modulated Biosynthesis Driving Plant Defense and Species Interactions. Trends in Plant Science. 26 (4), 312-323 (2021).
  5. Helander, M., Saloniemi, I., Omacini, M., Druille, M., Salminen, J. -. P., Saikkonen, K. Glyphosate decreases mycorrhizal colonization and affects plant-soil feedback. The Science of the Total Environment. 642, 285-291 (2018).
  6. Bai, S. H., Ogbourne, S. M. Glyphosate: environmental contamination, toxicity and potential risks to human health via food contamination. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (19), 18988-19001 (2016).
  7. Cuhra, M., Bøhn, T., Cuhra, P. Glyphosate: too much of a good thing. Frontiers in Environmental Science. 4, (2016).
  8. de Brito Rodrigues, L., et al. Impact of the glyphosate-based commercial herbicide, its components and its metabolite AMPA on non-target aquatic organisms. Mutation Research. 842, 94-101 (2019).
  9. Steinrücken, H. C., Amrhein, N. The herbicide glyphosate is a potent inhibitor of 5-enolpyruvylshikimic acid-3-phosphate synthase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 94 (4), 1207-1212 (1980).
  10. Bentley, R. The shikimate pathway–a metabolic tree with many branches. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 25 (5), 307-384 (1990).
  11. Richards, T. A., et al. Evolutionary origins of the eukaryotic shikimate pathway: gene fusions, horizontal gene transfer, and endosymbiotic replacements. Eukaryotic Cell. 5 (9), 1517-1531 (2006).
  12. Leino, L., et al. Classification of the glyphosate target enzyme (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) for assessing sensitivity of organisms to the herbicide. Journal Of Hazardous Materials. 408, 124556 (2021).
  13. Rainio, M. J., Ruuskanen, S., Helander, M., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Puigbò, P. Adaptation of bacteria to glyphosate: a microevolutionary perspective of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP) synthase. BioRxiv. , (2020).
  14. Rainio, M. J., Ruuskanen, S., Helander, M., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Puigbò, P. Adaptation of bacteria to glyphosate: a microevolutionary perspective of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase. Environmental Microbiology Reports. 13 (3), 309-316 (2021).
  15. Helander, M., Pauna, A., Saikkonen, K., Saloniemi, I. Glyphosate residues in soil affect crop plant germination and growth. Scientific Reports. 9 (1), 19653 (2019).
  16. Ruuskanen, S., Rainio, M. J., Uusitalo, M., Saikkonen, K., Helander, M. Effects of parental exposure to glyphosate-based herbicides on embryonic development and oxidative status: a long-term experiment in a bird model. Scientific Reports. 10 (1), 6349 (2020).
  17. Ruuskanen, S., et al. female preference and adverse developmental effects of glyphosate-based herbicides on ecologically relevant traits in Japanese quails. Environmental Science & Technology. 54 (2), 1128-1135 (2020).
  18. Mäki, A., Rissanen, A. J., Tiirola, M. A practical method for barcoding and size-trimming PCR templates for amplicon sequencing. Biotechniques. 60 (2), 88-90 (2016).
  19. Chelius, M. K., Triplett, E. W. The diversity of archaea and bacteria in association with the roots of Zea mays L. Microbial Ecology. 41 (3), 252-263 (2001).
  20. Lane, D. J. 16S/23S rRNA sequencing. Nucleic acid techniques in bacterial systematics. , 115-175 (1991).
  21. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. Plos One. 8 (8), 71360 (2013).
  22. Zheng, D., Alm, E. W., Stahl, D. A., Raskin, L. Characterization of universal small-subunit rRNA hybridization probes for quantitative molecular microbial ecology studies. Applied and Environmental Microbiology. 62 (12), 4504-4513 (1996).
  23. . JoVE Supplementary Material Available from: https://ppuigbo.me/programs/EPSPSClass/JOVE_SM (2021)
  24. . Alignments Conserved Positions Available from: https://ppuigbo.me/programs/primers (2021)
  25. . NCBI GenBank Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/genbank (2021)
  26. . COG Database Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/research/cog (2021)
  27. . Protein Data Bank Available from: https://www.rcsb.org (2021)
  28. . EPSPSClass Available from: https://ppuigbo.me/programs/EPSPSClass (2021)
  29. Kristensen, D. M., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. ATGC database and ATGC-COGs: an updated resource for micro- and macro-evolutionary studies of prokaryotic genomes and protein family annotation. Nucleic Acids Research. 45, 210-218 (2017).
  30. . CSC – IT CENTER FOR SCIENCE LTD Available from: https://www.csc.fi (2021)
  31. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).
  32. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research. 32 (5), 1792-1797 (2004).
  33. Tkacz, A., Hortala, M., Poole, P. S. Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples. Microbiome. 6 (1), 110 (2018).
  34. El-Gebali, S., et al. The Pfam protein families database in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 427-432 (2019).
  35. Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, 36-42 (2013).
  36. Galperin, M. Y., Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. Expanded microbial genome coverage and improved protein family annotation in the COG database. Nucleic Acids Research. 43, 261-269 (2015).
  37. Burley, S. K., Berman, H. M., Kleywegt, G. J., Markley, J. L., Nakamura, H., Velankar, S. Protein data bank (PDB): the single global macromolecular structure archive. Methods in Molecular Biology. 1607, 627-641 (2017).
  38. Raoult, D., Hadjadj, L., Baron, S. A., Rolain, J. -. M. Role of glyphosate in the emergence of antimicrobial resistance in bacteria. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76 (7), 1655-1657 (2021).
  39. Liu, J., Gefen, O., Ronin, I., Bar-Meir, M., Balaban, N. Q. Effect of tolerance on the evolution of antibiotic resistance under drug combinations. Science. 367 (6474), 200-204 (2020).
  40. Peixoto, F. Comparative effects of the Roundup and glyphosate on mitochondrial oxidative phosphorylation. Chemosphere. 61 (8), 1115-1122 (2005).
  41. Peillex, C., Pelletier, M. The impact and toxicity of glyphosate and glyphosate-based herbicides on health and immunity. Journal of Immunotoxicology. 17 (1), 163-174 (2020).
  42. Funke, T., Han, H., Healy-Fried, M. L., Fischer, M., Schönbrunn, E. Molecular basis for the herbicide resistance of Roundup Ready crops. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 13010-13015 (2006).
  43. Light, S. H., Krishna, S. N., Minasov, G., Anderson, W. F. An unusual cation-binding site and distinct domain-domain interactions distinguish Class II Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases. Biochemistry. 55 (8), 1239-1245 (2016).
  44. Firdous, S., Iqbal, S., Anwar, S., Jabeen, H. Identification and analysis of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) gene from glyphosate-resistant Ochrobactrum intermedium Sq20. Pest Management Science. 74 (5), 1184-1196 (2018).
  45. Barry, G. F., Kishore, G. M., Padgette, S. R., Stallings, W. C. Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases. United States Patient. , (1997).
  46. Priestman, M. A., Funke, T., Singh, I. M., Crupper, S. S., Schönbrunn, E. 5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Staphylococcus aureus is insensitive to glyphosate. FEBS Letters. 579, 728-732 (2005).
  47. Carozzi, N., Carr, B., Hammer, P. E. Identification of a new class of EPSP synthases. World Intellectual Property Organization Publ.of the Int.Appl. without Int.search. , (2006).
  48. Lira, J. M., Cicchillo, R. M., Nair, S. K. Novel class of glyphosate resistance genes. US Patent. , (2013).
  49. Funke, T., et al. Structural basis of glyphosate resistance resulting from the double mutation Thr97 -> Ile and Pro101 -> Ser in 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 284 (15), 9854-9860 (2009).
  50. Schönbrunn, E., et al. Interaction of the herbicide glyphosate with its target enzyme 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase in atomic detail. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (4), 1376-1380 (2001).
  51. Stalker, D. M., Hiatt, W. R., Comai, L. A single amino acid substitution in the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase confers resistance to the herbicide glyphosate. The Journal of Biological Chemistry. 260 (8), 4724-4728 (1985).
  52. Eschenburg, S., Healy, M. L., Priestman, M. A., Lushington, G. H., Schönbrunn, E. How the mutation glycine96 to alanine confers glyphosate insensitivity to 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli. Planta. 216 (1), 129-135 (2002).
  53. Achary, V. M. M., et al. Overexpression of improved EPSPS gene results in field level glyphosate tolerance and higher grain yield in rice. Plant Biotechnology Journal. 18 (12), 2504-2519 (2020).
  54. Huang, Z., Liu, Y., Zhang, C., Jiang, C., Huang, H., Wei, S. Molecular basis of natural tolerance to glyphosate in Convolvulus arvensis. Scientific Reports. 9 (1), 8133 (2019).
  55. Tall, T. . A census analysis of the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP) synthase and EPSP-associated domains. , (2020).
  56. Tall, T., Puigbò, P. The glyphosate target enzyme 5-Enolpyruvyl Shikimate 3-Phosphate Synthase (EPSPS) contains several EPSPS-associated domains in fungi. ATLA Summary of Proceedings. 76 (1), 6 (2020).
  57. Puigbò, P., Guzmán, E., Romeu, A., Garcia-Vallvé, S. OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Research. 35, 126-131 (2007).

Tags

GlyphosateMicrobiome16S RRNAExperimental DesignPlant SamplesQuail BeddingPCR AmplificationDNA ExtractionBioinformatics Workflow

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Mathew, S. A., Muola, A., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Helander, M., Puigbò, P. Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes. J. Vis. Exp. (179), e63109, doi:10.3791/63109 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image