JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

تحديد الأثر المحتمل للمنتجات القائمة على الغليفوسات على الميكروبات

Published: January 10, 2022
doi:
10.3791/63109
, , , , ,
1Biodiversity Unit,University of Turku, 2Department of Biology,University of Turku, 3Nutrition and Health Unit,Eurecat Technology Centre of Catalonia, 4Department of Biochemistry and Biotechnology,Rovira i Virgili University

Summary

المنتجات القائمة على الغليفوسات (GBP) هي مبيدات الأعشاب واسعة الطيف الأكثر شيوعا في جميع أنحاء العالم. في هذه المقالة ، نقدم إرشادات عامة لتحديد تأثير GBP على الميكروبات ، من التجارب الميدانية إلى تحليلات المعلوماتية الحيوية.

Abstract

المنتجات القائمة على الغليفوسات (GBP) هي مبيدات الأعشاب واسعة الطيف الأكثر شيوعا في جميع أنحاء العالم. الهدف من الغليفوسات هو إنزيم 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) في مسار شيكيمات ، وهو عالمي تقريبا في النباتات. يوقف تثبيط الإنزيم إنتاج ثلاثة أحماض أمينية أساسية: الفينيل ألانين والتيروزين والتريبتوفان. EPSPS موجود أيضا في الفطريات وبدائيات النوى ، مثل العتائق والبكتيريا. وبالتالي ، قد يكون لاستخدام GBP تأثير على تكوين الميكروبيوم للتربة والنباتات والحيوانات العاشبة والمستهلكين الثانويين. تهدف هذه المقالة إلى تقديم إرشادات عامة لتقييم تأثير GBP على الميكروبات من التجارب الميدانية إلى تحليلات المعلوماتية الحيوية وتقديم بعض الفرضيات القابلة للاختبار. يتم تقديم تجربتين ميدانيتين لاختبار GBP على الكائنات غير المستهدفة. أولا ، يتم أخذ عينات من الميكروبات المرتبطة بالنباتات من 10 قطع تحكم مكررة ومعالجة GBP تحاكي المحاصيل بدون حراثة وتحليلها. وفي التجربة الثانية، تم الحصول على عينات من قطع الأراضي التجريبية المخصبة إما بسماد الدواجن المحتوي على بقايا الغليفوسات أو بالسماد الرقابي غير المعالج. يستخدم تحليل المعلوماتية الحيوية لتسلسل بروتين EPSPS لتحديد الحساسية المحتملة للميكروبات للغليفوسات. الخطوة الأولى في تقدير تأثير GBP على الميكروبات هي تحديد حساسيتها المحتملة للإنزيم المستهدف (EPSPS). يمكن الحصول على التسلسلات الميكروبية إما من المستودعات العامة أو عن طريق تضخيم PCR. ومع ذلك ، في معظم الدراسات الميدانية ، تم تحديد تكوين الميكروبيوم بناء على علامات الحمض النووي العالمية مثل 16S rRNA والفاصل الداخلي المنسوخ (ITS). في هذه الحالات ، لا يمكن تقدير الحساسية للغليفوسات إلا من خلال تحليل احتمالي لتسلسل EPSPS باستخدام الأنواع ذات الصلة الوثيقة. يوفر التحديد الكمي للحساسية المحتملة للكائنات الحية للغليفوسات ، استنادا إلى إنزيم EPSPS ، نهجا قويا لمزيد من التجارب لدراسة آليات المقاومة المستهدفة وغير المستهدفة.

Introduction

ومن الواضح أن الاستخدام المكثف لمبيدات الآفات في الزراعة الحديثة مساهم رئيسي في انخفاض التنوع البيولوجي1. تركز هذه الورقة على الغليفوسات لأن المنتجات القائمة على الغليفوسات (GBPs) أصبحت المبيدات الأكثر استخداما على نطاق واسع على مستوى العالم بسبب كفاءتها وأسعارها المعقولة 2,3. بالإضافة إلى قتل الأعشاب الضارة في الحقول الزراعية ، تستخدم GBPs بشكل شائع في زراعة الغابات والبيئات الحضرية والحدائق المنزلية. بالإضافة إلى ذلك ، تم إعلانها على أنها غير سامة للكائنات الحية غير المستهدفة إذا تم استخدامها وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ومع ذلك ، فقد كشف عدد متزايد من الدراسات الحديثة أن بقايا الغليفوسات ومنتجات تحللها يمكن الاحتفاظ بها ونقلها في التربة ، وبالتالي يكون لها آثار متتالية على الكائنات غير المستهدفة4،5،6،7،8 . لا تقتصر آثار الغليفوسات على النباتات فقط – فمسار شيكيميت موجود في العديد من الفطريات وبدائيات النوى أيضا. يستهدف الغليفوسات إنزيم 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) في مسار شيكيميت ، المعروف أيضا باسم aroA9. يقع هذا الإنزيم في مركز مسار شيكيمات في تخليق الأحماض الأمينية العطرية الأساسية الثلاثة (الفينيل ألانين والتيروزين والتريبتوفان) ، وهو موجود في معظم بدائيات النوى والنباتات والفطريات10,11. طورت بعض الأنواع الميكروبية مقاومة جزئية أو مطلقة للغليفوسات عن طريق عدة آليات ، بما في ذلك الطفرات في تسلسل EPSPS. وبالتالي ، فقد اقترح أن استخدام GBPs قد يكون له تأثير مباشر على الميكروبات النباتية والحيوانية ، بما في ذلك ميكروبيوم الأمعاء البشري12،13،14. ومع ذلك، فإن استخدام الجنيه الإسترليني قد يكون له تأثير سلبي على أي وظيفة وخدمة للنظام الإيكولوجي تعتمد على الميكروبات والعمليات التي تيسرها الميكروبات. قد تتعلق التهديدات المترتبة على ذلك بعمليات التربة البيوكيميائية ، وبيولوجيا التلقيح ، ورفاهية الحيوان والإنسان. وهذا يستدعي فهما أكثر شمولا لكيفية تأثير الغليفوسات على مسارات شيكيمات وطرق تقييم حساسية الميكروبات للغليفوسات.

في هذا البروتوكول ، نقدم خط أنابيب لاختبار تأثير الغليفوسات والجنيه الإسترليني على الميكروبيوم ، من التجارب الميدانية إلى تحليلات المعلوماتية الحيوية. نحن نصف بالتفصيل طريقة المعلوماتية الحيوية المنشورة مؤخرا والتي يمكن استخدامها لتحديد الحساسية المحتملة للكائنات الحية للغليفوسات12. على حد علم الباحثين ، هذه هي الأداة الأولى وحتى الآن ، وهي الأداة الوحيدة للمعلوماتية الحيوية لتقييم الحساسية الجوهرية لإنزيم EPSPS للمكون النشط في GBPs. تعتمد طريقة المعلوماتية الحيوية هذه على اكتشاف علامات الأحماض الأمينية المعروفة في إنزيم الغليفوسات المستهدف (EPSPS)12. ينقسم خط الأنابيب إلى خمس مراحل عمل رئيسية (الشكل 1): 1) مقدمة موجزة لتجربتين ميدانيتين لاختبار تأثير GBPs ، 2) ملخص موجز لتحليلات الميكروبيوم (16S rRNA و ITS و EPSPS gene) ، 3) جمع تسلسلات EPSPS من المستودعات العامة ، 4) تحديد الحساسية المحتملة للكائنات الحية للغليفوسات ، و 5) تقييم فئة EPSPS من العلامات الميكروبية العالمية (16S rRNA و ITS).

Protocol

1. تجربتان ميدانيتان لاختبار تأثير الجنيه الإسترليني ملاحظة: يقدم هذا البروتوكول مثالين للتصاميم التجريبية الميدانية لاختبار تأثير الجنيه الإسترليني على الميكروبات المرتبطة بالنباتات. أجريت كلتا التجربتين في حقول مخصصة ليس لها تاريخ سابق من مبيدات الأعشاب أو الاستخدامات الزراعية في حديقة جامعة توركو رويسالو النباتية في فنلندا (60º26’N, 22º10’E). التربة عبارة عن طين رملي مع نسبة عالية من المواد العضوية. التجربة 1ملاحظة: تم تصميم هذه التجربة لمحاكاة الممارسات الزراعية العامة للزراعة بدون حراثة مع تطبيقات GBP قبل وبعد موسم النمو لمكافحة الأعشاب الضارة. قسم المجال التجريبي إلى 10 قطع تحكم مكررة ومعالجة GBP (23 م × 1.5 م) مع شرائط عازلة من النباتات بين قطع الأراضي (في هذه الدراسة في ربيع 201415) (الشكل 2). تأكد من حرث قطع الأراضي باستخدام حارث دوار على عمق 5 سم ومعالجتها مرتين في السنة. هنا ، تم التعامل مع المؤامرات في بداية (مايو) ونهاية (أكتوبر) من موسم النمو. عالج قطع التحكم بماء الصنبور (5 لتر/قطعة أرض) وقطع الأراضي الإسترلينية بالجنيه الإسترليني التجاري (تركيز الغليفوسات 450 جم· L-1 ، معدل التطبيق 6.4 لتر · هكتار-1 في 5 لتر من ماء الصنبور لكل قطعة أرض) لتقليد الحد الأقصى المسموح به من جرعة الغليفوسات في الممارسات الزراعية (3 كجم · هكتار -1). قم بتطبيق العلاجات باستخدام خزان ضغط يعمل يدويا ويحتوي على بخاخ يدوي. بعد أسبوعين من تطبيق GBP ، زرع الشوفان (Avena sativa) ، وحبوب الفابا (Vicia faba) ، واغتصاب اللفت (Brassica rapa subsp. oleifera) ، والبطاطا النباتية (Solanum tuberosum) في قطع الأراضي وفقا للممارسات الزراعية. خلال موسم النمو ، قم بإزالة الأعشاب الضارة يدويا من قطع الأراضي للحفاظ على المنافسة النباتية وبنية التربة متشابهة قدر الإمكان في قطع الأراضي الضابطة والمعالجة بالجنيه الإسترليني. عينة من الميكروبات من النباتات التجريبية. في هذه الدراسة ، تم أخذ عينات من الميكروبات على التوالي من عام 2017 حتى عام 2020 في كل من مخططات المعالجة بالجنيه الإسترليني والمعالجة بالتحكم مرة واحدة في موسم النمو على مدار الدراسة. جمع عشر نسخ طبق الأصل من عينات النبات (الجذر والأوراق) من الحقل، ووضعها على الجليد على الفور، وإحضارها إلى المختبر لمزيد من المعالجة، كما هو موضح في القسم 2-1. التجربة 2ملاحظة: تم تصميم هذه التجربة لاختبار المخاطر المرتبطة بالاقتصاد الغذائي الدائري. بتعبير أدق ، تم تصميمه لدراسة عواقب بقايا GBP في السماد المستخدم كسماد على نباتات المحاصيل2 (الشكل 3). جمع الفراش ، بما في ذلك نجارة الخشب والبراز وبعض الأعلاف المنسكبة ، من السمان الذي يتغذى على الأعلاف الملوثة بالجنيه الإسترليني أو التحكم في تجربة قفص لمدة 12 شهرا16,17.ملاحظة: يتكون العلف الملوث بالجنيه الإسترليني من الأعلاف العضوية لوضع الدجاج جنبا إلى جنب مع ما يعادل 160 ملغ غليفوسات / كغم ، وهو ما يتوافق مع المدخول اليومي من 12-20 ملغ من الغليفوسات لكل كيلوغرام من كتلة الجسم في السمان الياباني البالغ16,17. للتحقق من صحتها، أرسل العينات إلى مختبر معتمد لقياسات تركيز الغليفوسات على ست دفعات من العلف. بالإضافة إلى ذلك ، قم بقياس بقايا الغليفوسات في عينات إفرازات السمان بعد 12 شهرا من التعرض. تم تغذية المجموعة الضابطة بنفس الأعلاف العضوية دون إضافة جنيه إسترليني16,17. أثناء تجربة القفص ، قم بتغيير الفراش كل أسبوعين. جمع الفراش المستخدم بانتظام من 8-12 شهرا من التعرض من معالجة الجنيه الإسترليني والضوابط ، وتجمع لكل علاج ، وتخزينها في حاويات مغلقة في غرفة تخزين جافة ومظلمة عند 6 درجات مئوية قبل استخدامها كسماد. انشر 12 لترا من الفراش يدويا على كل من مخططات التحكم 18 GBP و 18 (الحجم 1 م × 1 م) في شبكة رقعة شطرنج 6 × 6 في المجال التجريبي في نقطتين زمنيتين. في هذه الدراسة ، انتشرت الفراش في أغسطس 2018 وفي مايو 2019. إرسال عينات الفراش إلى مختبر معتمد لقياسات تركيز الغليفوسات مباشرة بعد انتشارها (في هذه الدراسة في مايو 2019). زرع العشب المعمر ونباتات الفراولة في كل قطعة أرض لدراسة الميكروبات الجذرية والأوراق.ملاحظة: في هذه الدراسة تم زرع أربعة نباتات عشبية معمرة (Festuca pratensis) ، ونباتين للفراولة (Fragaria x vescana) في كل قطعة أرض ودرست لميكروبات الجذر والأوراق. 2. تحليلات الميكروبيوم (16S rRNA و ITS و EPSPS gene ) ملاحظة: تستند معظم دراسات الميكروبيوم إلى تحليل جين 16S rRNA لمناطق الفاصل البكتيرية والمنسوخة الداخلية (ITS) للمجتمعات الفطرية باستخدام تقنيات تسلسل الجيل التالي. وبالتالي ، لا تحتوي الورقة على معلومات حول نوع EPSPS. تتوفر تسلسلات EPSPS من آلاف الأنواع في المستودعات العامة (قسم البروتوكول 3) (الشكل 4). 16S الحمض النووي الريبي الجين من عينات الأوراق والجذور المنفصلة التي تم جمعها في التجارب الموضحة أعلاه ، حدد الميكروبات الداخلية (أي الميكروبات التي تعيش داخل الأنسجة النباتية). اغسل العينات النباتية بماء الصنبور ثم قم بتعقيمها لإزالة الميكروبات المشاشية (أي الميكروبات الموجودة على سطح الأنسجة النباتية). قم بالتعقيم باستخدام 3٪ من المبيض لمدة 3 دقائق ، يليه محلول إيثانول بنسبة 70٪ لمدة دقيقة واحدة ، واغسله ثلاث مرات بالماء فائق النقاء المعقم لمدة 1 دقيقة لكل منهما. قم بتجميد العينات عند -80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي الجينومي. قم بإجراء استخراج الحمض النووي الجيني باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي النباتية المتاحة تجاريا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. استهدف المناطق المتغيرة V6-V8 من جين 16S rRNA من عينات الحمض النووي المستخرجة باستخدام نهج متداخل مع الاشعال التمييزية التي ترتبط على وجه التحديد بالحمض النووي البكتيري18 ، وبالتالي تقليل التضخيم من الحمض النووي للنبات المضيف. بعد ثلاث جولات من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، ضع علامة على الجين المستهدف باستخدام تسلسلات الباركود والمحول لإعداده كقالب للتسلسل. اتبع الخطوات 2.1.7- 2.1.11 لتضخيم PCR قم بإعداد المزيج الرئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للعدد المطلوب من العينات بحيث يكون لكل تفاعل 30 ميكرولتر من الحجم الكلي ويتكون من 30 نانوغرام من الحمض النووي ، ومخزن مؤقت PCR 1x ، و 0.2 mM dNTPs ، و 0.3 ميكرومتر من كل تمهيدي ، و 2000 U / mL DNA polymerase. اتبع نفس الخطوة للجولتين الثانية والثالثة من PCR. بالنسبة للجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل، استخدم الاشعال 799F19 و 1492R (المعدل من20) (الجدول 1). قم بإعداد ملف تعريف التضخيم على جهاز التدوير الحراري (تمسخ أولي لمدة 3 دقائق عند 95 درجة مئوية ، يليه 35 دورة من تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، والتلدين عند 54 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة). نفذ التمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. كقالب للجولة الثانية من PCR ، تحقق من التضخيم بواسطة الرحلان الكهربائي (5 ميكرولتر من منتجات PCR على 1.5٪ من هلام الأغاروز) ثم قم بتخفيف الباقي 25 ميكرولتر من منتج PCR في الماء فائق النقاء المعقم بنسبة 1:10. كرر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مع قوالب PCR المخففة والاشعال uni-1062F21 وuni-1390R22 (الجدول 1). الحفاظ على نفس ظروف تفاعل PCR وملف تعريف التضخيم (الخطوة 2.1.8) باستثناء تقليل عدد الدورات إلى 25. تمييع منتجات PCR الناتجة في المياه فائقة النقاء المعقمة بنسبة 1: 1. قم بإجراء الجولة الثالثة من PCR لوضع علامة على المنتجات باستخدام الرموز الشريطية وتسلسل محول P1 مع 8 دورات من نفس ملف تعريف PCR كما هو مذكور في الخطوة 2.1.8. إعداد المكتبة تحقق من تركيز وجودة منتجات PCR على محلل حيوي وتجميع الأحجام التي تشكل 30 نانوغرام من الحمض النووي لكل عينة في أنبوب 1.5 مل لإعداد مكتبة متساوية المول. حدد الأمبليونات بحجم 350-550 نقطة أساس حسب تجزئة الحجم باستخدام نظام اختيار حجم الحمض النووي الآلي على كاسيت هلام الأغاروز. لاحظ أن هذا يلغي أيضا الأمبليكونات غير المحددة وكواشف PCR من المكتبة. جمع العجة التي تتكون من أمبليونات من الحجم المحدد في قارورة في الكاسيت ، مما أدى إلى مكتبة جينات 16S rRNA منقية. قم بإخراج المعود إلى أنبوب 1.5 مل وتحقق من النقاء والتركيز على المحلل الحيوي. تمييع مكتبة الحمض النووي باستخدام المياه فائقة النقاء المعقمة إلى تركيز نهائي قدره 26 جزء في المليون. العينة جاهزة للتسلسل. لهاملاحظة: يتم تضخيم منطقة أنظمة النقل الذكية باستخدام الاشعال الخاصة ب ITS (الجدول 1)، ويتم تسمية منتج PCR الناتج برموز شريطية وتسلسل محول P1 للتسلسل. قم بإعداد المزيج الرئيسي PCR وفقا لنفس البروتوكول كما هو مذكور في القسم 2.1 مع الاشعال ITS . اضبط ملف تعريف التضخيم على جهاز تدوير الحرارة على أنه تمسخ أولي لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية متبوعا ب 35 دورة من تمسخ وتلدين وتمديد عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، على التوالي ، والامتداد النهائي 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. قم بتحليل 5 ميكرولتر من منتج PCR على 1.5٪ من هلام الأغاروز وقم بتخفيف 25 ميكرولتر المتبقية إلى 1:10 باستخدام الماء فائق النقاء المعقز. استخدم منتج PCR المخفف كقالب للجولة الثانية من PCR. قم بإعداد المزيج الرئيسي PCR للعدد المطلوب من العينات (راجع الخطوة 2.1.6) باستخدام الاشعال الأمامية الموسومة بالرمز الشريطي والاشعال العكسي الموسومة بمحول P1. تضخيم مع نفس ملف تعريف التضخيم كما في الخطوة 2.3.2، باستثناء استخدام 8 دورات. إعداد منتجات PCR الناتجة للتسلسل وفقا للبروتوكولات المذكورة في القسم 2.2. جين EPSPS تسلسل وتحليل جينات EPSPS للميكروبات.ملاحظة: من أجل معرفة ما إذا كان التعرض للجنيه الإسترليني قد غير تكوين الميكروبات الحساسة للغليفوسات والمقاومة في المجتمع ، يجب تسلسل جينات EPSPS للميكروبات وتحليلها. وهكذا ، تم جمع 353 تسلسلا من جينات EPSPS من مجموعة واسعة من الأصناف الميكروبية في قاعدة بيانات المجموعات الجينومية الضيقة القابلة للمحاذاة (ATGC) ، وتم محاذاة جميع تسلسلات البروتين22. تتوفر هذه المحاذاة في قاعدة بيانات ATGC23 ويمكن استخدامها لإنشاء الاشعال من المناطق المحفوظة. تم تصميم أداة المعلوماتية الحيوية سهلة الاستخدام لتحديد المناطق المحفوظة من محاذاة تسلسل متعددة ، وهذا متاح في صفحة أبحاث Pere Puigbo24. ومع ذلك ، فإنه من خارج نطاق هذا المنشور تقديم وصف مفصل لخادم الويب هذا. ومع ذلك ، يتم توفير بروتوكول محتمل لاستخدام هذه الاشعال لتضخيم جين EPSPS للعثور على حساسية الميكروبيوم للغليفوسات في الشكل 4. 3. جمع تسلسلات بروتين EPSPS من المستودعات العامة تسلسلات EPSPS لاستخدامها في دراسات التطور الكلي جمع بروتينات EPSPS من المستودعات العامة مثل PFAM 23 (قاعدة بيانات لعائلات البروتين 25) ، GenBank 24 (قاعدة بيانات للجينات والجينوم والبروتينات 26) ، COG 25 (مجموعات المجموعات التقويمية 27 ؛ قاعدة بيانات للبروتينات التقويمية من العتائق والبكتيريا) ؛ و PDB26 (بنك بيانات البروتين28 ؛ قاعدة بيانات لهياكل البروتين).ملاحظة: أظهرت دراسة حديثة أجراها الباحثون أنه يمكن استخدام هذه البروتينات لإجراء تحليلات تطورية دقيقة ومقارنة للتأثير المحتمل للغليفوسات على الكائنات الحية التي لها مسار شيكيمات12. طور المؤلفون موقعا إلكترونيا سهل الاستخدام يجمع معلومات عن عشرات الآلاف من تسلسلات بروتين EPSPS29 ، بما في ذلك مجموعة بيانات منسقة يدويا من البروتينات من ميكروبيوم الأمعاء البشرية12. وتشمل المعلومات الواردة في مجموعات البيانات المحسوبة مسبقا هذه التصنيف الحالي لنظام EPSPS إلى الغليفوسات الحساس والمقاوم للغليفوسات، والمعلومات التصنيفية عن الأنواع، وشروح الموقع النشط ل EPSPS، والروابط إلى قواعد بيانات PDB و NCBI. وعلاوة على ذلك، يتضمن خادم الويب رموز الهوية الخاصة ب EPSPS ووصلات إلى عدة قواعد بيانات خارجية (الجدول 2). تسلسلات EPSPS لاستخدامها في دراسات التطور الجزئي ATGCملاحظة: المستودعات العامة لتسلسل البروتين مفيدة لإجراء دراسات مقارنة بين الكائنات الحية البعيدة نسبيا؛ ومع ذلك ، فإن التأثير المحتمل للغليفوسات حديث نسبيا من وجهة نظر تطورية. وبالتالي ، في بعض الدراسات ، من الضروري مقارنة الأنواع ذات الصلة الوثيقة (على سبيل المثال ، سلالات مختلفة من نفس النوع البكتيري) لتحديد تأثير الغليفوسات14. وفي هذه الحالات، تعد قاعدة بيانات المجموعات الجينومية الضيقة القابلة للمحاذاة (ATGC)30، التي تحتوي على قائمة شاملة بالجينومات القديمة والبكتيرية الوثيقة الصلة، موردا أكثر ملاءمة. تحتوي قاعدة بيانات ATGC على معلومات عن عدة ملايين من البروتينات من آلاف الجينومات المنظمة في مئات المجموعات30. كل مجموعة جينوم قابلة للمحاذاة (تشترك الجينومات في الترادف على ≥85٪ من أطوالها) وضيقة (لها معدل استبدال مرادف أقل من التشبع). استخدم الباحثون مجموعة بيانات ATGC في دراسة حديثة لتحليل التغيرات التطورية الدقيقة في بروتينات EPSPS14. هناك حاجة إلى الخطوات التالية لتحديد تسلسل بروتين EPSPS في ATGC: قم بتنزيل قاعدة البيانات الكاملة ل ATGCs من الرابط31 وجميع بروتينات COG0128 (الرمز المقابل لبروتينات EPSPS في قاعدة البيانات)32 في مشروع محلي.ملاحظة: إذا كان الباحثون/المجربون مقيمين في فنلندا، فإن مركز CSC-IT للعلوم33 يوفر مرافق التخزين والبرمجيات. من المهم جمع جميع التسلسلات بتنسيق FASTA. بناء قاعدة بيانات انفجار من COG0128 التي تحتوي على تقويم العظام من بروتين EPSPS في مجموعة تمثيلية من أنواع بدائيات النوى. يحتوي CSC على برنامج الانفجار34 المثبت مسبقا ، مما يسمح باستخدام الأمر makeblastdb -in COG0128.fa -dbtype prot لإنشاء قاعدة بيانات مرجعية لتسلسلات EPSPS. قم بتعيين قاعدة بيانات ATGC على COG0128.fa (بروتينات EPSPS) باستخدام بحث انفجار تكراري باستخدام الأمر blastp -query [ATGC_X.fa] -db [COG0128.fa] -max_target_seqs 1 -outfmt 6 -out tmpfile -evalue 1e-150. ونتيجة لذلك ، فإنه يخلق مجموعة بيانات من تسلسلات بروتين EPSPS داخل كل منها. تتوفر مجموعة بيانات محسوبة مسبقا من تسلسلات بروتين EPSPS وثيقة الصلة من قاعدة بيانات ATGC29. 4. خوارزمية لتحديد الحساسية المحتملة للكائنات الحية للغليفوسات (خادم الويب EPSPSClass: المدخلات والمعالجة والمخرجات) ملاحظة: قام الباحثون بتنفيذ خادم سهل الاستخدام متاح مجانا في 29 لتحديد فئة تسلسلات بروتين EPSPS12,35. يتطلب الخادم فقط إدخال تسلسل البروتين بتنسيق FASTA لتحديد النسبة المئوية للهوية لكل فئة من فئات EPSPS وحساسيتها المحتملة للغليفوسات. علاوة على ذلك ، يمكن للمستخدمين استخدام خادم الويب لاختبار تسلسلاتهم المرجعية وعلامات الأحماض الأمينية الخاصة بهم. أولا ، تقوم الخوارزمية (الشكل 5) بمحاذاة تسلسلات الاستعلام والتسلسلات المرجعية باستخدام برنامج محاذاة تسلسل متعدد35 لتحديد مواقع الأحماض الأمينية. بعد ذلك ، يبحث عن وجود علامات الأحماض الأمينية لتحديد فئة EPSPS (I ، II ، III ، أو IV) من تسلسل الاستعلام. أدخل تسلسل بروتين EPSPS بتنسيق FASTA في مربع نص الإدخال لتحديد فئة الإنزيم (الشكل 6A)، ثم اضغط على إرسال. تقييم الحساسية المحتملة لتسلسل الاستعلام للغليفوسات (الشكل 6B-E) من مخرجات الخادم المقدمة:الناتج 1: جزء من علامات الأحماض الأمينية (أي الهوية) الموجودة في تسلسلات الاستعلام (الفئة الأولى والثانية والرابعة)، وعدد الزخارف (الفئة الثالثة).الناتج 2: محاذاة الاستعلام والتسلسلات المرجعية استنادا إلى بقايا العلامات.الناتج 3: المحاذاة الزوجية الكاملة للاستعلام والتسلسلات المرجعية.الناتج 4: التسلسلات المرجعية ل EPSPS: ضمة الكوليرا (vcEPSPS ، الفئة الأولى) ، Coxiella burnetii (cbEPSPS ، الفئة الثانية) ، Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS ، الفئة الثالثة) ، Streptomyces davawensis (sdEPSPS ، الفئة الرابعة). في نهاية صفحة الإخراج ، ابحث عن روابط لأدوات خارجية مثل blastp والمجالات المحفوظة لمزيد من التحليل لتسلسل EPSPS للاستعلام (الشكل 6F). 5. تقييم فئة EPSPS من العلامات الميكروبية العالمية (16S rRNA و ITS ) ملاحظة: تستند معظم دراسات الميكروبيوم إلى تحليل الحمض النووي الريبي 16S rRNA و / أو ITS36. في مثل هذه الحالات ، لا يمكن إجراء تحليل مباشر لتسلسل EPSPS. وبالتالي ، من الضروري اتباع نهج احتمالي لتقدير الحساسية المحتملة للكائنات الحية للغليفوسات. هذا التحليل مباشر ويوفر تقديرا معقولا لنوع تسلسلات EPSPS في مشروع الميكروبيوم. تنقسم العملية إلى 3 خطوات (الشكل 7 والشكل 8): تحديد تسلسلات EPSPS من المستودعات العامة. تم تجميع فئة EPSPS لمجموعة بيانات شاملة من التسلسلات التمثيلية وحسابها مسبقا من PFAM 37 و GenBank38 و COG39 و PDB 40 و ATGC 30. يمكنك الوصول إلى مجموعات البيانات هذه من الصفحة الرئيسية لخادم EPSPSClass ، والتي تحتوي على معلومات تصنيفية وفئة EPSPS لأكثر من 50000 تسلسل (الشكل 7). قياس ارتفاع النباتات التجريبية كل أسبوعين خلال موسم النمو، ووزن الكتلة الحيوية فوق سطح الأرض للنباتات في نهاية الموسم الحقلي لمقارنة نمو النباتات بالجنيه الإسترليني وقطع أراضي التحكم.ملاحظة: لم يتم بعد تحليل تحليلات الميكروبات من التجارب الميدانية بشكل كامل. استخدم جدول بيانات لتعيين وحدات OTUs البكتيرية (استنادا إلى 16S rRNA أو ITS) من تجارب الميكروبيوم إلى مجموعات بيانات محسوبة مسبقا.ملاحظة: أظهرت الدراسات السابقة أن فئة EPSPS (أي الحساسية الجوهرية للغليفوسات) محفوظة بشكل كبير داخل المجموعة الجينية14. وبالتالي ، من الآمن نسبيا افتراض أن الأنواع ذات الصلة الوثيقة من التصنيفات المحفوظة للغاية قد يكون لها استجابات EPSPS مماثلة للغليفوسات (الشكل 8). في جدول البيانات نفسه، احسب الحساسية الجوهرية للغليفوسات، استنادا إلى درجة احتمالية (S = s / (s + r + u) حيث S: درجة الحساسية؛ s: عدد التسلسلات التي يحتمل أن تكون حساسة؛ r: عدد التسلسلات التي يحتمل أن تكون مقاومة؛ u: عدد التسلسلات غير المصنفة) المحسوبة من تسلسلات EPSPS المعروفة في قواعد البيانات العامة.ملاحظة: تتراوح هذه النتيجة من 0 (لا توجد تسلسلات EPSPS حساسة في التصنيف) إلى 1 (جميع التسلسلات في التصنيف حساسة للغليفوسات) (الشكل 8). وعلاوة على ذلك، هناك قيم بينهما – أي الأنواع ذات السلالات الحساسة أو المقاومة أو غير المعروفة.

Representative Results

الهدف من هذا البروتوكول هو توفير خط أنابيب عام ، من التجارب الميدانية إلى تحليلات المعلوماتية الحيوية ، يحدد كميا الحساسية المحتملة للكائنات الحية لغليفوسات مبيدات الأعشاب. وفي التجربة 2، بلغ متوسط تركيز الغليفوسات في علف السمان 164 مغ/كغ وكان متوسط تركيز الغليفوسات في عينات الفضلات (البول والبراز معا) 199 مغ/كغ. وكان الفراش الذي تم جمعه من السمان الذي يتغذى على الأعلاف الملوثة بالجنيه الإسترليني يحتوي في المتوسط على 158 مغ/كغ وفراش مراقبة يقيس 0.17 مغ/كغ من الغليفوسات (الجدول 3). في التجارب الميدانية ، استجابت الأنواع النباتية بشكل مختلف لبقايا الغليفوسات في التربة (القسم 1). كانت الكتلة الحيوية لاغتصاب الشوفان واللفت أكبر في التربة الضابطة مقارنة بالتربة المعالجة بالجنيه الإسترليني. ومع ذلك ، يبدو أن حبوب الفابا والبطاطس تستفيد من علاج GBP في نهاية موسم النمو15. الغليفوسات في سماد الدواجن يقلل من نمو النبات في العشب (Festuca pratensis) والفراولة (Fragaria x vescana) (القسم 1). لم يتم بعد تحليل تحليلات الميكروبات من التجارب الميدانية بشكل كامل ولم يتم عرضها هنا (القسم 2). وتوفر نتائج هذا البروتوكول، عند قراءتها إما بشكل مباشر (كما هو مبين في القسمين 3 و4) أو بشكل غير مباشر (القسم 5)، مقياسا لنسبة الكائنات الحية التي يحتمل أن تكون حساسة ومقاومة للغليفوسات في مجموعة بيانات (الشكل 9). تم اختبار استخدام هذه الطريقة مع مجموعة من تسلسلات بروتين EPSPS من الأنواع الميكروبية من ميكروبيوم الأمعاء البشري الأساسي التي تم الحصول عليها من المستودعات العامة12. في الدراسة ، تم تحليل 890 سلالة من أكثر 101 نوع بكتيري وفرة باستخدام طريقة EPSPSClass لتحديد نسبة البكتيريا الحساسة والمقاومة. أظهرت النتائج أن 54٪ من الأنواع الموجودة في ميكروبيوم الأمعاء البشري الأساسي يحتمل أن تكون حساسة للغليفوسات12. ويلاحظ هذا الاتجاه أيضا في معظم العالم بدائي النواة. بالإضافة إلى ذلك ، في حقيقيات النوى (النباتات والفطريات بشكل رئيسي) ، تكون نسبة الأنواع التي يحتمل أن تكون حساسة أعلىمن 12. علاوة على ذلك ، استخدمنا هذه الطريقة لتحديد التغيرات في الحساسية في بروتين EPSPS على مستوى التطور الجزئي (الشكل 10)14. حددنا التغيرات في حالة الحساسية في 12 من أصل 32 مجموعة وثيقة الصلة من بدائيات النوى التي تم تحليلها (الجدول 4)14. وبالتالي ، فإن الاستخدام المستمر لل GBPs قد ينتج dysbiosis الميكروبي (أي اختلال التوازن بين الأنواع البكتيرية الحساسة والمقاومة) في ميكروبات النبات والحيوان والتربة. علاوة على ذلك ، فقد افترض أن الزيادة في البكتيريا المقاومة للغليفوسات قد تعزز الميكروبات المقاومة للأدوية المتعددة14،41،42. وبالتالي ، يلقي هذا البروتوكول الضوء على تفسير كل هذه السيناريوهات ، حيث توفر طريقة تصنيف EPSPS تقديرا مباشرا للحساسية الجوهرية للميكروبات للغليفوسات. نظرا للحساسية الجوهرية لبروتين EPSPS للغليفوسات المحفوظة من الناحية الفيلوجينية14 ، فمن الممكن استقراء النتائج من مجموعات البيانات الموجودة في ميكروبات غير معروفة (الشكل 8). الشكل 1: خط الأنابيب العام هذا هو خط أنابيب عام لتحليل الحساسية للجنيه الإسترليني من التجارب الميدانية إلى تحليل المعلوماتية الحيوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: التجربة الميدانية 1 لاختبار آثار بقايا الجنيه الإسترليني على الميكروبات المرتبطة بالنباتات المحصولية. يتكون المجال التجريبي من 10 قطع تحكم بالتناوب و 10 قطع معالجة GBP (23 م × 1.5 م) مع شرائط عازلة بطول 1.5 م بين المؤامرات. مرتين في السنة منذ عام 2014 ، تمت معالجة قطع أراضي الجنيه الإسترليني بالجنيه الإسترليني التجاري (تركيز الغليفوسات 450 جم L-1 ، ومعدل التطبيق 6.4 لتر هكتار-1 في 5 لتر من مياه الصنبور لكل قطعة أرض) وقطع التحكم بنفس الكمية من مياه الصنبور بدون غليفوسات. تم تطبيق العلاجات باستخدام خزان ضغط يعمل يدويا باستخدام غطاء بلاستيكي في طرف الرش لحماية GBPs من الانتشار خارج قطع المعالجة. بعد فترة أمان استمرت أسبوعين بعد تطبيق GBP ، تم زرع الشوفان (Avena sativa) ، وفاصوليا فابا (Vicia faba) ، واغتصاب اللفت (Brassica rapa subsp. oleifera) ، وزرعت البطاطس (Solanum tuberosum) في قطع الأراضي. تم جمع عينات الميكروبات من نباتات المحاصيل المدروسة والأوراق والجذور عدة مرات منذ بدء التجربة في عام 2014. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: اختبرت التجربة الميدانية 2 عواقب بقايا الجنيه الإسترليني في سماد السماد لاثنين من المحاصيل المعمرة والميكروبات المرتبطة بها. تم استخدام الفراش الذي تم جمعه من تجربة قفص لمدة 12 شهرا مع السمان الياباني الذي يتغذى على التحكم أو الأعلاف الملوثة بالجنيه الإسترليني كسماد سماد في تجربة ميدانية. يتكون الحقل التجريبي من 18 قطعة تحكم و 18 قطعة أرض GBP (1 م × 1 م) مرتبة في شبكة رقعة شطرنج 6 × 6. تم نشر الفراش في الحقل التجريبي مرتين ، في أغسطس 2018 ومايو 2019 (25 لتر / مؤامرة). تم تخصيب قطع أراضي التحكم بالفراش الذي تم جمعه من السمان الذي تم تغذيته بتغذية التحكم وقطع الأراضي GBP مع الفراش من السمان الذي تم تغذيته بالأعلاف الملوثة بالجنيه الإسترليني. وكانت بقايا الغليفوسات في الفراش الخاضع للمراقبة 0.17 مغ/كغ من الغليفوسات، وفي الفراش الغاليفوسات، كانت الكمية 158 مغ/كغ من الغليفوسات. تم زرع اثنين من النباتات الداخلية التكافلية (E +) ، واثنين من النباتات الداخلية الخالية من النباتات (E-) Festuca pratensis ، واثنين من Fragaria x vescana لكل قطعة أرض في سبتمبر 2018 ، بعد شهر واحد تقريبا من انتشار الفراش الأول. تم إجراء قياسات لأداء النبات ولياقته بالإضافة إلى أخذ عينات من الميكروبات المرتبطة بالجذور والأوراق خلال موسمين متتاليين من النمو (2019 و 2020). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: تحليل الأصناف الميكروبية باستخدام جين 16S rRNA / منطقة ITS وحساسية الميكروبيومات للغليفوسات باستخدام جين EPSPS. (أ) تحليل تسلسلات 16S rRNA أو ITS لتحديد الأصناف الميكروبية. (ب) تحليل تسلسلات EPSPS لتحديد حساسية الميكروبات للغليفوسات (GS-glyphosate sensitive/GR-glyphosate resistance) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 5: خوارزمية لتحديد فئة تسلسلات بروتين EPSPS. الإدخال هو تسلسل بروتين EPSPS بتنسيق FASTA. تقوم الخوارزمية بإجراء مقارنات مع علامات الأحماض الأمينية المعروفة في تسلسلات البروتين المرجعية التي تحدد الحساسية المحتملة للغليفوسات. تم تنفيذ الخوارزمية في خادم الويب EPSPSClass29 الذي يمكن الوصول إليه بحرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 6: المدخلات والمخرجات الأساسية لخادم الويب EPSPSClass. (أ) الإدخال: تسلسل بروتين EPSPS بتنسيق FASTA. (ب) الناتج 1 – الهوية: جزء من علامات الأحماض الأمينية الموجودة في تسلسلات الاستعلام (الفئات الأولى إلى الرابعة) والزخارف (الفئة الثالثة). (ج) الناتج 2 – الهوية: محاذاة الاستعلام والتسلسلات المرجعية. (د) الناتج 3 – المحاذاة الزوجية للاستعلام والتسلسلات المرجعية. (ه) تسلسلات EPSPS المرجعية: ضمة الكوليرا (vcEPSPS، الفئة الأولى)، كوكسيلا بورنيتي (cbEPSPS، الفئة الثانية)، Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS، الفئة الثالثة)، Streptomyces davawensis (sdEPSPS، الفئة الرابعة). (و) روابط لإجراء عمليات بحث عن الانفجار الإضافي وتحديد النطاقات المحفوظة يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 7: الوصول إلى مجموعات البيانات المحسوبة مسبقا من تسلسلات EPSPS. اتبع المؤشرات الواردة في الشكل للوصول إلى مجموعة البيانات المحسوبة مسبقا لتسلسلات EPSPS. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 8: مثال على كيفية تقدير الحساسية المحتملة في مشاريع الميكروبيوم بدون تسلسلات EPSPS. يستخدم المثال قيما من قاعدة بيانات Alignable Tight Genomic Clusters30 ، والتي تحتوي على تسلسلات من الأنواع بدائية النواة. الأنواع الافتراضية من مشروع الميكروبيوم هي المكورات العنقودية الذهبية ، Corynebacterium diphtheriae ، Campylobacter jejuni ، Chlamydia psittaci و Sulfolobus islandicus. يتم حساب درجة الحساسية للغليفوسات على أنها Number_Sensitive_Sequences / Total_Number_Of_Sequences. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 9: مخطط تفسير النتائج من هذا البروتوكول والسيناريوهات التطورية الافتراضية. (أ) في الميكروبيوم ، تبلغ نسبة الحساسية المحتملة (باللون الأخضر) والمقاومة (باللون الأحمر) حوالي 50:50. تشير النقاط السوداء إلى الأنواع الميكروبية غير المصنفة ؛ وبالتالي ، فإن حساسيتها للغليفوسات غير معروفة. في بعض الميكروبات ، تكون نسبة البكتيريا الحساسة أعلى قليلا ، كما هو الحال في ميكروبيوم الأمعاء البشرية12. (ب) بمرور الوقت، قد يؤدي استخدام الغليفوسات إلى خلل بيولوجي ميكروبي (أي اختلال في نسبة البكتيريا الحساسة والمقاومة) مما يؤدي إلى سيناريوهات افتراضية مختلفة. (ج) الحالة الافتراضية 1 (بدون اختيار): استخدام الغليفوسات لا يؤثر على الميكروبيوم؛ وبالتالي ، فإن نسبة البكتيريا الحساسة والمقاومة تظل ثابتة. (د) الحالة الافتراضية 2: استخدام الغليفوسات يزيل البكتيريا الحساسة للغليفوسات من السكان. نتوقع أن هذا السيناريو قد يعتمد على الجرعة. (ه) الحالة الافتراضية 3: ضغط الاختيار الناتج عن استخدام الغليفوسات يعزز الطفرات في جين EPSPS التي تغير حالة حساسية البكتيريا. وبالتالي ، يصبح جميع السكان الميكروبيين مقاومين للغليفوسات. علاوة على ذلك ، في هذا السيناريو ، قد تكون هناك زيادة في البكتيريا المقاومة للأدوية المتعددة. (و) الحالة الافتراضية 4: يؤدي استخدام الغليفوسات إلى تغيير تكوين أنواع بكتيرية معينة، مما يؤدي إلى اختلال التوازن تجاه البكتيريا المقاومة، في حين أن بعض الأنواع البكتيرية تظل دون تغيير، ربما بسبب آليات مقاومة إضافية مثل مضخات التدفق السائلة أو عن طريق الإفراط في التعبير عن الجين EPSPS 13. قد يؤدي هذا السيناريو أيضا إلى زيادة في البكتيريا المقاومة للغليفوسات ، وكذلك زيادة في المقاومة البكتيرية للمضادات الحيوية الإضافية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 10: توزيع الحساسية المتوقعة للغليفوسات عبر شجرة الأنواع. تشير المخططات الدائرية إلى نسبة الأنواع التي يفترض أنها حساسة (خضراء) أو مقاومة (حمراء) للغليفوسات وغير مصنفة (سوداء). وقد تم تكييف هذا الرقم بإذن من Rainio et al.14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 11: مدخلات ومخرجات خادم الويب EPSPSClass لاختبار التسلسل المرجعي الخاص بالمستخدم. (أ) الإدخال 1: تسلسل الاستعلام. (ب) المدخل 2: التسلسل المرجعي. (ج) الإدخال 3: علامات الأحماض الأمينية في التسلسلات المرجعية. (د) الإخراج: الهوية: جزء من علامات الأحماض الأمينية في تسلسلات الاستعلام (الفئة I-IV والتسلسلات المرجعية الخاصة بالمستخدم). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الجدول 1: قائمة الاشعال لتضخيم PCR لجين 16S rRNA ومنطقة ITS في تحليل الميكروبيوم يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول. الجدول 2: رموز إنزيم 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) في قواعد بيانات مختلفة يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول. الجدول 3: متوسط تركيز الغليفوسات يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول. الجدول 4: جدول موجز للنسبة المئوية للأنواع الحساسة/المقاومة للغليفوسات. تم تكييف هذا الجدول بإذن من Rainio et al.14. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول. الجدول 5: مواضع علامات الأحماض الأمينية في التسلسلات المرجعية يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

يوفر هذا البروتوكول إرشادات عامة حول كيفية تحديد تأثير GBP على الميكروبات بناء على تحليل بروتين EPSPS. يحتوي البروتوكول على ثلاث خطوات حاسمة رئيسية: (i) تحديد كمية بروتين EPSPS من بيانات الميكروبيوم. هذه الخطوة حاسمة لأن EPSPS هو الإنزيم المستهدف المباشر لمبيدات الأعشاب. وبالتالي ، قد تتأثر الأنواع التي لديها نسخة من جين EPSPS باستخدام GBP. ومع ذلك ، حتى الأنواع التي تفتقر إلى نسخة من جين EPSPS قد تتأثر بمبيدات الأعشاب من خلال آليات بديلة غير مستهدفة43,44. (ii) إذا لم يتم تضمين تحليل جين EPSPS في تصميم الدراسة ، فمن الممكن الحصول على تقدير جيد من خلال تحليل 16S rRNA (البكتيريا) أو ITS (الفطريات). في هذه الحالة ، من الضروري الاعتماد على جدول مرجعي شامل (على سبيل المثال ، توفر قاعدة بيانات ATGC تسلسلات لبروتين EPSPS من عدة أنواع وثيقة الصلة). (iii) ينقسم بروتين EPSPS إلى يحتمل أن يكون حساسا أو مقاوما للغليفوسات اعتمادا على بعض بقايا الأحماض الأمينية في الموقع النشط ل EPSPS. ومع ذلك ، فإن الطفرات التي تؤثر على حمض أميني واحد قد تغير هذا التصنيف45 وقد تحدث التحولات بين الطبقات في فترة زمنية قصيرة نسبيا14.

يمكن تحديد الحساسية المحتملة للكائنات الحية للغليفوسات بواسطة الجينوم المرجعي وعلامات الأحماض الأمينية ومحاذاة التسلسل. (ط) الجينوم المرجعي: يمكن تصنيف إنزيم EPSPS على أنه يحتمل أن يكون حساسا (الفئة الأولى [ألفا أو بيتا]46،47) أو مقاوما (الفئات الثانية48،49 والثالثة50 والرابعة51) للغليفوسات استنادا إلى وجود علامات وزخارف الأحماض الأمينية (في حالة الفئة الثالثة). تعتمد علامات وزخارف الأحماض الأمينية هذه على موقع بقايا الأحماض الأمينية في بروتين EPSPS من ضمة الكوليرا (vcEPSPS ، الفئة الأولى) ، و Coxiella burnetii (cbEPSPS ، الفئة الثانية) ، و Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS ، الفئة الثالثة) ، و Streptomyces davawensis (sdEPSPS ، الفئة الرابعة). (ii) علامات الأحماض الأمينية: يتفاعل الغليفوسات مع إنزيم EPSPS ويتنافس مع فوسفونولبيروفات (PEP ، الركيزة الثانية من إنزيم EPSPS)52,53. في بعض الأنواع ، توفر تغيرات الأحماض الأمينية الصغيرة في تسلسل EPSPS تقاربا أعلى ل PEP ومقاومة للغليفوسات 12،14،52،54،55. في تسلسلات أخرى ، يربط الغليفوسات تسلسل EPSPS في تشكيل غير مثبط 45. على الرغم من وصف العديد من تسلسلات EPSP المقاومة 12،14،48،49،52،54،55 و56،57 EPSP المتسامحة إلى الغليفوسات ، فإن نظام التصنيف الحالي ل EPSPS مقسم إلى أربع فئات رئيسية (I-IV )12 (الجدول 5 ). (iii) محاذاة التسلسل: من أجل تصنيف إنزيم EPSPS ، أجرينا محاذاة زوجية ، مع معلمات افتراضية متعددة لبرنامج محاذاة التسلسل35-، من تسلسل الاستعلام مقابل كل واحد من التسلسلات المرجعية (vcEPSPS و cbEPSPS و bvEPSPS و sdEPSPS). هذه المحاذاة ضرورية لتحديد مواقع علامات الأحماض الأمينية في تسلسل الاستعلام. نتيجة لذلك ، يتم تصنيف الإنزيم على أنه موصوف من الفئة12 I و / أو II و / أو IV بناء على وجود علامات الأحماض الأمينية وعلامات الزخارف القائمة على الفئة الثالثة.

يعتمد البروتوكول على أربعة أنواع معروفة من EPSPS: نوع واحد حساس ، والثلاثة الأخرى مقاومة). ومع ذلك ، فإن ما يقرب من 10٪ من تسلسلات EPSPS في بدائيات النوى غير مصنفة بعد (16٪ في archaea و 8٪ في البكتيريا)12. وبالتالي ، يجب إجراء مزيد من الأبحاث لتحليل هذه التسلسلات لتحديد حساسية الغليفوسات. يوفر خادم EPSPSClass خيارا لاختبار علامات جينية جديدة. تحديد الفئات المعروفة من EPSPS واضح ، كما هو موضح في القسم 4.4. والشكل 5. علاوة على ذلك ، في الحالات التي يرغب فيها المستخدمون في مقارنة الاستعلام الخاص بهم والبروتينات المرجعية ، يوفر الخادم خيارا لتضمين تسلسل مرجعي يدويا ومجموعة من علامات الأحماض الأمينية (الشكل 11). يمكن استخدام هذا الخيار لتحديد فئات جديدة من EPSPS ، وكذلك لاختبار مبيدات الأعشاب الأخرى والتسلسلات المستهدفة.

يتم تحديد تحليل فئة EPSPS من خلال تحليل التسلسل ووجود / عدم وجود علامات الأحماض الأمينية. هذا تقدير أولي يمكن استخدامه لاختبار الفرضيات في هذا المجال. تم تحديد علامات الأحماض الأمينية في الأدبيات القائمة على الدراسات التجريبية والرصدية 46،47،48،49،50،51. ومع ذلك ، تم اختبار تسلسلات البروتين المرجعية لتحديد فئة EPSPS فقط في عدد محدود من الأنواع وقد تفشل أحيانا في تفسير مقاومة الغليفوسات. قد يؤثر تأثير الطفرات التعويضية ، والمجالات المرتبطة ب EPSPS (معظمها في الفطريات) أيضا على الحساسية للغليفوسات58. يعتمد تحليل هذه الورقة على أربع فئات EPSPS. أظهرت دراسة استقصائية للبكتيريا في ميكروبيوم الأمعاء البشري أن حوالي 30٪ منها غير مصنفة (أي أن بروتينات EPSPS من هذه الأنواع لا تنتمي إلى أي من الفئات المعروفة) ، وهناك حاجة إلى دراسات إضافية لتحديد فئات EPSPS الأخرى. أيضا ، تجدر الإشارة إلى أن تسلسل بروتين EPSPS في البكتيريا والنباتات هو أحادي المجال ، في حين أن بروتينات EPSPS الفطرية تحتوي على عدة مجالات59. وبالتالي ، قد يؤدي طي البروتين في الفطريات إلى استجابة مختلفة لإنزيم EPSPS للغليفوسات. وعلاوة على ذلك، لا تؤخذ في الاعتبار آليات مقاومة إضافية غير مستهدفة (مثل مضخات التدفق السائلة والتعبير المفرط عن جين EPSPS 13) أو الحساسية للغليفوسات (على سبيل المثال، تأثير الغليفوسات على سلسلة نقل الميتوكوندريا12).

على الرغم من أن الجنيه الإسترليني كان موجودا كمبيد أعشاب منذ عام 1974 وتم استخدامه على نطاق واسع منذ عام 1991 ، إلا أن هذه هي أول طريقة للمعلوماتية الحيوية لتحديد الحساسية المحتملة للكائنات الحية للغليفوسات. تعتمد الطريقة على تحديد بقايا الأحماض الأمينية المعروفة في التسلسل المستهدف. وبالتالي ، توفر طريقتنا تقديرا أساسيا للتأثير المحتمل للغليفوسات على الأنواع. في المستقبل القريب ، يجب أن تتضمن طرق المعلوماتية الحيوية الجديدة فئات إضافية من بروتين EPSPS لتحديد الحساسية المحتملة للغليفوسات للتسلسلات غير المصنفة12،54،55. بالإضافة إلى ذلك ، بالنظر إلى أن السلوك الدقيق لإنزيم EPSPS قد يختلف حسب تغيرات الأحماض الأمينية المفردة 12,14,52,54,55 ، يجب أن تأخذ في الاعتبار في تجارب silico الاختلافات الصغيرة في طي بروتين EPSPS ، وكذلك تأثير المجالات المرتبطة ب EPSPS على بنية البروتين في الفطريات 58 . علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن التسامح مع الغليفوسات يمكن أن ينتج عن طريق الإفراط في التعبير عن بروتين EPSPS56,57 ؛ وبالتالي يمكن استخدام تحليلات المعلوماتية الحيوية القائمة على تحسين استخدام الكودون60 لتحديد تسلسلات EPSPS الجديدة التي تزيد من التعبير الجيني أو تقلل منه.

يحتاج المزارعون والسياسيون وصناع القرار بشكل عاجل إلى فهم شامل للمخاطر المرتبطة بالاستخدام المكثف للمبيدات. وبالتالي ، فإن كل من أدوات المعلوماتية الحيوية التي تكشف عن الحساسية المحتملة للكائنات الحية لمبيدات الآفات والدراسات التجريبية المكررة جيدا والعشوائية والواقعية الميدانية التي أجريت في بيئات مختلفة ضرورية. يمكن تعديل طريقة المعلوماتية الحيوية المقدمة المصممة لفحص حساسية الكائنات الحية للغليفوسات لمبيدات الآفات الأخرى. وبالمثل ، يمكن تطبيق طرق البيئة التجريبية لدراسة أي أسئلة بيئية ذات صلة. معا ، يمكن استخدام الطرق لإثبات الإصابات بين الملاحظات الميدانية والبيانات الجينومية واستخدام مبيدات الآفات. جميع الأساليب المقدمة لا تقدر بثمن في تقييم المخاطر. ويمكن استخدام أساليب المعلوماتية الحيوية، على سبيل المثال، في رصد التكيفات الميكروبية مع الكيماويات الزراعية وتوفير طريقة كمية لاختبار المخاطر المحتملة الأخرى المرتبطة بها، مثل زيادة مقاومة مسببات الأمراض للمواد الكيميائية الزراعية، والآثار السلبية على الميكروبات المستخدمة كعوامل مكافحة بيولوجية في الإدارة المتكاملة للآفات، ومقاومة المضادات الحيوية في البكتيريا.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل أكاديمية فنلندا (المنحة رقم 311077 إلى مارجو هيلاندر).

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument INVITEK Molecular 1037100300 Genomic DNA extraction from plant tissues
dNTP mix (10 mM each) BIO-RAD 1852196 For PCR reactions
GoTaq G2 DNA Polymerase kit Promega M7848 PCR buffer and DNA Polymerase for PCR amplification
Invisorb Spin Plant Mini Kit Agilent G2939B To check the concentration and quality of PCR products
Ion Chip Minifuge sage science PIP0001 For size fractionation of PCR amplicons
Ion PGM System ThermoFisher Scientific 4462921 For targeted sequencing of microbial PCR products
Ion PGM Torrent Server ThermoFisher Scientific 4483643 For targeted sequencing of microbial PCR products
Pippinprep ThermoFisher Scientific 4479672 For targeted sequencing of microbial PCR products
Pressure tank Berthoud 102140 For sprayin glyphosate based products in field
Primers ThermoFisher Scientific R0192 For PCR amplification
Rotary tiller Grillo 984511 For tilling the soil in experimental plots
S1000 ThermalCycler Sigma-Aldrich Custom-made For PCR amplification
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams, G. M., Kroes, R., Munro, I. C. Safety evaluation and risk assessment of the herbicide Roundup and its active ingredient, glyphosate, for humans. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 31, 117-165 (2000).
  2. Muola, A., et al. Risk in the circular food economy: Glyphosate-based herbicide residues in manure fertilizers decrease crop yield. The Science of the Total Environment. 750, 141422 (2021).
  3. Helander, M., Saloniemi, I., Saikkonen, K. Glyphosate in northern ecosystems. Trends in Plant Science. 17 (10), 569-574 (2012).
  4. Fuchs, B., Saikkonen, K., Helander, M. Glyphosate-Modulated Biosynthesis Driving Plant Defense and Species Interactions. Trends in Plant Science. 26 (4), 312-323 (2021).
  5. Helander, M., Saloniemi, I., Omacini, M., Druille, M., Salminen, J. -. P., Saikkonen, K. Glyphosate decreases mycorrhizal colonization and affects plant-soil feedback. The Science of the Total Environment. 642, 285-291 (2018).
  6. Bai, S. H., Ogbourne, S. M. Glyphosate: environmental contamination, toxicity and potential risks to human health via food contamination. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (19), 18988-19001 (2016).
  7. Cuhra, M., Bøhn, T., Cuhra, P. Glyphosate: too much of a good thing. Frontiers in Environmental Science. 4, (2016).
  8. de Brito Rodrigues, L., et al. Impact of the glyphosate-based commercial herbicide, its components and its metabolite AMPA on non-target aquatic organisms. Mutation Research. 842, 94-101 (2019).
  9. Steinrücken, H. C., Amrhein, N. The herbicide glyphosate is a potent inhibitor of 5-enolpyruvylshikimic acid-3-phosphate synthase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 94 (4), 1207-1212 (1980).
  10. Bentley, R. The shikimate pathway–a metabolic tree with many branches. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 25 (5), 307-384 (1990).
  11. Richards, T. A., et al. Evolutionary origins of the eukaryotic shikimate pathway: gene fusions, horizontal gene transfer, and endosymbiotic replacements. Eukaryotic Cell. 5 (9), 1517-1531 (2006).
  12. Leino, L., et al. Classification of the glyphosate target enzyme (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) for assessing sensitivity of organisms to the herbicide. Journal Of Hazardous Materials. 408, 124556 (2021).
  13. Rainio, M. J., Ruuskanen, S., Helander, M., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Puigbò, P. Adaptation of bacteria to glyphosate: a microevolutionary perspective of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP) synthase. BioRxiv. , (2020).
  14. Rainio, M. J., Ruuskanen, S., Helander, M., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Puigbò, P. Adaptation of bacteria to glyphosate: a microevolutionary perspective of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase. Environmental Microbiology Reports. 13 (3), 309-316 (2021).
  15. Helander, M., Pauna, A., Saikkonen, K., Saloniemi, I. Glyphosate residues in soil affect crop plant germination and growth. Scientific Reports. 9 (1), 19653 (2019).
  16. Ruuskanen, S., Rainio, M. J., Uusitalo, M., Saikkonen, K., Helander, M. Effects of parental exposure to glyphosate-based herbicides on embryonic development and oxidative status: a long-term experiment in a bird model. Scientific Reports. 10 (1), 6349 (2020).
  17. Ruuskanen, S., et al. female preference and adverse developmental effects of glyphosate-based herbicides on ecologically relevant traits in Japanese quails. Environmental Science & Technology. 54 (2), 1128-1135 (2020).
  18. Mäki, A., Rissanen, A. J., Tiirola, M. A practical method for barcoding and size-trimming PCR templates for amplicon sequencing. Biotechniques. 60 (2), 88-90 (2016).
  19. Chelius, M. K., Triplett, E. W. The diversity of archaea and bacteria in association with the roots of Zea mays L. Microbial Ecology. 41 (3), 252-263 (2001).
  20. Lane, D. J. 16S/23S rRNA sequencing. Nucleic acid techniques in bacterial systematics. , 115-175 (1991).
  21. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. Plos One. 8 (8), 71360 (2013).
  22. Zheng, D., Alm, E. W., Stahl, D. A., Raskin, L. Characterization of universal small-subunit rRNA hybridization probes for quantitative molecular microbial ecology studies. Applied and Environmental Microbiology. 62 (12), 4504-4513 (1996).
  23. . JoVE Supplementary Material Available from: https://ppuigbo.me/programs/EPSPSClass/JOVE_SM (2021)
  24. . Alignments Conserved Positions Available from: https://ppuigbo.me/programs/primers (2021)
  25. . NCBI GenBank Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/genbank (2021)
  26. . COG Database Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/research/cog (2021)
  27. . Protein Data Bank Available from: https://www.rcsb.org (2021)
  28. . EPSPSClass Available from: https://ppuigbo.me/programs/EPSPSClass (2021)
  29. Kristensen, D. M., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. ATGC database and ATGC-COGs: an updated resource for micro- and macro-evolutionary studies of prokaryotic genomes and protein family annotation. Nucleic Acids Research. 45, 210-218 (2017).
  30. . CSC – IT CENTER FOR SCIENCE LTD Available from: https://www.csc.fi (2021)
  31. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).
  32. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research. 32 (5), 1792-1797 (2004).
  33. Tkacz, A., Hortala, M., Poole, P. S. Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples. Microbiome. 6 (1), 110 (2018).
  34. El-Gebali, S., et al. The Pfam protein families database in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 427-432 (2019).
  35. Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, 36-42 (2013).
  36. Galperin, M. Y., Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. Expanded microbial genome coverage and improved protein family annotation in the COG database. Nucleic Acids Research. 43, 261-269 (2015).
  37. Burley, S. K., Berman, H. M., Kleywegt, G. J., Markley, J. L., Nakamura, H., Velankar, S. Protein data bank (PDB): the single global macromolecular structure archive. Methods in Molecular Biology. 1607, 627-641 (2017).
  38. Raoult, D., Hadjadj, L., Baron, S. A., Rolain, J. -. M. Role of glyphosate in the emergence of antimicrobial resistance in bacteria. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76 (7), 1655-1657 (2021).
  39. Liu, J., Gefen, O., Ronin, I., Bar-Meir, M., Balaban, N. Q. Effect of tolerance on the evolution of antibiotic resistance under drug combinations. Science. 367 (6474), 200-204 (2020).
  40. Peixoto, F. Comparative effects of the Roundup and glyphosate on mitochondrial oxidative phosphorylation. Chemosphere. 61 (8), 1115-1122 (2005).
  41. Peillex, C., Pelletier, M. The impact and toxicity of glyphosate and glyphosate-based herbicides on health and immunity. Journal of Immunotoxicology. 17 (1), 163-174 (2020).
  42. Funke, T., Han, H., Healy-Fried, M. L., Fischer, M., Schönbrunn, E. Molecular basis for the herbicide resistance of Roundup Ready crops. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 13010-13015 (2006).
  43. Light, S. H., Krishna, S. N., Minasov, G., Anderson, W. F. An unusual cation-binding site and distinct domain-domain interactions distinguish Class II Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases. Biochemistry. 55 (8), 1239-1245 (2016).
  44. Firdous, S., Iqbal, S., Anwar, S., Jabeen, H. Identification and analysis of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) gene from glyphosate-resistant Ochrobactrum intermedium Sq20. Pest Management Science. 74 (5), 1184-1196 (2018).
  45. Barry, G. F., Kishore, G. M., Padgette, S. R., Stallings, W. C. Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases. United States Patient. , (1997).
  46. Priestman, M. A., Funke, T., Singh, I. M., Crupper, S. S., Schönbrunn, E. 5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Staphylococcus aureus is insensitive to glyphosate. FEBS Letters. 579, 728-732 (2005).
  47. Carozzi, N., Carr, B., Hammer, P. E. Identification of a new class of EPSP synthases. World Intellectual Property Organization Publ.of the Int.Appl. without Int.search. , (2006).
  48. Lira, J. M., Cicchillo, R. M., Nair, S. K. Novel class of glyphosate resistance genes. US Patent. , (2013).
  49. Funke, T., et al. Structural basis of glyphosate resistance resulting from the double mutation Thr97 -> Ile and Pro101 -> Ser in 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 284 (15), 9854-9860 (2009).
  50. Schönbrunn, E., et al. Interaction of the herbicide glyphosate with its target enzyme 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase in atomic detail. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (4), 1376-1380 (2001).
  51. Stalker, D. M., Hiatt, W. R., Comai, L. A single amino acid substitution in the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase confers resistance to the herbicide glyphosate. The Journal of Biological Chemistry. 260 (8), 4724-4728 (1985).
  52. Eschenburg, S., Healy, M. L., Priestman, M. A., Lushington, G. H., Schönbrunn, E. How the mutation glycine96 to alanine confers glyphosate insensitivity to 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli. Planta. 216 (1), 129-135 (2002).
  53. Achary, V. M. M., et al. Overexpression of improved EPSPS gene results in field level glyphosate tolerance and higher grain yield in rice. Plant Biotechnology Journal. 18 (12), 2504-2519 (2020).
  54. Huang, Z., Liu, Y., Zhang, C., Jiang, C., Huang, H., Wei, S. Molecular basis of natural tolerance to glyphosate in Convolvulus arvensis. Scientific Reports. 9 (1), 8133 (2019).
  55. Tall, T. . A census analysis of the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP) synthase and EPSP-associated domains. , (2020).
  56. Tall, T., Puigbò, P. The glyphosate target enzyme 5-Enolpyruvyl Shikimate 3-Phosphate Synthase (EPSPS) contains several EPSPS-associated domains in fungi. ATLA Summary of Proceedings. 76 (1), 6 (2020).
  57. Puigbò, P., Guzmán, E., Romeu, A., Garcia-Vallvé, S. OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Research. 35, 126-131 (2007).

Tags

GlyphosateMicrobiome16S RRNAExperimental DesignPlant SamplesQuail BeddingPCR AmplificationDNA ExtractionBioinformatics Workflow

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Mathew, S. A., Muola, A., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Helander, M., Puigbò, P. Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes. J. Vis. Exp. (179), e63109, doi:10.3791/63109 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image