グリホサートベースの製品がマイクロバイオームに及ぼす潜在的な影響の定量化

1. GBPsの効果を試験するための2つの野外実験 注:このプロトコルは、植物関連微生物に対するGBPの効果をテストするためのフィールド実験計画の2つの例を示しています。どちらの実験も、フィンランドのトゥルク・ルイサロ植物園(北緯60度26分、東経22度10分)の除草剤や農業利用の歴史のない畑で実施されました。土壌は有機物の割合が高い砂質粘土です。 実験1注:この実験は、雑草と戦うために成長期の前後にGBPを適用したノーティル農業の一般的な農業慣行をシミュレートするように設計されています。 実験フィールドを10の複製対照およびGBP処理プロット(23 m x 1.5 m)に分割し、プロット間に植生のバッファーストリップ(2014年春のこの研究では15)(図2)。 プロットが回転式耕運機で5cmの深さまで耕され、年に2回処理されていることを確認してください。ここでは、プロットは成長期の初め(5月)と終わり(10月)に処理されました。 対照プロットを水道水(5 L/プロット)で処理し、GBPプロットを市販のGBP(グリホサート濃度450 g·L−1、プロット当たり5Lの水道水における施用量6.4L・ha−1)を、農業慣行における最大許容グリホサート投与量(3kg・ha−1)を模倣する。 手動噴霧器を備えた手動圧力タンクで治療を適用します。GBP適用の2週間後、農業慣行に従って、オート麦(Avena sativa)、ファバ豆(Vicia faba)、カブレイプ(Brassica rapa subsp. oleifera)、および植物ジャガイモ(Solanum tuberosum)をプロットに播種する。 成長期には、対照区とGBP処理区で植物の競合と土壌構造をできるだけ類似させるために、区画を手で除草します。 実験植物から微生物叢をサンプリングする。この研究では、微生物叢は、2017年から2020年にかけて、GBP処理プロットと対照処理プロットの両方で、研究の過程で成長期に1回連続してサンプリングされました。 畑から植物サンプル(根と葉)の複製物を10個集め、すぐに氷の上に置き、セクション2.1で説明されているように、さらなる処理のために実験室に持って行きます。 実験2注:この実験は、循環型食品経済に関連するリスクをテストするために設計されました。より正確には、作物植物2 に肥料として施用された肥料中のGBP残留物の影響を調べるように設計されました(図3)。 12ヶ月の鳥小屋実験で、GBP汚染または対照飼料を与えられたウズラから、木材の削りくず、糞便、およびこぼれた飼料を含む寝具を採取する16,17。注:GBP汚染飼料は、ニワトリを産むための有機飼料と160mgのグリホサート/ kgに相当するもので構成されており、これは成体の日本のウズラの体重1kgあたり12〜20mgのグリホサート1日摂取量に相当します16,17。 検証のために、サンプルを認定ラボに送って、6バッチの飼料でグリホサート濃度を測定します。 さらに、曝露の12ヶ月後にウズラ排泄物サンプル中のグリホサート残基を測定する。対照群には、GBP添加なしの同じ有機飼料16、17を供給した。 鳥小屋の実験中は、寝具を隔週で交換してください。使用済みの寝具をGBP処理および対照から8〜12ヶ月の暴露から定期的に収集し、処理ごとにプールし、肥料として使用する前に6°Cの乾燥した暗い貯蔵室に密閉容器に保管する。 実験フィールドの6 x 6チェス盤グリッドの18 GBPと18のコントロールプロット(サイズ1 m x 1 m)のそれぞれに、2つの時点で12 Lの寝具を手動で広げます。この研究では、寝具は2018年8月と2019年5月に広がりました。 寝具サンプルは、グリホサート濃度測定が普及した直後に認定ラボに送付してください(2019年5月のこの研究では)。 各プロットに多年生草とイチゴの植物を植えて、それらの根と葉の微生物叢を研究します。注:この研究では、4つの多年生草植物(Festuca pratensis)と2つのイチゴ植物(Fragaria x vescana)を各区画に植え、それらの根と葉の微生物叢について研究した。 2. マイクロバイオーム解析(16S rRNA、 ITS および EPSPS 遺伝子) 注:マイクロバイオーム研究のほとんどは、次世代シーケンシング技術を使用して、真菌群集の細菌および内部転写スペーサー(ITS)領域の16S rRNA遺伝子の解析に基づいています。したがって、この論文にはEPSPSの種類に関する情報がありません。数千種のEPSPS配列は、パブリックリポジトリ(プロトコルセクション3)で入手可能です(図4)。 16S rRNA遺伝子 上述の実験で採取した剥離した葉根サンプルから、内生微生物(すなわち、植物組織の内部に生息する微生物)を同定する。 植物サンプルを水道水で洗浄し、それらを滅菌して着生微生物(すなわち、植物組織の表面上の微生物)を除去する。3%漂白剤を用いて3分間殺菌し、続いて70%エタノール溶液を1分間、オートクレーブ処理した超純水でそれぞれ1分間3回洗浄した。 ゲノムDNA抽出まで-80°Cでサンプルを凍結する。 メーカーのプロトコールに従って市販の植物DNA抽出キットを用いてゲノムDNA抽出を行う。 細菌DNAに特異的に結合する識別プライマーを用いたネストアプローチを用いて抽出されたDNAサンプルから16S rRNA遺伝子の可変領域V6-V8を標的とし18、宿主植物DNAからの増幅を最小化する。 ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を3回行った後、標的遺伝子にバーコード配列とアダプター配列をタグ付けし、シーケンシングのテンプレートとして準備します。PCR増幅のためのステップ2.1.7-2.1.11に従ってください 各反応の総容量が 30 μL、30 ng の DNA、1x PCR バッファー、0.2 mM dNTP、各プライマーの 0.3 μM、および 2000 U/mL DNA ポリメラーゼで構成されるように、必要なサンプル数の PCR マスターミックスを準備します。PCR の第 2 ラウンドと第 3 ラウンドで同じ手順に従います。 PCRの第1ラウンドのために、プライマー799F19 および1492R(20から改変)を使用する(表1)。サーモサイクラーに増幅プロファイルを設定します(95°Cで3分間の初期変性、続いて95°Cで45秒間の変性を35サイクル、54°Cで45秒間アニーリング、72°Cで1分間伸長)。最終伸長を72°Cで5分間行う。 第 2 ラウンドの PCR のテンプレートとして、電気泳動 (1.5% アガロースゲル上の PCR 産物の 5 μL) によって増幅を確認し、PCR 産物の残り 25 μL をオートクレーブ処理された超純水で 1:10 の比率で希釈します。 希釈したPCRテンプレートをuni-1062F21およびuni-1390R22のプライマーを用いてPCRを繰り返す(表1)。サイクル数を 25 に減らす以外は、同じ PCR 反応条件と増幅プロファイルを維持します (ステップ 2.1.8)。 得られたPCR産物をオートクレーブ処理した超純水で1:1の比率で希釈する。3 回目の PCR ラウンドを実行して、ステップ 2.1.8 で説明したのと同じ PCR プロファイルの 8 サイクルでバーコードと P1-アダプター配列で製品にタグを付けます。 ライブラリの準備 バイオアナライザーでPCR産物の濃度と品質を検証し、各サンプルの30 ngのDNAを構成する容量を1.5 mLチューブにプールして等モルライブラリーを作製します。 アガロースゲルカセット上の自動DNAサイズ選択システムを用いたサイズ分画によって、サイズ350〜550bpのアンプリコンを選択する。これはまた、ライブラリーから非特異的アンプリコンおよびPCR試薬を排除することに留意されたい。指定されたサイズのアンプリコンからなる溶出液をカセット内のバイアルに集め、精製された16S rRNA遺伝子ライブラリーを得た。 溶出液を1.5mLチューブにピペットで出し、バイオアナライザーで純度と濃度を検証した。オートクレーブ処理した超純水を用いてDNAライブラリーを終濃度26pMに希釈する;サンプルはシーケンシングの準備ができています。 その注:ITS特異的プライマー(表1)を用いてITS領域を増幅し、得られたPCR産物をバーコードおよびシーケンシング用のP1アダプター配列で標識する。 セクション 2.1 で説明したのと同じプロトコルに従って PCR マスターミックス を ITS プライマーと共に調製します。 サーモサイクラー上の増幅プロファイルを95°Cで5分間の初期変性として設定し、その後、95°Cで30秒間、55°Cで30秒間、55°Cで30秒間、72°Cで1分間、最終伸長を72°Cで7分間、35サイクルの変性、アニーリング、および伸長の35サイクルを設定します。 1.5 % アガロースゲル上の 5 μL の PCR 産物を分析し、オートクレーブ処理された超純水を使用して残りの 25 μL を 1:10 に希釈します。希釈したPCR産物を第2ラウンドのPCRのテンプレートとして使用します。 バーコードタグ付きフォワードプライマーおよびP1アダプタータグ付きリバースプライマーを使用して、必要なサンプル数のPCRマスターミックス(ステップ2.1.6を参照)を調製します。8サイクルを使用する以外は、ステップ2.3.2と同じ増幅プロファイルで増幅します。 得られたPCR産物を、セクション2.2に記載されているプロトコルに従ってシーケンシング用に準備します。 EPSPS遺伝子 微生物の EPSPS 遺伝子の配列決定と解析を行います。注:GBP曝露がコミュニティにおけるグリホサート感受性および耐性微生物の組成を変化させたかどうかを調べるためには、微生物の EPSPS 遺伝子を配列決定および解析する必要がある。したがって、アラインブル・タイトゲノム・クラスター(ATGC)データベース内の微生物分類群の幅広いコレクションから EPSPS 遺伝子の353配列が収集され、すべてのタンパク質配列がアラインメントされた22。これらのアラインメントは、ATGCデータベース23 で利用可能であり、保存された領域からプライマーを生成するために利用され得る。使いやすいバイオインフォマティクスツールは、複数の配列アライメントから保存領域を特定するように設計されており、これはPere Puigbo研究24ページで入手できます。ただし、この Web サーバーの詳細な説明を提供することは、本書の範囲外です。それにもかかわらず、グリホサートに対するマイクロバイオームの感受性を見出すために EPSPS 遺伝子の増幅のためにこれらのプライマーを利用するための前向きなプロトコールが 図4に提供される。 3. パブリックリポジトリからのEPSPSタンパク質配列の収集 大進化研究で使用されるEPSPS配列 PFAM23(タンパク質ファミリー25のデータベース)、GenBank24(遺伝子、ゲノム、タンパク質のデータベース26)、COG25(Clusters of Orthologous Groups27; 古細菌からのオルソログタンパク質のデータベース)などの公的リポジトリからEPSPSタンパク質を収集する。PDB26(Protein Data Bank28; a database of protein structure)。注:研究者らが実施した最近の研究では、これらのタンパク質が、シキミ酸経路を有する生物に対するグリホサートの潜在的な効果の微進化的および比較的分析を実行するために利用できることが示された12。著者らは、ヒト腸内微生物叢からのタンパク質の手動でキュレーションされたデータセットを含む、何万ものEPSPSタンパク質配列29に関する情報を収集するユーザーフレンドリーなウェブサイトを開発しました12。これらの事前に計算されたデータセットの情報には、推定感度およびグリホサート耐性への現在のEPSPS分類、種に関する分類学的情報、EPSPS活性部位の注釈、およびPDBおよびNCBIデータベースへのリンクが含まれる。さらに、Web サーバーには EPSPS の ID コードと複数の外部データベースへのリンクが含まれています (表 2)。 ATGCの微進化研究で使用されるEPSPS配列注:タンパク質配列の一般的なリポジトリは、比較的遠い生物間の比較研究を行うのに有用である。しかし、グリホサートの潜在的な効果は、進化的観点からは比較的最近のものである。したがって、いくつかの研究では、グリホサート14の効果を決定するために、近縁種(例えば、同じ細菌種からの異なる株)を比較する必要がある。このような場合、密接に関連した古細菌ゲノムゲノムの包括的なリストを含むAlignable Tight Genomic Clusters(ATGC)30のデータベースは、より適切なリソースです。ATGCデータベースには、数百のクラスターに編成された数千のゲノムから数百万のタンパク質の情報が含まれています30。各ゲノムクラスターは整列可能(ゲノムは長さの≥85%以上のシンテニーを共有する)であり、タイトである(飽和以下の同義置換率を有する)。研究者らは、最近の研究でATGCデータセットを使用して、EPSPSタンパク質の微進化的変化を分析した14。ATGC中のEPSPSタンパク質配列を同定するには、以下のステップが必要である: リンク31 からATGCのデータベース全体をダウンロードし、COG0128のすべてのタンパク質(データベース内のEPSPSタンパク質に対応するコード)32 をローカルプロジェクトにダウンロードします。注:研究者/実験者がフィンランドに拠点を置く場合、CSC-IT Center for Science33 はストレージとソフトウェア設備を提供します。すべてのシーケンスを FASTA 形式で収集することが重要です。 原核生物の代表的な種のセットにおけるEPSPSタンパク質のオルソログを含むCOG0128の芽球データベースを構築した。CSC にはブラスト プログラム34 がプリインストールされており、 コマンド makeblastdb -in COG0128.fa -dbtype prot を使用して EPSPS シーケンスの参照データベースを作成できます。 コマンド blastp – query [ATGC_X.fa] -db [COG0128.fa] -max_target_seqs 1 -outfmt 6 -out tmpfile -evalue 1e-150 を使用して反復ブラスト検索を使用して、ATGC データベースを COG0128.fa (EPSPS タンパク質) にマップします。 その結果、それぞれにEPSPSタンパク質配列のデータセットが作成されます。ATGCデータベースから密接に関連したEPSPSタンパク質配列の事前計算されたデータセットが利用可能である29。 4. グリホサートに対する生物の潜在的な感受性を決定するアルゴリズム(EPSPSClass Webサーバー:入力、処理、および出力) 注:研究者らは、EPSPSタンパク質配列12,35のクラスを決定するために、29で自由に利用できる使いやすいサーバーを実装しました。サーバーは、各EPSPSクラスに対する同一性パーセンテージおよびグリホサートに対するそれらの潜在的な感受性を決定するために、FASTAフォーマットのタンパク質配列の入力のみを必要とする。さらに、ユーザーはWebサーバーを利用して、独自の参照配列とアミノ酸マーカーをテストすることができます。まず、アルゴリズム(図5)は、アミノ酸位置を決定するために多重配列アラインメントプログラム35を用いてクエリ配列および参照配列をアラインメントする。次に、アミノ酸マーカーの存在を検索して、クエリ配列のEPSPSクラス(I、II、III、またはIV)を同定する。 FASTA形式のEPSPSタンパク質配列を入力テキストボックスに導入して酵素のクラスを特定し(図6A)、 送信を押します。 サーバー提供の出力からのグリホサート(図6B-E)に対するクエリ配列の潜在的な感度を評価します。出力1:クエリ配列中に存在するアミノ酸マーカーの割合(すなわち、同一性)(クラスI、II、およびIV)、およびモチーフの数(クラスIII)。出力2:マーカー残基に基づくクエリ配列と参照配列のアラインメント。出力 3: クエリと参照シーケンスの完全なペアワイズ配置。出力4:EPSPS参照配列:コレラ 菌(vcEPSPS、クラスI)、 コクシエラ・バーネティイ(cbEPSPS、クラスII)、 ブレブンジモナス・ベシキュラリス(bvEPSPS、クラスIII)、 ストレプトマイセス・ダバウェンシス(sdEPSPS、クラスIV)。 出力ページの最後に、blastp や保存ドメインなどの外部ツールへのリンクを見つけて、クエリ EPSPS シーケンスをさらに分析します (図 6F)。 5. 汎用微生物マーカー(16S rRNAおよび ITS )からのEPSPSクラスの評価 注:ほとんどのマイクロバイオーム研究は、16S rRNAおよび/またはITS36の分析に基づいています。このような場合、EPSPS配列の直接解析を行うことはできない。したがって、グリホサートに対する生物の潜在的な感受性を推定するための確率的アプローチが必要である。この分析は簡単で、マイクロバイオームプロジェクトにおけるEPSPS配列のタイプの合理的な推定値を提供します。このプロセスは、次の 3 つのステップに分かれています (図 7 と 図 8)。 パブリックリポジトリからEPSPSシーケンスを識別します。代表的な配列の包括的なデータセットのEPSPSクラスは、PFAM 37、GenBank 38、COG 39、PDB 40、ATGC 30からコンパイルされ、事前計算されています。分類情報と 50,000 を超えるシーケンスの EPSPS クラスを含む EPSPSClass サーバーのメイン ページからこれらのデータセットにアクセスします (図 7)。 生育期に実験植物の高さを隔週で測定し、畑期の終わりに植物の地上バイオマスを計量して、GBPプロットと対照プロットで植物の成長を比較します。注:野外実験による微生物叢分析は、まだ完全には分析されていません。 スプレッドシートを使用して、マイクロバイオーム実験の細菌OTU(16S rRNAまたは ITSに基づく)を事前に計算されたデータセットにマッピングします。注:以前の研究は、EPSPSクラス(すなわち、グリホサートに対する固有の感受性)が系統発生グループ内で高度に保存されていることを示している14。したがって、高度に保存された分類群からの近縁種がグリホサートに対して同様のEPSPS応答を有する可能性があると仮定することは比較的安全である(図8)。 同じスプレッドシートで、公共のデータベース内の既知のEPSPS配列から計算された確率的スコア(S = s / (s + r + u)に基づいて、グリホサートに対する固有の感受性を計算します(S:感度スコア;s:潜在的に感受性のある配列の数;r:潜在的に耐性のある配列の数;u:未分類の配列の数)。注:このスコアの範囲は、0(タクソンに感受性EPSPS配列が見つからなかった)から1(タクソン内のすべての配列がグリホサートに感受性である)です(図8)。さらに、中間の値、すなわち、感受性、耐性または未知の株を有する種が存在する。