In situ Visualisation de la croissance des axones et de la dynamique des cônes de croissance dans des cultures de tranches cérébrales embryonnaires ex vivo aiguës

L’expérimentation animale doit être conforme aux réglementations institutionnelles et fédérales pertinentes. Les femelles femelles gravides C57BL/6JRj du jour embryonnaire 15,5 et 12,5 (E15.5 et E12.5) ont été utilisées dans ce protocole. Les expériences ont été réalisées conformément à la loi sur le bien-être animal de l’Agence nationale de l’environnement de Rhénanie-du-Nord-Westphalie (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV)). 1. Préparation des plasmides pour injection Isolez l’ADN à l’aide du kit Maxiprep sans endotoxine selon le protocole du fabricant (voir tableau des matériaux). Mélanger l’ADN sélectionné à la concentration souhaitée (tableau 1) et la solution Fast Green à 10 % (voir tableau des matériaux) pour visualiser l’administration du mélange d’ADN dans les ventricules cérébraux.REMARQUE : Des plasmides spécifiques ont été utilisés pour le marquage clairsemé des neurones corticaux (Figure 1A), les structures filamenteuses de l’actine (F-actine) dans le cône de croissance (Figure 1B) et le double marquage des cônes de croissance dans le même cortex (Figure 1C). Tous les plasmides (tableau 1) utilisés dans ce protocole ont été déposés dans Addgene (voir tableau des matériaux). Préparez les capillaires en verre à l’aide d’un ensemble d’électrodes capillaires selon le programme suivant: pression: 500, chaleur: 800, traction: 30 et vitesse: 40. Chargez 15 μL de mélange ADN/Fast Green dans chaque capillaire en verre à l’aide d’embouts de pipette de micro-chargeur.REMARQUE: Assurez-vous qu’aucune bulle ne se forme. Stockez les capillaires remplis d’ADN dans un plat de 10 cm avec un morceau de pâte à modeler sur le diamètre du plat. Les capillaires peuvent être chargés et stockés à 4 °C la veille de l’expérience. Scellez l’extrémité arrière du capillaire avec un film flexible pour éviter le séchage. 2. Préparation des solutions Préparez la solution de sel tamponnée de Hank, complétée par du glucose (HBSS-G). Ajouter 0,5% de 20% de glucose dans une bouteille de 1x HBSS. Bien mélanger et conserver à 4 °C jusqu’à 2 semaines. Pour l’extraction de l’embryon, la solution HBSS-G à bulles avec du carbogène (95% O2 et 5% CO2) en utilisant de la pierre bouillonnante peu de temps avant la collecte de l’embryon. Solution de média de tranche Préparer des tranches fraîches contenant du sérum neurobasal 1x, 5 % de sérum de cheval, 5 % de sérum de veau fœtal, supplément de B27 1:50, supplément de L-glutamine 1:400, pénicilline-streptomycine 1:200 et supplément de Neuropan-2 1:100 (à pH = 7,3), dans des conditions stériles (voir tableau des matériaux). Préparez des plats de 3 cm avec 1 mL de tranches chacune. Placer dans l’incubateur à 35 °C avec 5% de CO2 pendant au moins 1 h avant l’expérience pour équilibrer le pH du milieu par échange gazeux.REMARQUE: L’équilibrage du pH des milieux est causé par l’acidification des milieux par le CO2 de l’incubateur. Les tranches peuvent être conservées à 4 °C jusqu’à 1 semaine. Solution d’agarose à faible point de fusion (3%) Peser la quantité souhaitée de poudre d’agarose à faible point de fusion et dissoudre dans un volume approprié de 1x HBSS-G dans une bouteille en verre. Environ 7 mL de solution d’agarose par cerveau sont nécessaires. Placez la bouteille dans un micro-ondes pendant 2-3 min, avec le bouchon lâchement placé, et secouez toutes les 10-20 s. Une fois la poudre complètement dissoute, placez la bouteille dans un bain-marie ou un bain de perles réglé à 37 °C au moins 1 h avant l’expérience pour permettre à l’agarose de refroidir.REMARQUE: Il est recommandé de chauffer l’agarose deux fois pendant 15 minutes pour s’assurer que la poudre d’agarose est dissoute. Ceci est crucial pour la bonne adhésion de l’agarose au tissu cérébral. Un thermomètre doit être utilisé pour mesurer la température de la solution d’agarose tout en intégrant le cerveau, en s’assurant qu’elle se situe entre 37 et 40 ° C. Les cerveaux de différents animaux âgés ont une rigidité différente. Il est recommandé de tester une gamme de concentrations d’agarose pour trouver l’homogénéité entre les tissus et l’agarose. Préparer une solution saline tamponnée au phosphate avec 0,3 % de triton X-100 (PBS-T). Préparer une solution saline tamponnée au phosphate avec de l’azoture de sodium à 0,2 % (PBS-NaN3).REMARQUE: Les solutions décrites aux étapes 2.4 à 2.5 sont destinées à être utilisées dans l’étape ultérieure d’immunohistochimie. 3. Préparation du poste de chirurgie Nettoyez la station chirurgicale avec de l’éthanol à 70% à 96% et placez la sous-couche de fonctionnement sur la surface de la station. Stériliser les instruments chirurgicaux en rinçant avec de l’éthanol à 70% à 96%, suivi d’une stérilisation sèche dans un stérilisateur à billes chaudes. Nettoyez les électrodes de la pince à épiler en platine (voir tableau des matériaux) avec de l’éthanol à 70 % à 96 % avant de les connecter au générateur d’impulsions. Insérez un capillaire en verre rempli d’ADN / Fast Green dans le support capillaire. Immédiatement avant utilisation, casser délicatement l’extrémité capillaire à l’aide de ciseaux fins et tester le débit de la solution à l’intérieur d’un tube de microcentrifugation de 1,5 mL rempli d’eau saline ou d’eau préchauffée.REMARQUE: La figure 2A, B montre la configuration de la station chirurgicale et les outils utilisés pour l’électroporation ex utero (EUE) et l’électroporation in utero (IUE). Pour l’IUE, réchauffer la solution saline à 37 °C au bain-marie. 4. Extraction d’embryons Placez la souris enceinte dans la chambre inductrice d’anesthésie avec 5% d’isoflurane jusqu’à ce que la souris soit profondément anesthésiée. Confirmer l’anesthésie par l’absence de réflexe de retrait de la pédale. Transférer la souris dans une sous-couche d’opération et maintenir l’isoflurane à 1,5% -2% à travers un cône de nez. Appliquez une pommade sur les deux yeux pour éviter le dessèchement de la cornée. Rasez l’abdomen de la souris, puis utilisez de la gaze imbibée d’éthanol à 70% à 96% pour enlever les poils rasés. Nettoyez la zone avec de la bétadine. À l’aide de petits ciseaux chirurgicaux stériles, faites une incision cutanée de 2 cm le long de la ligne médiane abdominale, suivie d’une incision musculaire de 1,5 cm.REMARQUE: La taille de l’incision dépend de la taille de l’embryon. En effet, les embryons plus gros nécessiteront une incision plus grande pour permettre leur extraction. Coupez un trou au milieu de la gaze suffisamment large pour s’adapter à l’incision cutanée (~ 2 cm de diamètre), trempez-le avec une solution saline chaude et placez-le autour de l’ouverture abdominale. Retirez les deux cornes utérines à l’aide d’un coton-tige imbibé d’une solution saline chaude ou à l’aide d’une pince, en saisissant soigneusement les espaces entre les embryons pour les retirer. Placer les embryons sur de la gaze humide (Figure 2C).REMARQUE: Même un petit dommage aux vaisseaux sanguins et aux capillaires autour des cornes utérines entraînera probablement des saignements abondants. Par conséquent, évitez la manipulation directe de ces zones vascularisées à tout moment. Ouvrir le sac utérin et retirer chaque embryon (Figure 2D). Euthanasier chaque embryon immédiatement après l’extraction via une coupe diagonale descendante, assurant une transsection complète de la moelle épinière (Figure 2E). Placez les embryons dans un plat de 10 cm contenant hbSS-G sur de la glace.REMARQUE: La décapitation de l’embryon est évitée pour éviter les fuites de mélange ADN/ Fast Green du cerveau et faciliter le positionnement facile de l’embryon dans le support (voir électroporation ex utero , étape 5). Sacrifier la mère immédiatement après l’extraction des embryons en effectuant une luxation cervicale.REMARQUE: Ici, la mère est euthanasiée sous anesthésie pour l’épargner de toute autre douleur ou souffrance post-procédure conformément au protocole approuvé par la loi sur le bien-être animal de l’Agence environnementale de Rhénanie-du-Nord-Westphalie (LANUV). 5. Électroporation ex utero (EUE) Prenez un embryon et placez-le dans le support.REMARQUE: Une pointe de pipette coupée de 1 mL attachée à l’extrémité d’un grattoir à cellules est utilisée comme support d’embryon. Il est essentiel de garder les bras des embryons à l’extérieur de la pointe pendant la procédure pour éviter qu’ils ne glissent dans la pointe (Figure 2F-I). Le diamètre de la pointe de la pipette est facilement réglable pour accueillir des embryons de différentes tailles. Coupez une deuxième pointe à la longueur où le diamètre de la pointe correspond à la taille de l’embryon et utilisez-la comme insert adaptateur au support mentionné ci-dessus. Insérez soigneusement l’ADN/ capillaire en verre rempli de fast green à travers le crâne de l’embryon dans le ventricule latéral et injectez 2 à 3 μL de mélange de plasmides d’ADN (Figure 1A, B; Tableau 1) dans chaque ventricule (figure 2F).REMARQUE: Utilisez les sutures lambdoïdales et sagittales comme guide pour l’emplacement de l’injection d’ADN. Les sutures lambdoïdales et sagittales sont des articulations fibreuses reliant la plaque osseuse du crâne. Le premier joint l’os pariétal à l’os occipital, et le second joint les deux os pariétaux. Maintenez la tête de l’embryon entre les électrodes de la pince à platine à l’angle approprié pour cibler la zone cérébrale souhaitée (angle de 60 ° dans ce cas), la cathode faisant face à la zone où le transfert d’ADN est prévu (Figure 2G-H). Appliquer cinq impulsions à 30 mV avec un intervalle de 1 s et une durée de 50 ms à l’aide d’un générateur d’impulsions à ondes carrées.REMARQUE: Gardez à l’esprit que les cerveaux de l’EUE connaissent un champ électrique plus efficace que ceux de l’IUE. Par conséquent, à une concentration d’ADN donnée, l’EUE entraîne une plus grande efficacité du transfert d’ADN que l’IUE, et les concentrations d’ADN doivent être ajustées en conséquence. Si une électroporation bilatérale est souhaitée, répétez les étapes 5.3-5.4 avec la cathode et l’anode reflétant la position précédente pour cibler le cortex controlatéral.REMARQUE: Étant donné que les deux ventricules ont été injectés avec de l’ADN, les cortex des deux hémisphères ont été ciblés. Placez l’embryon électroporé dans un plat de 6 cm contenant du HBSS-G glacé. Répétez les étapes 5.1 à 5.6 pour tous les embryons requis. 6. Électroporation in utero (IUE) Injecter à la souris enceinte un analgésique; 50 μL de buprénorphine (0,1 mg/kg) (voir tableau des matériaux) par voie sous-cutanée, 20 min avant l’intervention. Effectuez les étapes 4.1 à 4.8 de la section d’extraction d’embryons.REMARQUE: Évitez de laisser les embryons exposés inutilement en les recouvrant de gaze stérile imbibée de solution saline chaude. Du bout des doigts, faire pivoter doucement l’embryon à l’intérieur de l’utérus jusqu’à ce que les sutures lambdoïdales et sagittales soient localisées (Figure 2J). Insérez soigneusement l’ADN/capillaire en verre Fast Green à travers la paroi utérine et le crâne de l’embryon dans le ventricule latéral et injectez 2 à 3 μL de mélange de plasmides d’ADN (Figure 1A,C) dans l’un ou les deux ventricules comme vous le souhaitez (Figure 2K-L).REMARQUE: Une pression excessive des doigts sur les cornes utérines pourrait entraîner un effondrement amniotique du sac. Maintenez la tête de l’embryon entre les électrodes de la pince à platine à l’angle approprié pour cibler la zone cérébrale souhaitée (angle de 60 ° dans ce cas), la cathode faisant face à la zone où le transfert d’ADN est prévu. Évitez de presser l’utérus car cela pourrait provoquer l’effondrement du sac amniotique (Figure 2M). Appliquer cinq impulsions à 35 mV avec un intervalle de 600 ms et une durée de 50 ms à l’aide d’un générateur d’impulsions à ondes carrées. Si les deux ventricules latéraux ont été injectés, répétez les étapes 6.5-6.6 avec la cathode et l’anode reflétant la position précédente pour cibler le cortex controlatéral. Répétez les étapes 6.3 à 6.6 pour tous les embryons requis. Une fois que tous les embryons requis ont été électroporés, utilisez un coton-tige imbibé de solution saline pour replacer doucement les cornes utérines à l’intérieur de la cavité abdominale.REMARQUE: L’ajout d’une solution saline dans la cavité péritonéale aidera les cornes utérines à se remettre en position. Suture des incisions musculaires et cutanées à l’aide d’un matériau de suture 5-0. Utilisez des clips de suture pour fixer la plaie et désinfectez la plaie de suture en la pulvérisant avec de la bétadine (Figure 2N-P). Injecter à la souris 200 μL de glucose à 5% par voie sous-cutanée. Injecter un antibiotique à la souris; 50 μL d’enrofloxacine (5 mg/kg) par voie sous-cutanée (voir tableau des matériaux). Replacez la souris dans la cage de récupération et maintenez la chaleur à l’aide d’une lumière chauffante infrarouge lointaine ou d’un coussin chauffant pendant au moins 20 minutes après la procédure (Figure 2Q). Surveillez la souris quotidiennement et injectez du méloxicam après la procédure pour soulager la douleur en suivant les directives institutionnelles et fédérales. Extrayez les embryons 2 jours après la procédure (c.-à-d. E17.5) après l’étape 4. 7. Extraction cérébrale et incorporation dans l’agarose REMARQUE: Il est recommandé d’effectuer les étapes suivantes sous un microscope à dissection pour une meilleure précision. Éviter les dommages au cerveau est essentiel pour le succès de la procédure. Installez les outils d’extraction dans un espace de travail stérile sous une hotte de dissection (Figure 3A). Séparez la tête d’un embryon du reste du corps à l’aide de ciseaux à dissection. Fixez la tête comme illustré à la figure 3C, puis retirez la peau et le crâne en coupant le long de la ligne médiane, en partant de la base de la tête vers le nez (figure 3D). Pelez la peau et le crâne latéralement, en faisant un espace assez grand (~ 1 cm) pour que le cerveau soit excisé. Pour retirer le cerveau, insérez la pointe fermée des ciseaux de dissection stériles, en partant de sous le bulbe olfactif se déplaçant vers le tronc cérébral (Figure 3E). Coupez le tronc cérébral et coupez tous les morceaux lâches de méninges autour du cerveau (Figure 3F).REMARQUE: Les méninges lâches font souvent que les tranches restent attachées au bloc d’agarose après la coupe, ce qui entraîne le détachement des tissus de l’agarose lors de la collecte des tranches. Répétez les étapes 7.1 à 7.6 pour tous les embryons et gardez le cerveau sur la glace (idéalement pas plus de 30 minutes) jusqu’à l’étape d’intégration.REMARQUE: Les étapes suivantes 7.7.1-7.7.4 se réfèrent à l’extraction cérébrale des cerveaux E12.5. Isolez le haut de la tête juste en dessous de l’œil, comme le montre la figure 3G. Coupez la peau et le crâne sur le dessus du tronc cérébral, en suivant la ligne pointillée comme le montre la figure 3H, sans retirer le tronc cérébral. Faites une incision peau-crâne de 2 mm à l’arrière de la tête, comme le montre la figure 3I (voir les dessins pour plus de clarté).REMARQUE: Cette incision fournit des points de préhension initiaux pour décoller les couches de peau et de crâne. En règle générale, ils se détachent comme une seule couche. La taille typique de l’incision est de 2 mm, correspondant à la longueur du bord de coupe des ciseaux à micro-ressort utilisés. Commencez à décoller les couches de la peau et du crâne en fixant un côté de l’incision et en tirant l’autre avec précaution. Avec le même soin, finaliser en décollant la base de la tête jusqu’à libérer le cerveau (Figure 3J).REMARQUE: Cela doit être fait avec beaucoup de soin, en observant que le cerveau n’est pas tiré le long des couches tissulaires. Alternez les côtés pour enlever le tissu recouvrant le cerveau. Verser l’agarose tiède (à 37-40 °C) dans un plat de 3 cm. Ramassez le cerveau à l’aide d’une cuillère perforée et éliminez l’excès de liquide en tamponnant le fond de la cuillère contre du papier de soie sec. Placez le cerveau dans un plat d’agarose.REMARQUE: Il est essentiel d’éliminer autant de liquide que possible autour du cerveau pour permettre une meilleure adhésion de l’agarose aux tissus. Mettez le plat avec de l’agarose liquide sur de la glace. À l’aide d’une cuillère plus petite, mélanger l’agarose pendant 10 s pour un refroidissement uniforme. Manœuvrez le cerveau au milieu du plat. Placez le cerveau horizontalement dans le plat avec la face dorsale vers le haut, en vous assurant qu’il est complètement recouvert d’agarose de toutes les directions (Figure 3K).REMARQUE: Les cerveaux coulent souvent au fond du plat une fois placés dans l’agarose; soulevez le cerveau à l’aide d’une petite cuillère jusqu’à ce qu’un espace de 1 à 2 mm sous le cerveau soit établi. Répétez les étapes 7.8 à 7.10 pour tous les cerveaux. Une fois l’agarose polymérisée, ajoutez 500 μL de HBSS-G sur le bloc d’agarose pour éviter le dessèchement. Ensuite, couvrez le plat de glace.REMARQUE: Gardez l’échantillon sur la glace pendant 5 minutes avant le sectionnement pour permettre à la température du cerveau d’atteindre 4 ° C. 8. Culture organotypique en tranches REMARQUE: Nettoyez le vibratome et les surfaces environnantes avec de l’éthanol à 70% à 96% pour éviter la contamination des tranches. La configuration du poste de travail vibratome (voir Tableau des matériaux) est illustrée à la figure 3B. Remplissez le plateau tampon vibratome avec du HBSS-G froid et le plateau extérieur avec de la glace pour maintenir le HBSS-G froid tout au long de la procédure. Alimentez en continu HBSS-G dans le bac tampon avec du carbogène à l’aide d’une pierre bouillonnante. À l’aide d’une lame fraîche, faites une grande coupe (~ 2 x 2 cm) autour du cerveau et retirez un bloc d’agarose contenant le cerveau, avec suffisamment d’agarose environnante pour couper l’agarose en un petit bloc rectangulaire.REMARQUE: Cette étape permet d’ajuster l’angle du bloc de sorte que l’axe sagittal du cerveau soit perpendiculaire à la plaque vibratomique et que l’axe coronal s’aligne parallèlement à la lame. Laissez environ 5 mm d’agarose sur la face dorsale du cerveau pour une manipulation facile des tranches. Placez une petite goutte de supercolle sans solvant à adhésif rapide au milieu du porte-échantillon et étalez-la dans une zone qui couvrira le fond du bloc d’agarose. Ramassez doucement le bloc d’agarose et séchez le fond en tamponnant contre du papier de soie. Placez le bloc sur la zone collée du porte-spécimen, avec le côté rostral du cerveau vers le haut. Mettez le porte-spécimen sur de la glace et laissez la colle sécher pendant 1 min. Une fois la colle séchée, placez le porte-échantillon dans le bac tampon. Coupez le cerveau en tranches coronales à un angle de 15°.REMARQUE: L’épaisseur des tranches peut varier en fonction de l’application. Ici, les cerveaux ont été tranchés à une épaisseur de 150 μm. Réglez la vitesse du vibratome à 1,0-1,5 mm / s pour couper l’excès d’agarose sur le dessus et couper les bulbes olfactifs. Réduisez la vitesse de coupe à 0,5 mm/s pour la collecte des tranches corticales à des fins d’analyse. La plupart des vibratomes peuvent être mis en pause pour recueillir chaque tranche. Si la qualité réduite des tranches ou le détachement des tissus de l’agarose sont ressentis, la réduction de la vitesse de coupe ou le remplacement de la lame du vibratome peut aider. À l’aide de spatules propres, collectez des tranches de cerveau et placez-les sur une membrane de polytétrafluoroéthylène (PTFE), immobilisée dans un plat à fond de verre de 35 mm à l’aide de paraffine (jusqu’à cinq tranches de cerveau / membrane) (Figure 3L-M).REMARQUE: Fixez la membrane en PTFE à l’intérieur d’un plat à fond de verre de 35 mm à l’aide de cire. Cela stabilisera la membrane lors de l’ajout du milieu de culture en tranches et également pendant l’imagerie. À l’aide d’une pipette de 200 μL, retirer l’excès de HBSS-G autour des tranches de la membrane en PTFE, en laissant les tranches semi-sèches. Ajouter 500 μL de milieu de tranche (préchauffé à 35 °C) directement dans l’espace sous la membrane en PTFE.REMARQUE: Aucune bulle ne doit se former sous la membrane lors de l’ajout du média. Cela laissera des tranches entières ou partielles sans échange de médias. Remplacez 200 μL de média tous les 2 jours en culture ou après chaque séance d’imagerie. Incuber les tranches à 35 °C avec 5 % de CO2. 9. Immunohistochimie Fixer les tranches avec 1 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % complété par 4 % de saccharose par plat. Incuber à RT pendant 30 min.ATTENTION : Lorsque vous manipulez du PFA, portez un manteau de laboratoire et des gants. Effectuez des étapes de fixation sous une hotte chimique et éliminez les déchets PFA de manière appropriée. Lavez les tranches deux fois avec 300 μL de PBS pendant 5 min. Transférer les tranches dans une assiette de 24 puits.REMARQUE: L’expérience peut être suspendue à ce stade. Ajouter PBS-NaN3 aux tranches et conserver à 4 °C. NaN3 est un composé toxique; lorsque vous manipulez des solutions avec elle, portez un manteau de laboratoire et des gants. Les étapes 9.3 à 9.10 doivent être effectuées dans un agitateur orbital. Tremper les tranches avec 300 μL de glycine 0,1 M à 4 °C pendant la nuit. Laver la glycine avec PBS à RT 3x pendant 10 min. Perméabiliser les tranches avec 300 μL de PBS-T à RT pendant 2 h. Bloquer en utilisant 10% de sérum de chèvre dans PBS-T à RT pendant 2 h. Ajouter 300 μL d’anticorps primaire (anticorps anti-vimentine à une dilution de 1:200; voir tableau des matières) dilué dans du sérum de chèvre à 10 % dans une solution de PBS-T à 4 °C pendant la nuit.REMARQUE: Aux étapes 9.8 à 9.12, les tranches étaient protégées contre la lumière pour éviter la perte de fluorescence. Laver l’anticorps primaire avec PBS à RT 3x pendant 20 min.REMARQUE: PBS a été utilisé à la place de PBS-T pour laver Triton X-100. Ajouter 300 μL d’anticorps secondaire (Alexa Fluor 488 ou 647 à une dilution de 1:400; voir tableau des matériaux) dans PBS à RT pendant 2 h.REMARQUE: DAPI est ajouté immédiatement après avoir retiré l’anticorps secondaire à une dilution de 1:10 000 pendant 5 min. Laver l’anticorps secondaire avec PBS à RT 3x pendant 20 min. Laver à l’eau distillée 2x pendant 1 min. Transférer les tranches sur une lame de verre à l’aide d’une brosse fine, puis sécher à 30 °C pendant 20 min. Montez les tranches à l’aide d’un support de montage aqueux. Gardez les diapositives à RT pendant la nuit pour que les supports de montage puissent être conservés. 10. Acquisition d’imagerie REMARQUE: Quelle que soit l’approche d’administration de l’ADN (IUE ou EUE), les tranches ont été analysées dans la même tranche d’âge de développement (E17.5-E18.5). L’IUE permet aux progéniteurs neuronaux de se diviser et de se développer pendant deux jours supplémentaires in vivo. L’EUE, d’autre part, permet de suivre les événements de développement précoces. Allumez l’incubateur à chambre et réglez-le à 35 °C avec 5 % de CO2 – idéalement 4 h avant l’imagerie – pour permettre aux composants du microscope de s’équilibrer à 35 °C. Pour l’imagerie profonde des tranches, utilisez des objectifs d’immersion dans l’eau pour réduire l’inadéquation de l’indice de réfraction entre le tissu et l’objectif.REMARQUE: Ici, le mode d’imagerie super-résolution a été utilisé. L’imagerie à travers la membrane PTFE nécessite un objectif avec une longue distance de travail (~ 1 mm). Si un objectif à longue distance de travail n’est pas disponible, les tranches peuvent être transférées dans un plat à fond de verre à 8 puits. Pour transférer les tranches, ajoutez 1 mL de milieu de tranche au sommet de la membrane, puis utilisez une spatule pour soulever une tranche et transférez-la dans un puits contenant 200 μL de milieu. Enlever l’excès de média à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL en laissant les tranches semi-sèches. Pour l’imagerie de la croissance des axones, localisez une région du cortex avec une densité cellulaire faible à moyenne. Pour l’imagerie de la dynamique du cône de croissance, localisez un cône de croissance dans la zone intermédiaire ou la zone sous-ventriculaire du cortex. Définissez une taille de pile z dans le logiciel de traitement d’image (voir Tableau des matériaux). Pour la croissance des axones dans une grande pile z, définissez une taille d’étape de 2 μm. Pour les cônes de croissance dans une pile z plus petite, définissez une taille de pas de 1 μm.REMARQUE: Tenez toujours compte du mouvement potentiel du cône de croissance et de l’axone à travers les plans x, y et z. Les axones se développent à un rythme beaucoup plus élevé dans les cultures organotypiques que dans les cultures in vitro . Ici, une pile z d’environ 80 μm pour imager la croissance des axones était suffisante. Pour la dynamique des cônes de croissance, une pile z d’environ 6 μm était adéquate. Pour l’imagerie de la croissance axonale des neurones dans une plus grande zone, définissez un balayage de tuiles. Utilisez la puissance laser la plus faible possible pour minimiser les risques de blanchiment des cônes de croissance lors de l’acquisition. Pour l’imagerie de la croissance des axones, acquérir des time-lapses pendant 2 h avec un intervalle de 5 min. Pour l’imagerie de la dynamique des cônes de croissance, acquérez des time-lapses pendant 2-5 min avec un intervalle de 2,5-3 s. 11. Analyse des données Mesurer la vitesse de croissance des axones à l’aide de kymographes Ouvrez le fichier image dans Fiji14 à l’> Ouvrir et sélectionnez l’image. Obtenez la projection d’intensité maximale du time-lapse via image > Stacks > Z-Projection > Maximum Intensity Projection. Passez par le time-lapse et localisez un axone en croissance. Une fois localisé, tracez une ligne à travers l’axone en croissance. Commencez à partir de la pointe de l’axone dans la première image et suivez l’axone tout au long du time-lapse. Générez un kymographe à l’aide du plugin KymoResliceWide. Définissez l’échelle du kymographe en accédant à Propriétés de l’image >. Définissez la distance en μm en Largeur de pixel et réglez l’heure en s ou min en Hauteur de pixel. Accédez à Analyser > mesure.REMARQUE: Un angle par rapport à l’axe des x sera donné. Calculez la vitesse de croissance des axones en substituant l’angle dans l’équation suivante : SIN(RADIANS(θ))/COS(RADIANS(θ)) dans une feuille de calcul. Mesurez le volume du cône de croissance à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images (voir Tableau des matériaux). Ouvrez le fichier image dans le logiciel d’analyse d’images via Fichier > Ouvrir et sélectionnez le fichier d’intérêt. Sélectionnez l’Assistant Ajout de nouvelles surfaces .REMARQUE: Une section dans le coin inférieur gauche apparaîtra avec six étapes pour l’édition manuelle. À l’étape 1, sous Paramètres de l’algorithme, sélectionnez Segmenter uniquement une région d’intérêt. À l’étape 2, recadrez le cadre pour l’adapter à l’ensemble du cône de croissance dans tous les cadres. Maintenez le seuil à l’intensité absolue à l’étape 3 et assurez-vous que toute la région du cône de croissance est seuillée à l’étape 4. À l’étape 5, sélectionnez Nombre de voxels lmg = 1 sous Type de filtre.REMARQUE : Dans la dernière étape, plusieurs ensembles de mesures peuvent être créés. Ici, une seule mesure a été créée pour le volume. Sélectionnez le bouton Exécuter pour effectuer toutes les étapes de création et terminer l’Assistant Ajout de nouvelles surfaces. Dans l’onglet Statistiques en haut de la fenêtre de l’Assistant, sélectionnez Valeurs spécifiques et volume sous l’onglet Détaillé .