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Biochemistry

Immunopeptidomique : isolement de peptides associés à la souris et au CMH humain de classe I et II pour l’analyse par spectrométrie de masse

Published: October 15, 2021
doi:
10.3791/63052
, , , ,
1CHU Sainte-Justine Research Center, 2Department of Pathology and Cellular Biology, Faculty of Medicine,Université de Montréal

Summary

Nous présentons ici un protocole pour la purification des complexes peptidiques de classe I et de classe II du CMH à partir de lignées cellulaires de souris et d’humains fournissant des données immunopeptidomiques de haute qualité. Le protocole se concentre sur la préparation d’échantillons à l’aide d’anticorps disponibles dans le commerce.

Abstract

L’immunopeptidomique est un domaine émergent qui alimente et guide le développement de vaccins et d’immunothérapies. Plus précisément, il fait référence à la science de l’étude de la composition des peptides présentés par les molécules de classe I et de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) à l’aide de plateformes technologiques de spectrométrie de masse (SEP). Parmi toutes les étapes d’un flux de travail immunopeptidomique basé sur la SEP, la préparation des échantillons est d’une importance cruciale pour la capture de données de haute qualité présentant un intérêt thérapeutique. Ici, des instructions étape par étape sont décrites pour isoler les peptides associés aux classes I et II du CMH par purification de l’immunoaffinité à partir d’échantillons de contrôle de la qualité, de lignées cellulaires de souris (EL4 et A20) et humaines (JY) plus spécifiquement. Les différents réactifs et anticorps spécifiques sont décrits en détail pour isoler les peptides associés au CMH de ces lignées cellulaires, y compris les étapes pour vérifier l’efficacité de liaison aux billes de l’anticorps et l’efficacité d’élution des complexes MHC-peptide des perles. Le protocole peut être utilisé pour établir et normaliser un flux de travail immunopeptidomique, ainsi que pour comparer de nouveaux protocoles. De plus, le protocole représente un excellent point de départ pour tous les non-experts en plus de favoriser la reproductibilité intra- et inter-laboratoire de la procédure de préparation d’échantillons en immunopeptidomique.

Introduction

Au cours de la dernière décennie, l’intérêt pour l’étude du répertoire des peptides associés au CMH a dépassé le secteur universitaire et a atteint les industries biotechnologiques et pharmaceutiques. En effet, dans le cancer, la découverte de néoantigènes spécifiques à la tumeur exploitables représente un axe de recherche majeur dans le secteur industriel pour développer des immunothérapies cliniques conduisant à une oncologie personnalisée1,2,3. Fondamentalement, les peptides associés au CMH sont présentés dans tout le corps, reflètent le stade intracellulaire de la cellule et sont importants dans diverses maladies telles que l’auto-immunité, la transplantation, les maladies infectieuses, l’inflammation, le cancer et les allergies1,4. Ainsi, les peptides associés au CMH, ou ligands de l’antigène leucocytaire humain (HLA) chez l’homme, sont d’un grand intérêt médical et sont collectivement appelés immunopeptidome5.

La SEP est une approche analytique puissante pour caractériser l’immunopeptidome6,7, y compris la découverte de néoantigènes spécifiques à la tumeur8,9,10,11. Un flux de travail typique pour effectuer une expérience immunopeptidomique comprend trois étapes principales: 1) la préparation des échantillons pour l’isolement des peptides associés au CMH, 2) l’acquisition de données par la SEP et 3) l’analyse des données à l’aide de divers outils logiciels de calcul12. La génération d’échantillons de haute qualité décrits dans ce protocole visualisé est essentielle à la réussite de tout projet d’immunopeptidomie basé sur la SEP. Le protocole décrit ci-dessous se concentre sur l’isolement des peptides associés aux classes I et II du CMH à partir de lignées cellulaires bien établies qui conviennent à la génération de données immunopeptidomiques de haute qualité. Les résultats représentatifs de ces lignées cellulaires sont présentés dans le protocole actuel.

Protocol

Le protocole fourni ici a été adapté des protocoles établis13,14,15,16,17,18,19,20. La procédure globale de purification de l’immunoaffinité (IP) des peptides de classe I et II du CMH est illustrée à la figure 1. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur les lignées cellulaires et les anticorps utilisés. 1. Perles couplées aux anticorps (Jour 1) : Couplage d’anticorps aux perles activées par le CNBr de sépharose REMARQUE: Préparez de nouvelles solutions pour chaque nouvelle expérience. Reportez-vous au tableau des matériaux et au tableau supplémentaire 1 pour obtenir la liste des recettes de réactifs et de solutions. Toutes les étapes sont effectuées à température ambiante (RT). Lorsque vous utilisez un nouvel anticorps, vérifiez l’efficacité de liaison en collectant les aliquotes clés (voir l’indication FACULTATIF) et en effectuant une coloration bleue de Coomassie SDS-PAGE (Figure 2). Activation des billes de sépharose CNBr Peser 80 mg de billes activées par Sépharose CNBr par échantillon et les transférer dans un tube conique de 15 mL. Pour faciliter la remise en suspension des billes séchées, ajoutez d’abord 5 mL de 1 mM de HCl et pipetez 5 fois. Ensuite, remplissez le tube conique avec 8,5 mL supplémentaires de 1 mM HCl. Rotation à 20 tr/min (tours par minute) pendant 30 min à RT à l’aide d’un rotateur. Centrifuger les billes à 200 x g pendant 2 min à RT et retirer le surnageant par aspiration. Ajouter 500 μL de tampon de couplage à la pastille de billes et transférer dans un nouveau tube de centrifugeuse de 2,0 mL et garder de côté pour l’étape 1.2.2. Couplage d’anticorps à des billes activées par CNBr Préparer l’anticorps sélectionné pour l’isolement des peptides de classe I ou II du CMH dans un nouveau tube de microcentrifugation de 2,0 mL en ajoutant 2 mg de l’anticorps (selon la concentration spécifiée par le fabricant). Compléter le volume à 1 mL avec la solution tampon de couplage pour obtenir une concentration finale de 2 mg/mL. Centrifuger les billes de l’étape 1.1.4 à 200 x g pendant 2 min à RT puis retirer le surnageant par aspiration. Ajouter la solution d’anticorps dans le tube de microcentrifugation de 2,0 mL contenant les billes activées. (FACULTATIF) Prenez une aliquote de 18 μL (INPUT), ajoutez 6 μL de tampon SDS-PAGE 4x et congelez immédiatement. Faites pivoter le tube de microcentrifugation de l’étape 1.2.3 à 20 tr/min pendant 120 minutes à l’aide d’un rotateur. Centrifuger les billes à 200 x g pendant 2 min, puis retirer le surnageant. (FACULTATIF) Prendre une aliquote de 18 μL du surnageant (anticorps non liés), ajouter 6 μL de tampon 4x SDS-PAGE et congeler immédiatement. Blocage et lavage des billes couplées aux anticorps Ajouter 1 mL de glycine 0,2 M au tube de microcentrifugation contenant les billes couplées aux anticorps de l’étape 1.2.5. Faites pivoter à 20 tr/min pendant 60 min à TA à l’aide d’un rotateur. Centrifugez les billes à 200 x g pendant 2 min, puis retirez le surnageant. Ajouter 1 mL de PBS (solution saline tamponnée au phosphate). Centrifugez les billes à 200 x g pendant 2 min, puis retirez le surnageant. (FACULTATIF) Prendre une aliquote de 18 μL du surnageant (anticorps non liés, dernier lavage), ajouter 6 μL de tampon 4x SDS-PAGE et congeler immédiatement. Ajouter 1 mL de PBS aux billes à l’étape 1.3.3. (FACULTATIF) Prendre une aliquote de 18 μL de mélange de billes (billes couplées à des anticorps), ajouter 6 μL de tampon 4x SDS-PAGE et congeler immédiatement. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation le jour même à l’étape 2.5.REMARQUE: Les perles peuvent être préparées la veille de l’immunocapture, mais un stockage plus long n’a pas été testé. 2. Lyse cellulaire et immunocapture avec des billes couplées à des anticorps (Jour 1) REMARQUE : Le niveau de molécules de CMH varie d’un type de cellule à l’autre, et la quantification des molécules de CMH/HLA par cellule est suggérée21 (figure 4A). Nous recommandons un minimum de 1 x 108 cellules pour chaque ip. Ce nombre de cellules correspond à 6-10 mg de protéines provenant de cellules JY, EL4 et A20 solubilisées avec un tampon Chaps à 0,5%. Pour préparer les granulés de cellules pour les IP, les cellules doivent être récoltées, centrifugées et lavées deux fois avec 5 mL de PBS. Ensuite, les pastilles cellulaires peuvent être stockées dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL ou un tube conique de 15 mL à -80 °C jusqu’au moment de l’IP. Notez que les IP peuvent être effectuées sur des granulés de cellules fraîchement récoltés ou congelés. Pour isoler les peptides de classe I ou II du CMH, décongeler une pastille congelée de 1 x 108 cellules en réchauffant le fond du tube avec la paume. Ajouter 500 μL de PBS à la pastille et pipeter de haut en bas jusqu’à ce que la suspension soit homogène.REMARQUE: Selon le type de cellule, le volume de granulés de cellule peut varier considérablement. Si 500 μL de PBS ne suffisent pas à dissoudre la pastille cellulaire, utilisez plus de PBS jusqu’à ce que les cellules se désagrègent facilement tout en pipetant de haut en bas. Mesurer le volume total de la pastille remise en suspension dans le PBS et la transférer dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 2 mL. Divisez en plus de tubes si nécessaire. Ajouter un volume de tampon de lyse cellulaire (1 % de tampon chaps dans pbS contenant des inhibiteurs de protéase, 1 pastille/10 mL de tampon) équivalent au volume de granulés cellulaires remis en suspension dans PBS mesuré à l’étape précédente. La concentration finale du tampon de lyse est de 0,5 % chaps. Rotation à 10 tr/min pendant 60 min à 4 °C à l’aide d’un rotateur. Centrifuger le lysat de la cellule à 18 000 x g pendant 20 min à 4 °C avec un frein complet et transférer le surnageant (contenant les complexes MHC-peptides) dans un nouveau tube de microcentrifugation de 2,0 mL. Récupérer les billes couplées aux anticorps de l’étape 1.3.7 par centrifugation à 200 x g pendant 2 min et retirer le surnageant. Transférer le surnageant de lysat cellulaire à l’étape 2.4 dans les billes couplées aux anticorps et incuber avec rotation (10 tr/min) pendant 14-18 h (pendant la nuit) à 4 °C à l’aide d’un rotateur. 3. Élution des peptides du CMH (Jour 2) REMARQUE: La colonne de polypropylène permet l’élution des complexes MHC-peptide tout en retenant les perles dans la colonne. Afin d’évaluer la proportion de complexes MHC-peptides liés aux billes avant et après l’élution acide avec 1% de TFA (acide trifluoroacétique), il est possible d’effectuer un transfert western avec des aliquotes prises à des étapes clés du protocole (voir l’indication FACULTATIVE). Le transfert Western illustré à la figure 3 révèle l’enrichissement des complexes MHC-peptide après une élution acide avec 1% de TFA. L’absence de signal dans cette fraction indiquerait que l’étape d’élution n’a pas réussi. Notez que la proportion de complexes MHC-peptides non liés aux billes peut également être évaluée en parallèle par transfert western à l’aide d’une aliquote décrite à l’étape 3.1.6. Élution des complexes MHC-peptide à partir des billes couplées d’anticorps Retirez le couvercle inférieur de la colonne en polypropylène, placez la colonne sur le rack de colonne en polypropylène et installez un récipient vide en dessous pour recueillir le flux.REMARQUE : Une colonne par échantillon est requise. Rincez la colonne de polypropylène avec 10 mL de tampon A et laissez-la s’écouler par gravité. Si la vitesse d’écoulement de l’élution liquide est trop lente, coupez davantage l’extrémité inférieure de la colonne en polypropylène. Mesurer et recueillir le mélange perles-lysat (~2 mL) à partir de l’étape 2.5 et le transférer dans la colonne de polypropylène. (FACULTATIF) Prendre une aliquote de 20 μL (ou 1/100 du volume total) pour le transfert western et congeler immédiatement. Cette fraction correspond aux complexes MHC-peptides totaux incubés avec les billes. Laissez le mélange liquide éluter par gravité. (FACULTATIF) Collectez et mesurez le débit et prenez une aliquote de 20 μL (ou 1/100 du volume total) pour le transfert western et congelez immédiatement. Cette fraction représente les complexes résiduels non liés MHC-peptides. Pour récupérer autant que possible le mélange perles-lysat, rincez le tube de l’étape 3.1.3 avec 1 mL de tampon A et transférez-le dans la colonne de polypropylène. Lavez les billes retenues dans la colonne de polypropylène en ajoutant 10 mL de tampon A. Laissez le tampon de lavage éluer par gravité. Répétez l’étape de lavage avec 10 mL de tampon B, 10 mL de tampon A puis 10 mL de tampon C. Retirez la colonne de polypropylène du rack et placez-la sur le dessus d’un nouveau tube de microcentrifugation de 2,0 mL. Tenez la colonne et le tube ensemble avec la main. Ajouter 300 μL de 1% de TFA à la colonne de polypropylène et mélanger les billes en pipetant de haut en bas 5 fois.REMARQUE: Les billes seront retenues dans la colonne de polypropylène et les peptides liés au CMH élueront dans le tube de microcentrifugation de 2,0 mL. Transférer l’éluat dans un nouveau tube de microcentrifugation de 2,0 mL. Répétez l’étape 3.1.11 et mettez en commun les 2 éluats (les éluats contenant les complexes CMH-peptide doivent correspondre à un total de 600 μL et seront utilisés à l’étape 3.2.4). (FACULTATIF) Recueillir une aliquote de 6 μL (ou 1/100 du volume total) pour le transfert western et congeler immédiatement. Cette fraction correspond aux complexes MHC-peptides élués des billes. Dessalage et élution des peptides du CMHREMARQUE: Les étapes de dessalement et d’élution des peptides MHC peuvent être effectuées en installant la colonne C18 sur un tube de microcentrifugation de 2,0 mL. Pour un meilleur ajustement, installez les recuits fournis par le fabricant entre la colonne C18 et le tube de microcentrifugation de 2,0 mL. Dans ce protocole, une colonne C18 est utilisée avec une capacité volumique de 5-200 μL (6-60 μg). Toutes les étapes sont effectuées chez RT. Ajouter 200 μL de méthanol sur le dessus de la colonne C18, puis centrifuger à 1546 x g pendant 3 min. Jetez le flux. Ajouter 200 μL de 80% ACN (acétonitrile)/0,1%TFA sur le dessus de la colonne C18, puis centrifuger à 1546 x g pendant 3 min. Jetez le flux. Ajouter 200 μL de 0,1% TFA sur le dessus de la colonne C18, puis centrifuger à 1546 x g pendant 3 min. Jetez le flux. Chargez 200 μL des complexes MHC-peptide à partir de l’étape 3.1.12 au-dessus de la colonne C18. Centrifuger à 1546 x g pendant 3 min et jeter le flux à travers. Répétez l’étape 3.2.4 deux fois jusqu’à ce que le volume complet ait été chargé. Notez que les peptides MHC sont retenus dans la colonne C18. Ajouter 200 μL de 0,1% TFA à la colonne C18, puis centrifuger à 1546 x g pendant 3 min. Jetez le flux. Transférer la colonne C18 dans un nouveau tube de microcentrifugation de 2,0 mL. Éluez les peptides MHC de la colonne C18 en ajoutant 150 μL de 28 % D’ACN/0,1 % de TFA. Centrifuger à 1546 x g pendant 3 min. Transférez l’écoulement dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Veillez à ne pas jeter le flux; il contient les peptides isolés du CMH de classe I ou II. Répétez les étapes 3.2.7 à 3.2.9 deux fois pour un volume total de 450 μL. Congeler les 450 μL d’éluat (peptides purifiés du CMH de classe I ou II) à -20 °C jusqu’à ce que les échantillons soient analysés par le LC-MSMS. Avant l’analyse LC-MS/MS, les peptides purifiés du CMH de classe I ou II de l’étape 3.2.11 sont évaporés à sec à l’aide d’un concentrateur à vide avec des préréglages de 45 °C pendant 2 h, niveau de vide : 100 mTorr et rampe de vide : 5.REMARQUE: L’évaporation des échantillons congelés est très efficace. Les peptides séchés peuvent être recongelés jusqu’à l’analyse. 4. Identification des peptides MHC de classe I et II par LC-MS/MS REMARQUE : Analyser l’immunopeptidôme de classe I et II du CMH à l’aide d’un Orbitrap haute performance et de spectromètres de masse à temps de vol quadripolaire haute résolution6. Les informations suivantes ne sont données qu’à titre indicatif, en tenant compte du fait que les différents instruments de spectrométrie de masse en tandem existants fonctionnent selon différentes normes opérationnelles. Un bref aperçu des étapes est discuté ci-dessous : Solubiliser les échantillons séchés (à partir de l’étape 3.2.12) dans 50 μL d’acide formique (AF) à 4 %. Chargez trois injections de 16 μL pour chaque échantillon et séparez-les sur une colonne de phase inversée faite maison (150-μm i.d. par 250 mm de longueur, Jupiter 3 μm C18 300 Å) avec un gradient de 5% à 30% ACN-0,1% FA et un débit de 600 nL / min sur un UHPLC à nano-flux connecté à un MS. Acquérir chaque spectre MS complet à une résolution de 120000, un AGC de 4 x 105 avec mode automatique pour le temps d’injection et les spectres en utilisant tandem-MS (MS-MS) sur les ions précurseurs chargés multipliés les plus abondants pendant un maximum de 3 s.REMARQUE: Les expériences Tandem-MS sont réalisées en utilisant la dissociation collisionnelle à plus haute énergie (HCD) à une énergie de collision de 30%, une résolution de 30 000, un AGC de 1,5 x 105 et un temps d’injection de 300 ms. Traiter les fichiers de données des trois injections/échantillons à l’aide d’un logiciel d’analyse protéomique LC-MS/MS (par exemple, PEAKS X) à l’aide de la souris et des bases de données humaines (UniProtKB/Swiss-Prot (2019_09)). Sélectionnez « Digestion enzymatique non spécifiée » pour le paramètre enzymatique, et 10 ppm et 0,01 Da pour les tolérances massiques sur les ions précurseurs et fragments, respectivement.REMARQUE: Les modifications variables sont la désamidation (NQ) et l’oxydation (M). Tous les autres paramètres de recherche sont les valeurs par défaut. Les listes finales de peptides sont filtrées à l’aide d’alc de 80% et avec un taux de fausse découverte (FDR) de 1% à l’aide du logiciel d’analyse protéomique LC-MS/MS. 5. Visualisation des données immunopeptidomiques REMARQUE : La qualité des données immunopeptidomiques générées par la SP peut être évaluée de plusieurs façons, comme nous l’avons récemment décrit22,23. Pour visualiser les données et évaluer leur qualité globale, leur composition et leur spécificité du CMH, l’outil logiciel MhcVizPipe (MVP) peut être utilisé. Suivez toutes les instructions et la documentation connexe pour installer et exécuter le logiciel MVP disponible sur le site Web GitHub de Caron Lab24.REMARQUE : MVP fournit une vue rapide et consolidée de la qualité, de la composition et de la spécificité du CMH. MVP parallélise l’utilisation d’algorithmes immunopeptidomiques bien établis (NetMHCpan25, NetMHCIIpan26 et GibbsCluster27) et génère des rapports organisés et faciles à comprendre au format HTML (HyperText Markup Language). Les rapports sont entièrement portables et peuvent être consultés sur n’importe quel ordinateur doté d’un navigateur Web moderne. Voir Données supplémentaires 1 à 4 pour des exemples de rapports HTML.

Representative Results

Le flux de travail général pour isoler les complexes MHC-peptide pour l’analyse des immunopeptidomes par la SEP est illustré à la figure 1. Des résultats représentatifs pour la vérification de l’efficacité de liaison des billes de l’anticorps (Figure 2) (en utilisant l’anticorps Y3 anti-H2Kb) et l’efficacité d’élution des complexes MHC-peptide des billes (Figure 3) (en utilisant l’anticorps anti-HLA-ABC W6/32) sont présentés. Des tests de quantification basés sur la cytométrie en flux21 ont également été appliqués pour mesurer le nombre absolu de molécules de classe I du CMH par cellule EL4 (H2Kb et H2Db) et cellule JY (HLA-ABC), comme le montre la figure 4A. La reproductibilité intra- et inter-individuelle des résultats à l’aide du protocole actuel est illustrée à la figure 4B-E. Des résultats représentatifs sont présentés pour les peptides de classe I du CMH identifiés à partir de 1 x 108 cellules EL4 et 1 x 108 cellules JY. Les résultats ont été générés par deux membres différents du laboratoire (utilisateur 1 et utilisateur 2). Pour l’utilisateur 1, le nombre moyen de peptides spécifiques à MHCI détectés à partir de cellules EL4 et JY était de 1341 et 6361, respectivement; pour l’utilisateur 2, 1933 et 7238, respectivement (figure 4B,D). Le coefficient de variation moyen (CV) du nombre de peptides détectés dans trois répliques/expériences biologiques différentes varie de 1,9 % à 11 % (Figure 4B, D). Bien que les CV pour le nombre de peptides détectés dans les trois expériences différentes étaient relativement faibles, l’identité des peptides variait considérablement (Figure 4C,E). En effet, les diagrammes de Venn représentatifs montrent que la proportion de peptides détectés de manière reproductible dans trois répliques biologiques variait de 39 % (utilisateur 2, cellules EL4) à 63 % (utilisateur 1, cellules JY) (figure 4C, E et tableau supplémentaire 2). Les cartes thermiques générées par le logiciel MVP montrent la force de liaison MHC prévue des peptides identifiés à l’aide des outils de la suite NetMHCpan25,26,28. Deux options de routine GibbsCluster, appelées « GibbsCluster non supervisé » et « GibbsCluster spécifique à l’allèle », sont également effectuées par MVP pour extraire les motifs de liaison aux peptides MHC. Notez que MVP a des limites; son objectif principal n’est pas d’extraire des motifs spécifiques aux allèles et d’annoter des peptides de manière très précise, mais plutôt de fournir une vue d’ensemble sur la qualité globale, la composition et la spécificité du CMH des échantillons. Pour les peptides de classe I (H2Db et H2Kb) du CMH de souris dans les cellules EL4 (Figure 5A ; panneaux supérieurs et données supplémentaires 1), une carte thermique représentative montre que 89 % de tous les peptides 8-12-mer détectés devraient être des liants forts (SB : NetMHCpan %Rank <0,5) ou des liants faibles (WB : NetMHCpan %Rank <2) pour les molécules H2Db ou H2Kb. Les grappes de séquences générées à partir des peptides 8-12-mer sont en concordance avec les logos rapportés pour H2Db (asparagine à P5 et Leucine à P9) et H2Kb (phénylalanine à P5 et leucine à P8) (Figure 5)29. Il convient de mentionner qu’un troisième motif dominant (histidine à P7 et leucine à P9) ainsi que d’autres motifs « artéfactuels » peuvent être observés à l’aide de l’anticorps M1 (données supplémentaires 1). En fait, l’anticorps M1 est connu pour réagir de manière croisée avec la molécule Qa2 non classique et, par conséquent, les peptides associés au Qa2 sont également détectés par la SEP (données supplémentaires 1). Ici, pour simplifier, la figure 5 se concentre sur la démonstration des motifs de liaison peptidique bien établis pour les deux allèles H2b classiques (c’est-à-dire H2Db ou H2Kb) exprimés dans les cellules EL4. Pour les peptides HLA humains de classe I (HLA-ABC) dans les cellules JY (Figure 5A; panels inférieurs et données supplémentaires 2), une carte thermique représentative montre que 97% de tous les peptides 8-12-mer détectés devraient être SB ou WB pour HLA-A * 0201, -B * 0702 ou -C * 0702. Les peptides ont été regroupés pour visualiser les motifs de liaison aux peptides pour HLA-A * 0201 et -B * 0702. Le motif de liaison pour HLA-C*0702 n’est pas représenté à la figure 5A car l’allèle C*0702 a un niveau d’expression relativement faible. Par conséquent, trop peu de peptides C*0702 ont été isolés et identifiés pour générer un motif C*0702 représentatif. Notez que le motif C*0702 peut être visualisé dans d’autres études30,31,32 ou à partir du site Web NetMHCpan 4.1 Motif Viewer33. Pour les peptides HLA humains de classe II (HLA-DR) dans les cellules JY (Figure 5B; panneaux supérieurs et données supplémentaires S3), une carte thermique représentative montre que 70% de tous les peptides 9-22-mer détectés devraient être SB ou WB pour HLA-DRB1 * 0404 et -DRB1 * 1301. Les motifs de liaison peptidique de ces deux allèles sont représentés (Figure 5B). Notez que les motifs de liaison aux peptides présentés ici peuvent ne pas être en parfaite concordance avec les logos récemment signalés pour HLA-DRB1 * 0404 et -DRB1 * 130134. Cet écart met en évidence l’incapacité actuelle de MVP/NetMHCpan à annoter avec précision les peptides aux allèles HLA de classe II qui sont moins caractérisés, tels que HLA-DRB1*0404 et -DRB1*1301 exprimés dans les cellules JY. Des informations supplémentaires sur les motifs de liaison aux peptides de classe II peuvent être trouvées dans d’autres études34,35 et sur le site Web NetMHCIIpan 4.0 Motif Viewer36. Enfin, pour les peptides de classe II (H2-IAd et H2-IEd) du CMH de souris dans les cellules A20 (figure 5B; panneaux inférieurs et données supplémentaires 4), une carte thermique représentative montre que 87 % de tous les peptides 9-22-mer détectés devraient être SB ou WB pour H2-IAd ou H2-IEd. Les motifs de liaison peptidique de ces deux allèles sont en concordance avec les logos signalés37. Des rapports HTML complets générés par le logiciel MVP pour évaluer la qualité globale et la spécificité du CMH des échantillons sont disponibles dans les données supplémentaires 1 à 4. Figure 1 : Schéma de la procédure complète d’isolement des peptides MHC de classe I et II. (A-B)100 millions de cellules sont granulées et lysées avec un tampon Chaps à 0,5%. (C) Le lysat cellulaire est centrifugé et le surnageant est ajouté aux billes de CNBr-sépharose couplées à l’anticorps souhaité au préalable et (D) incubé 14-18 h à 4 °C. (E) Après immunocapture, les billes sont transférées dans une colonne de polypropylène et lavées, et les complexes MHC-peptide sont élués avec une solution de TFA à 1%. (F) Les peptides sont dessalés et élués à l’aide d’une colonne C18. (G) Par la suite, les peptides sont séchés rapidement et analysés par spectrométrie de masse en tandem. (H) La qualité des peptides isolés des cmH de classe I et II peut être évaluée sur la base des sous-types HLA à l’aide du logiciel MhcVizPipe disponible gratuitement. Figure créée avec BioRender.com (NT22ZL8QSL). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Coloration du gel de Coomassie pour suivre l’efficacité de la liaison des anticorps aux billes activées par le CNBr de sépharose. Des aliquotes de volumes équivalents ont été chargées sur du gel SDS-PAGE à 12 %, suivies d’une coloration bleue de Coomassie : perles + pré-couplage d’anticorps (1), anticorps non liés après l’étape de couplage (2), surnageant après le dernier lavage après couplage (3), et perles couplées à des anticorps (4). L’efficacité de la liaison est illustrée par une diminution significative de l’intensité de coloration du signal des chaînes légères et lourdes de H2Kb lorsque les billes sont liées de manière covalente (voie 4) aux billes CNBr par rapport à l’anticorps avant couplage (voie 1). La figure a été réimprimée et adaptée de bioRxiv38. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Western blotting pour le suivi des complexes MHC-peptide après l’élution acide des billes activées par CNBr couplées aux anticorps. Les aliquotes prélevées à partir des étapes indiquées dans le protocole (1/100 du volume total mesuré) ont été chargées sur un gel SDS-PAGE à 12% et transférées sur membrane de nitrocellulose : Perles + lysat après immunocapture et dernier lavage (A) ; surnageant du dernier lavage (B) et des complexes CMH-peptide élués des billes (C). Le fort signal de détection des complexes MHC-peptide en (C) à l’aide d’anticorps à chaîne lourde anti-HLA-ABC (Abcam, #ab 70328, 1:5000) a confirmé l’isolement des complexes MHC-peptide après une élution acide. Notez qu’il est possible d’évaluer la proportion de complexes MHC-peptide qui n’ont pas été capturés par les billes couplées aux anticorps en collectant le flux à partir de l’étape 3.1.6. Une aliquote peut être ajoutée au western blot (non indiqué sur ce gel). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Identification des peptides de classe I du CMH à partir de cellules JY et EL4. (A) Histogramme montrant le nombre absolu de molécules H2Db et H2Kb de surface cellulaire par cellule EL4 et de molécules HLA-ABC par cellule JY. La quantification a été réalisée par cytométrie en flux. L’erreur moyenne et l’erreur-type de la moyenne ont été obtenues à partir de trois réplicats biologiques. (B, D) Histogramme montrant le nombre moyen et l’écart-type de la moyenne des peptides de classe I du CMH identifiés par deux utilisateurs indépendants (USER_1 [U1] et USER_2 [U2]). Le nombre moyen et l’écart-type de la moyenne des peptides de classe I du CMH détectés dans les cellules EL4 (B) de souris et les cellules JY humaines (D) sont indiqués. Les coefficients de variation (CV) entre trois répliques biologiques indépendantes sont indiqués. (C, E) Diagrammes de Venn montrant le nombre de peptides qui ont été détectés de manière reproductible dans les cellules EL4 (C) et JY (E) par deux utilisateurs indépendants (U1 et U2) sur trois répliques biologiques indépendantes. La figure 4A a été réimprimée et adaptée de bioRxiv38. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Visualisation des données immunopeptidomiques à l’aide de l’outil logiciel MVP. Analyse des données des peptides de classe I et (B) du CMH de classe II de souris et d’homme (A). Des cartes thermiques d’affinité de liaison représentatives (panneaux de gauche) et des motifs de liaison peptidique (panneaux de droite) sont affichés. Les couleurs des cartes thermiques représentent l’affinité de liaison MHC prédite par NetMHCpan 4.1 (%rank). Les liants forts sont rouges (%rang <0,5), les liants faibles sont bleus (%rang 2). La proportion (%) de 8-12mer peptides (A) et 9-22mer peptides (B) qui sont SB ou WB est indiquée entre parenthèses. Les motifs de liaison peptidique ont été générés par MVP à l’aide de l’option « Gibbscluster spécifique à l’allèle ». Ces résultats représentatifs ont été obtenus à partir de 1 x 108 cellules et en utilisant les anticorps et les lignées cellulaires suivants : anticorps M1 et cellules EL4 pour les peptides de classe I du CMH de souris ; Anticorps W6/32 et cellules JY pour les peptides humains de classe I du CMH; Anticorps M5 et cellules A20 pour les peptides de classe II du CMH de souris; Anticorps L243 et cellules JY pour les peptides humains de classe II du CMH. Reportez-vous aux données supplémentaires 1 à 4 pour accéder aux rapports HTML complets générés par le logiciel MVP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Données supplémentaires 1-4 : Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Données supplémentaires 1 : Rapport HTML généré par le logiciel MVP à partir de peptides isolés à partir de 1 x 108EL4 cellules à l’aide de l’anticorps M1. Trois répliques biologiques sont montrées. Ce rapport est lié aux figures 4 et 5 et les peptides représentatifs sont énumérés dans le tableau supplémentaire 2. Données supplémentaires 2 : Rapport HTML généré par le logiciel MVP à partir de peptides isolés à partir de 1 x 108 cellulesJY à l’aide de l’anticorps W6/32. Trois replaques biologiques sont montrées. Ce rapport est lié à la figure 4 et à la figure 5, et les peptides représentatifs sont énumérés dans le tableau supplémentaire 2. Données supplémentaires 3 : Rapport HTML généré par le logiciel MVP à partir de peptides isolés à partir de 1 x 108JY cellules à l’aide de l’anticorps L243. Ce rapport est lié à la figure 5, et les peptides représentatifs sont énumérés dans le tableau supplémentaire 2. Données supplémentaires 4 : Rapport HTML généré par le logiciel MVP à partir de peptides isolés à partir de 1 x 108A20 cellules à l’aide de l’anticorps M5. Ce rapport est lié à la figure 5, et les peptides représentatifs sont énumérés dans le tableau supplémentaire 2. Tableau supplémentaire 1 : Liste des tampons. Les recettes de tous les tampons utilisés dans le protocole sont décrites. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau. Tableau supplémentaire 2 : Listes représentatives des peptides associés à H2Db/Kb, HLA-ABC, HLA-DR et H2-IAd/IEd. Ce tableau contient les listes des peptides représentatifs du CMH de classe I et II isolés à partir de lignées cellulaires EL4 et A20 de souris, respectivement, et de HLA de classe I et II de lignées cellulaires JY humaines. Ces données ont été déposées sur le ProteomeXchange (PXD028633). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau. DISPONIBILITÉ DES DONNÉES : Les ensembles de données utilisés dans ce manuscrit ont été déposés sur le ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset) : PXD028633.

Discussion

Deux lignées cellulaires de souris (EL4 et A20), une lignée cellulaire humaine (JY) et cinq anticorps disponibles dans le commerce [M1 (anti-H2Db/Kb), Y3 (anti-H2Kb), M5 (anti-H2-IAd/IEd), W6/32 (anti-HLA-ABC) et L243 (anti-HLA-DR)] ont été testés et validés dans le cadre de ce protocole et fournissent des données immunopeptidomiques de haute qualité. D’autres anticorps anti-HLA sont disponibles (par exemple, anti-HLA-A2 BB7.2) mais n’ont pas été testés ici. Notez que l’anticorps W6/32 est largement utilisé et l’anticorps le plus établi dans le domaine; il permet l’isolement des peptides présentés par toutes les molécules HLA-ABC chez l’homme et a déjà été rapporté par des laboratoires experts pour travailler à partir de diverses sources biologiques telles que les tissus frais ou congelés8,39, les cellules mononucléaires du sang périphérique et les cellules mononucléaires de la moelle osseuse40, les biopsies41, les xénogreffes41,42, les autopsies43 et les échantillons de plasma44,45.

La préparation de solutions fraîches qui sont utilisées tout au long du protocole est essentielle. En particulier, l’utilisation de solutions acides fraîches dans les bouteilles en verre est essentielle pour éviter une contamination ultérieure des échantillons analysés par la SEP. De plus, lorsque le protocole est fait pour la première fois et/ou avec un nouvel anticorps, il est important d’évaluer que l’anticorps est effectivement couplé aux billes de CNBr Sepharose à l’aide d’un gel bleu Coomassie. Les étapes de lavage des billes couplées aux anticorps après l’immunocapture des complexes MHC-peptide sont également essentielles pour éviter la contamination des peptides non-MHC. Enfin, un soin particulier est nécessaire pour ne pas jeter les éluats suite à l’élution des complexes MHC-peptide avec 1% de TFA et à l’élution des peptides de la colonne C18 avec ACN28%/0,1% FA.

Les protocoles existants disponibles dans la littérature décrivent des étapes supplémentaires pour purifier davantage les peptides à la fin de la procédure d’isolement, par exemple, le fractionnement des peptides par différentes méthodes14,46 ou l’ultrafiltration à l’aide de filtres 10-30 kDa13,47. Le protocole actuel ne fournit pas de détails sur ces étapes supplémentaires et est suffisant pour fournir des données immunopeptidomiques de haute qualité. Cependant, de telles étapes pourraient être envisagées par des non-experts pour modifier et dépanner afin d’optimiser davantage la procédure d’isolement peptidique.

Le type de billes et le type de tampon d’élution acide qui sont utilisés pour éluer les complexes MHC des billes peuvent également être modifiés pour le dépannage13,14,15,16,17,18,19. À cet égard, les billes activées par le CNBr de sépharose sont généralement un bon point de départ car elles sont relativement peu coûteuses en plus de montrer une flexibilité en termes de liaison avec divers types d’anticorps. Dans le protocole actuel, il a été démontré que les billes activées par le CNBr de sépharose fonctionnaient relativement bien en utilisant cinq anticorps différents disponibles dans le commerce (c.-à-d. M1, Y3, W6/32, L243 et M5). Outre les billes activées par le CNBr de sépharose, les billes de protéine A ou G ou A / G de sépharose 4 Fast Flow sont également faciles à manipuler et, bien que relativement plus chères, peuvent générer des résultats similaires. Un autre facteur à considérer est l’affinité de l’anticorps pour la protéine A ou G. De plus, les billes magnétiques de sépharose sont également très faciles à utiliser mais sont relativement chères. Indépendamment du type de perles sélectionnées par des non-experts, il est recommandé de collecter des aliquotes aux étapes critiques du protocole et d’effectuer des gels SDS-PAGE colorés en bleu Coomassie pour suivre l’efficacité de liaison de l’anticorps aux billes, comme le montre la figure 2.

Un autre facteur important influençant le succès de l’isolement des peptides MHC concerne le type de tampon d’élution acide utilisé pour isoler les complexes MHC-peptide des billes. Différents tampons ont été signalés, notamment 0,1%, 1% ou 10% TFA, 0,2% FA et 10% d’acide acétique. 1% TFA était le tampon d’élution fonctionnant pour tous les anticorps testés. Cette étape pourrait également être tracée par transfert Western contre les molécules du CMH utilisées pour capturer les peptides du CMH, comme le montre la figure 3.

Tous les tampons contenant de l’acétonitrile (ACN) et/ou de l’acide trifluoroacétique (TFA) sont agressifs et peuvent entraîner une contamination de l’échantillon par de petites substances moléculaires et polymères telles que des plastifiants en cas de contact avec du plastique. Pour éviter de tels problèmes, toutes les solutions contenant un solvant organique et / ou un TFA sont préparées fraîches tous les jours et stockées dans une bouteille en verre jusqu’à utilisation. La majorité des étapes sont effectuées dans un tube en plastique Protein LoBind. Ces tubes sont spécialement conçus pour la protéomique et sont fabriqués en polypropylène vierge de la plus haute qualité, exempt de biocides, de plastifiants et de latex. Ils sont également produits avec des moules optimisés et hautement polis sans l’utilisation d’agents antidérapants. Ces précautions sont importantes à prendre en compte pour permettre la génération de données immunopeptidomiques de haute qualité.

L’anticorps est une limitation importante pour l’isolement des peptides liés au CMH. L’anticorps W6/32 permet l’isolement des peptides présentés par toutes les molécules HLA-ABC de classe I chez l’homme et est l’anticorps le plus largement utilisé et le plus établi dans le domaine. Le typage HLA à haute résolution de lignées cellulaires humaines non caractérisées ou d’échantillons biologiques n’est pas une nécessité lors de l’application de l’anticorps W6/32, mais est néanmoins recommandé pour certaines applications afin de faciliter l’interprétation des données48. Les informations de typage HLA/MHC peuvent également être trouvées dans les ressources publiques pour plusieurs lignées cellulaires et modèles de souris49. Outre l’anticorps W6/32, les quatre autres anticorps (M1, M5, Y3 et L243) qui ont été testés et validés dans le cadre de ce protocole sont tous disponibles dans le commerce. D’autre part, de nombreux autres anticorps qui ont été rapportés dans des études immunopeptidomiques antérieures n’ont pas été largement adoptés par la communauté et ne sont pas disponibles dans le commerce ou sont disponibles par la culture de lignées cellulaires d’hybridomes, ce qui est relativement coûteux.

Une autre limitation importante pour l’isolement des peptides liés au CMH est la quantité de matière première requise. La quantité requise est inversement proportionnelle au niveau d’expression des molécules du CMH à la surface de la cellule, qui peut être quantifié par cytométrie en flux (figure 4A). Les cellules présentant des niveaux d’expression élevés de molécules du CMH (p. ex., les cellules dendritiques et les cellules hématopoïétiques en général) produisent généralement des données immunopeptidomiques de haute qualité. Les laboratoires experts utilisent aussi peu que 50 millions de cellules50, mais 100 millions à 1 milliard de cellules sont recommandées pour les non-experts. L’utilisation d’échantillons de biopsie tissulaire (<13 mg)41, de xénogreffe42,43, d’autopsie44 et de plasma45,46 a également été signalée, mais reste difficile pour les laboratoires non experts. En outre, le nombre total de peptides associés au CMH attendus est bien documenté pour les lignées cellulaires établies (ici, entre ~2000 et ~10000 peptides selon la lignée cellulaire et l’anticorps utilisés), mais les quantités absolues de peptides naturellement présentés qui sont efficacement tirés vers le bas par la technique restent débattues. En effet, des études antérieures ont estimé que l’efficacité de la procédure d’isolement dépend des peptides et peut être aussi faible que 0,5% à 2% 51. D’autres limitations de l’immunopeptidomie sont la reproductibilité des méthodes et l’incapacité des outils de la suite NetMHCpan à annoter correctement les peptides en allèles du CMH qui sont moins caractérisés. À cet égard, poursuite du développement et de l’application de méthodes MS d’acquisition relativement nouvelles indépendantes des données7,32,52, ainsi que de nouveaux algorithmes de regroupement de peptides et de prédiction de la liaison aux peptides MHC31,34,53,54 devraient améliorer la reproductibilité et la précision de l’annotation peptidique dans les immunopeptidomiques. L’immunopeptidomie est confrontée à d’autres limitations concernant l’acquisition de SEP et l’analyse informatique des peptides associés au CMH et est couverte ailleurs1,6,55.

Bien que l’isolement des peptides associés à HLA-ABC à partir d’échantillons humains à l’aide de l’anticorps W6/32 soit bien établi et largement appliqué par de nombreux groupes de recherche, l’isolement des peptides associés au CMH de souris de classe I et II est relativement moins établi. Par conséquent, des protocoles robustes pour l’isolement des ligands du CMH de souris sont nécessaires. Ici, nous fournissons un protocole optimisé pour l’isolement des peptides MHC classe I et MHC classe II à partir de deux lignées cellulaires de souris d’origine C57BL/6 et BALB/c, respectivement. Plus précisément, le protocole permet d’isoler les peptides associés h2Kb et H2Db de classe I à l’aide de l’anticorps M1, ainsi que les peptides associés à H2-IAd et H2-IEd de classe II à l’aide de l’anticorps M5. Ainsi, la diffusion et l’application du protocole actuel devraient faciliter la recherche immunopeptidomique fondamentale et translationnelle dans divers modèles murins.

Le protocole peut être utilisé pour établir et normaliser un flux de travail immunopeptidomique, ainsi que pour comparer de nouveaux protocoles. Par exemple, il peut être adapté et optimisé pour effectuer un dépistage immunopeptidomique dans diverses matrices biologiques allant du sang / plasma aux tissus frais ou congelés en passant par le FFPE (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded). En outre, le protocole favorisera la reproductibilité intra- et inter-laboratoire de la procédure de préparation d’échantillons en immunopeptidomie et devrait donc trouver une large application dans la recherche fondamentale et clinique.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Pierre Thibault, Eric Bonneil, Joël Lanoix, Caroline Côté (Institut de recherche en immunologie et en cancer, Université de Montréal) et Anthony Purcell (Université Monash) pour leurs commentaires perspicaces. Ces travaux ont été soutenus par le Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS), la Fondation Cole, le CHU Sainte-Justine et les Fondations Charles-Bruneau, la Fondation canadienne pour l’innovation, le Conseil national de recherches en sciences et en génie (CRSNG) (#RGPIN-2020-05232) et les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (no 174924).

Materials

A20 cell line ATCC TIB-208 mouse B lymphoblast
Acetonitrile, LC/MS Grade FisherScientific A955-4
anti-Human HLA A, B, C (W6/32) – MHC class I BioXcell BE0079
anti-Human/Monkey HLA-DR (L243) – MHC class II BioXcell BE0308
anti-Mouse H2 (M1/42.3.9.8) – MHC class I BioXcell BE0077
anti-Mouse H2-IAd/IEd (M5/114) – MHC class II BioXcell BE00108
anti-Mouse H2Kb (Y3) – MHC class I BioXcell BE0172
BupH Phosphate Buffered Saline Packs (PBS) ThermoFisher 28372 Pouch contents dissolved in a final volume of 500 mL deionized water (FisherScientific, W64)
CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate) EMDMilipore 220201-10MG
CNBr-activated Sepharose Cytivia # 17-0430-01
EL4 cell line ATCC TIB-39 mouse T lymphoblast
epTIPS LoRetention Tips, 1000 µL/Eppendorf FisherScientific 02-717-352 Better results with low retention material
epTIPS LoRetention Tips, 200 µL/Eppendorf FisherScientific 02-717-351 Better results with low retention material
Formic Acid, LC/MS Grade FisherScientific A117-50
Glycine FisherScientific RDCG0250500
Hydrochloric acid solution FisherScientific 60-007-11
JY cell line Sigma Aldrich 94022533-1VL EBV-immortalised B cell lymphoblastoid line
Methanol, LC/MS Grade FisherScientific A456-4
Poly prep chromatography columns (polypropylene column) Bio-Rad 731-1550 referred as polypropylene column in the protocol
Proteases inhibitor ThermoFisher A32963 1 pellet per 10 mL of cell lysis buffer
Qifikit Dako K007811-8
Sodium Bicarbonate Amresco # 0865-1kg
Sodium Chloride FisherScientific MSX04201
Solid phase extraction disk, ultramicrospin column C18 The nest group SEMSS18V capacity of 6–60 µg, max volume of 200 µL
Trifluoroacetic Acid (TFA), LC-MS Grade FisherScientific PI85183
Tris FisherScientific T395-500
Tris-HCl FisherScientific #10812846001
Tube LoBind 1.5 mL/Eppendorf FisherScientific E925000090 Better results with low retention material
Tube LoBind 2 mL/Eppendorf FisherScientific 13-698-795 Better results with low retention material
Water, LC/MS Grade FisherScientific W64
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Sirois, I., Isabelle, M., Duquette, J. D., Saab, F., Caron, E. Immunopeptidomics: Isolation of Mouse and Human MHC Class I- and II-Associated Peptides for Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (176), e63052, doi:10.3791/63052 (2021).
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