JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Иммунопептидомика: выделение мышиных и человеческих пептидов MHC класса I и II для масс-спектрометрического анализа

Published: October 15, 2021
doi:
10.3791/63052
, , , ,
1CHU Sainte-Justine Research Center, 2Department of Pathology and Cellular Biology, Faculty of Medicine,Université de Montréal

Summary

Здесь мы представляем протокол очистки пептидных комплексов MHC класса I и класса II от клеточных линий мыши и человека, обеспечивающий высококачественные данные иммунопептидомики. Протокол фокусируется на пробоподготовке с использованием коммерчески доступных антител.

Abstract

Иммунопептидомика является новой областью, которая подпитывает и направляет разработку вакцин и иммунотерапии. Более конкретно, это относится к науке исследования состава пептидов, представленных основными молекулами комплекса гистосовместимости (MHC) класса I и класса II с использованием технологических платформ масс-спектрометрии (MS). Среди всех этапов в рабочем процессе иммунопептидомики на основе РС, подготовка образца критически важна для сбора высококачественных данных терапевтической значимости. Здесь описаны пошаговые инструкции по выделению пептидов MHC класса I и II путем иммуноаффинной очистки из образцов контроля качества, из клеточных линий мыши (EL4 и A20) и человека (JY) более конкретно. Различные реагенты и специфические антитела тщательно описаны для выделения MHC-ассоциированных пептидов из этих клеточных линий, включая этапы для проверки эффективности связывания шариков антитела и эффективности элюирования MHC-пептидных комплексов из шариков. Протокол может быть использован для создания и стандартизации рабочего процесса иммунопептидомики, а также для сравнения новых протоколов. Кроме того, протокол представляет собой отличную отправную точку для любых неспециалистов, а также способствует внутри- и межлабораторной воспроизводимости процедуры подготовки образцов при иммунопептидомике.

Introduction

За последнее десятилетие интерес к исследованию репертуара пептидов, связанных с MHC, превысил академический сектор и достиг биотехнологической и фармацевтической промышленности. Действительно, при раке открытие действенных опухолеспецифических неоантигенов представляет собой основной исследовательский фокус в промышленном секторе для разработки клинической иммунотерапии, ведущей к персонализированной онкологии1,2,3. По сути, MHC-ассоциированные пептиды представлены по всему телу, отражают внутриклеточную стадию клетки и значимы при различных заболеваниях, таких как аутоиммунитет, трансплантация, инфекционные заболевания, воспаление, рак и аллергия1,4. Таким образом, MHC-ассоциированные пептиды, или лиганды лейкоцитарного антигена человека (HLA) у людей, представляют большой медицинский интерес и в совокупности называются иммунопептидом5.

РС является мощным аналитическим подходом для характеристики иммунопептидома6,7, включая открытие опухолеспецифических неоантигенов8,9,10,11. Типичный рабочий процесс для проведения эксперимента с иммунопептидомикой включает в себя три основных этапа: 1) пробоподготовка для выделения MHC-ассоциированных пептидов, 2) сбор данных MS и 3) анализ данных с использованием различных вычислительных программных инструментов12. Генерация высококачественных образцов, описанных в этом визуализированном протоколе, имеет решающее значение для успеха любого проекта по иммунопептидомике на основе РС. Протокол, описанный ниже, фокусируется на выделении пептидов MHC класса I и II из хорошо зарекомендовавших себя клеточных линий, которые подходят для получения высококачественных данных иммунопептидомики. Репрезентативные результаты из этих клеточных линий показаны в текущем протоколе.

Protocol

Представленный здесь протокол был адаптирован из установленных протоколов13,14,15,16,17,18,19,20. Общая процедура иммуноаффинной очистки (IP) пептидов MHC класса I и II проиллюстрирована на рисунке 1. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации об используемых клеточных линиях и антителах. 1. Соединение бусин с антителами (День 1): Соединение антител с сефарозными CNBr-активированными шариками ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте свежие растворы для каждого нового эксперимента. Список рецептов реагентов и растворов приведен в Таблице материалов и Дополнительной таблице 1 . Все этапы проводятся при комнатной температуре (РТ). При использовании нового антитела проверьте эффективность связывания, собрав ключевые аликвоты (см. показания OPTIONAL) и выполнив окрашивание Coomassie синим цветом SDS-PAGE (рисунок 2). Активация бусин сефароз CNBr Взвесьте 80 мг бусин, активированных сефарозой CNBr, на образец и переложите их в коническую трубку объемом 15 мл. Чтобы облегчить повторное суспендирование высушенных бусин, сначала добавьте 5 мл 1 мМ HCl и пипетку вверх и вниз 5 раз. Затем заполните коническую трубку дополнительными 8,5 мл 1 мМ HCl. Вращайте со скоростью 20 об/мин (оборотов в минуту) в течение 30 мин при RT с помощью ротаторного устройства. Центрифугируйте шарики при 200 х г в течение 2 мин при РТ и удалите супернатант путем аспирации. Добавьте 500 мкл буфера связи к гранулированию шариков и переложите в новую центрифужную трубку объемом 2,0 мл и держите в стороне для этапа 1.2.2. Соединение антител к CNBr-активированным шарикам Готовят выбранное антитело для выделения пептидов MHC класса I или II в новой микроцентрифужной трубке объемом 2,0 мл путем добавления 2 мг антитела (согласно концентрации, указанной производителем). Заполните объем до 1 мл буферным раствором для соединения, чтобы получить конечную концентрацию 2 мг/мл. Центрифугируют шарики со стадии 1.1.4 при 200 х г в течение 2 мин при РТ, а затем удаляют супернатант путем аспирации. Добавьте раствор антител в микроцентрифужную трубку объемом 2,0 мл, содержащую активированные шарики. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Возьмите аликвоту 18 мкл (INPUT), добавьте 6 мкл 4x буфера SDS-PAGE и немедленно заморозьте. Поверните трубку микроцентрифуги со стадии 1.2.3 при 20 об/мин в течение 120 мин с помощью ротаторного устройства. Центрифугируйте шарики при 200 х г в течение 2 мин, а затем удалите супернатант. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Возьмите аликвоту в 18 мкл супернатанта (несвязанного антитела), добавьте 6 мкл 4x буфера SDS-PAGE и немедленно заморозьте. Блокировка и промывка антител-связок-шариков Добавьте 1 мл 0,2 М глицина в микроцентрифужную трубку, содержащую шарики, связанные с антителами, со стадии 1.2.5. Поворачивайте со скоростью 20 об/мин в течение 60 мин на RT с помощью ротаторного устройства. Центрифугируйте шарики по 200 х г в течение 2 мин, затем удалите супернатант. Добавьте 1 мл PBS (фосфатно-буферный физиологический раствор). Центрифугируйте шарики по 200 х г в течение 2 мин, затем удалите супернатант. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Возьмите аликвоту в 18 мкл супернатанта (несвязанное антитело, последняя промывка), добавьте 6 мкл 4x буфера SDS-PAGE и немедленно заморозьте. Добавьте 1 мл PBS к бусинам на шаге 1.3.3. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Возьмите аликвоту в 18 мкл смеси бусин (бусины в сочетании с антителами), добавьте 6 мкл 4x буфера SDS-PAGE и немедленно заморозьте. Хранить при температуре 4 °C до использования в тот же день на шаге 2.5.ПРИМЕЧАНИЕ: Бусины могут быть приготовлены за день до иммунозахвата, но более длительное хранение не было проверено. 2. Лизис и иммунозахват клеток с помощью антител- бусин (День 1) ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень молекул MHC варьируется от одного типа клеток к другому, и предлагается количественная оценка молекул MHC / HLA на клетку21 (рисунок 4A). Мы рекомендуем минимум 1 x 108 ячеек для каждого IP-адреса. Это количество клеток соответствует 6-10 мг белка из клеток JY, EL4 и A20, солюбилизированных 0,5% буфером Chaps. Чтобы подготовить гранулы клеток для IP, клетки должны быть собраны, центрифугированы и дважды промыты 5 мл PBS. Затем клеточные гранулы могут храниться в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл или конической трубке объемом 15 мл при -80 °C до момента IP. Обратите внимание, что IP-адреса могут быть выполнены на свежесобранных или замороженных гранулах клеток. Чтобы выделить пептиды MHC класса I или II, разморозьте замороженную гранулу размером 1 х 108 клеток, согрев дно трубки ладонью. Добавьте 500 мкл PBS к грануле и пипетке вверх и вниз, пока суспензия не станет однородной.ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от типа ячейки, объем гранул ячейки может существенно варьироваться. Если 500 мкл PBS недостаточно для растворения клеточной гранулы, используйте больше PBS до тех пор, пока клетки не дезагрегируются легко при пипетке вверх и вниз. Измерьте общий объем гранул, повторно суспендированных в PBS, и переведите в новую трубку 2 мл микроцентрифуги. При необходимости разделите на дополнительные трубки. Добавьте объем буфера лизиса клеток (1% буфера chaps в PBS, содержащий ингибиторы протеазы, 1 гранулу / 10 мл буфера), эквивалентный объему клеточной гранулы, повторно суспендированной в PBS, измеренной на предыдущем этапе. Конечная концентрация лизисного буфера составляет 0,5% chaps. Вращайте со скоростью 10 об/мин в течение 60 мин при 4 °C с помощью ротаторного устройства. Центрифугируют клеточный лизат при 18 000 х г в течение 20 мин при 4 °C с полным тормозом и переносят супернатант (содержащий комплексы MHC-пептидов) в новую микроцентрифужную трубку объемом 2,0 мл. Извлеките шарики, связанные с антителами, со стадии 1.3.7 путем центрифугирования при 200 х г в течение 2 мин и удалите супернатант. Перенесите супернатант клеточного лизата на стадии 2.4 в шарики, связанные с антителами, и инкубируйте с вращением (10 об/мин) в течение 14-18 ч (в течение ночи) при 4°C с помощью ротаторного устройства. 3. Элюирование пептидов MHC (День 2) ПРИМЕЧАНИЕ: Полипропиленовая колонна позволяет элюировать MHC-пептидные комплексы при удержании шариков в колонне. Для того чтобы оценить долю комплексов MHC-пептидов, связанных шариками до и после кислого элюирования с 1% TFA (трифторуксусной кислотой), можно выполнить вестерн-блоттинг с аликвотами, предпринятыми на ключевых этапах во время протокола (см. указание НЕОБЯЗАТЕЛЬНО). Вестерн-блоттинг, показанный на рисунке 3 , показывает обогащение MHC-пептидных комплексов после кислотного элюирования 1% TFA. Отсутствие сигнала в этой дроби будет указывать на то, что этап элюирования не был успешным. Обратите внимание, что пропорция несвязанных комплексов MHC-пептидов к шарикам также может быть оценена параллельно с помощью вестерн-блоттинга с использованием аликвоты, описанной на этапе 3.1.6. Элюирование MHC-пептидных комплексов из антител, связанных с шариками Снимите нижнюю крышку полипропиленовой колонны, поместите колонну на стойку для полипропиленовой колонны и установите пустой контейнер под ней, чтобы собрать поток.ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется один столбец для каждого образца. Промыть полипропиленовую колонну 10 мл буфера А и дать ей стечь под действием силы тяжести. Если скорость потока жидкостного элюирования слишком низкая, дополнительно отрежьте нижнюю кончик полипропиленовую колонну. Измерьте и соберите смесь шариков и лизата (~2 мл) со стадии 2,5 и перенесите ее в полипропиленовую колонну. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Возьмите аликвоту в 20 мкл (или 1/100 от общего объема) для вестерн-блоттинга и немедленно заморозьте. Эта фракция соответствует общим комплексам MHC-пептидов, инкубированных с шариками. Пусть жидкая смесь элюируется под действием силы тяжести. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Соберите и измерьте проточную способность и возьмите аликвоту в размере 20 мкл (или 1/100 от общего объема) для вестерн-блоттинга и немедленно заморозьте. Эта фракция представляет собой остаточные несвязанные комплексы MHC-пептидов. Чтобы максимально восстановить бисерно-лизатную смесь, промыть трубку со стадии 3.1.3 1 мл буфера А и перенести ее в полипропиленовую колонну. Промыть шарики, оставшиеся в полипропиленовой колонке, добавив 10 мл буфера А. Пусть моющий буфер элюируется под действием силы тяжести. Повторите этап промывки с 10 мл буфера B, 10 мл буфера A и затем 10 мл буфера C. Снимите полипропиленовую колонну со стойки и поместите ее поверх новой микроцентрифужной трубки объемом 2,0 мл. Держите колонну и трубку вместе рукой. Добавьте 300 мкл 1% TFA в полипропиленовую колонну и перемешайте шарики, пипеткой вверх и вниз 5 раз.ПРИМЕЧАНИЕ: Шарики будут удерживаться в полипропиленовой колонке, а пептиды, связанные с MHC, будут элюироваться в микроцентрифужной трубке объемом 2,0 мл. Перенесите элюат в новую микроцентрифужную трубку объемом 2,0 мл. Повторите этап 3.1.11 и объедините 2 элюата (элюаты, содержащие MHC-пептидные комплексы, должны соответствовать в общей сложности 600 мкл и будут использоваться на этапе 3.2.4). (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Соберите аликвоту в размере 6 мкл (или 1/100 от общего объема) для вестерн-блоттинга и немедленно заморозьте. Эта фракция соответствует комплексам MHC-пептидов, элюированным из шариков. Обессоливание и элюирование пептидов MHCПРИМЕЧАНИЕ: Этапы обессоливания и элюирования пептидов MHC могут быть выполнены путем установки колонны C18 на микроцентрифужную трубку объемом 2,0 мл. Для лучшей посадки установите отжиги, предоставленные производителем, между колонной C18 и трубкой микроцентрифуги объемом 2,0 мл. В этом протоколе используется колонка C18 с объемной емкостью 5-200 мкл (6-60 мкг). Все этапы выполняются на РТ. Добавьте 200 мкл метанола поверх колонки C18, затем центрифугу при 1546 х г в течение 3 мин. Отбросьте сквозной поток. Добавьте 200 мкл 80% ACN (ацетонитрил)/0,1% TFA поверх колонки C18, затем центрифугу при 1546 х г в течение 3 мин. Отбросьте сквозной поток. Добавьте 200 мкл 0,1% TFA поверх колонки C18, затем центрифугу при 1546 х г в течение 3 мин. Отбросьте сквозной поток. Нагрузка 200 мкл MHC-пептидных комплексов с шага 3.1.12 поверх колонны C18. Центрифуга при 1546 х г в течение 3 мин и отбрасывает поток насквозь. Повторите шаг 3.2.4 дважды, пока не будет загружен весь том. Обратите внимание, что пептиды MHC сохраняются в колонке C18. Добавьте 200 мкл 0,1% TFA в колонку C18, затем центрифугу при 1546 х г в течение 3 мин. Отбросьте сквозной поток. Перенесите колонку C18 в новую микроцентрифужную трубку объемом 2,0 мл. Пептиды Elute MHC из колонки C18 путем добавления 150 мкл 28% ACN/0,1% TFA. Центрифуга при 1546 х г в течение 3 мин. Перенесите проточную трубу в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Будьте осторожны, чтобы не отбросить сквозной поток; он содержит изолированные пептиды MHC класса I или II. Повторите шаги 3.2.7-3.2.9 дважды для общего объема 450 мкл. Заморозьте 450 мкл элюата (очищенные пептиды MHC класса I или II) при -20 °C до тех пор, пока образцы не будут проанализированы LC-MSMS. Перед анализом LC-MS/MS очищенные пептиды MHC класса I или II со стадии 3.2.11 выпаривают до сухости с помощью вакуумного концентратора с заданными значениями 45 °C в течение 2 ч, уровень вакуума: 100 мТорр и вакуумная рампа: 5.ПРИМЕЧАНИЕ: Испарение замороженных образцов является высокоэффективным. Высушенные пептиды можно повторно заморозить до анализа. 4. Идентификация пептидов MHC класса I и II по LC-MS/MS ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ иммунопептидома MHC класса I и II с использованием высокоэффективного Orbitrap и квадрупольных масс-спектрометров высокого разрешения6. Следующая информация приведена только в качестве указания, принимая во внимание, что различные существующие тандемные масс-спектрометрические приборы работают в соответствии с различными эксплуатационными стандартами. Краткий обзор шагов обсуждается ниже: Солюбилизируйте высушенные образцы (со стадии 3.2.12) в 50 мкл 4% муравьиной кислоты (ФА). Загрузите три инъекции по 16 мкл для каждого образца и отдельно на самодельную колонну обратной фазы (150 мкм т.д. на длину 250 мм, Юпитер 3 мкм C18 300 Å) с градиентом от 5%-30% ACN-0,1% FA и скоростью потока 600 нл/мин на нанопотоке UHPLC, подключенном к MS. Приобретайте каждый полный спектр МС с разрешением 120000, АРУ 4 х 105 с автоматическим режимом для времени впрыска и спектров с использованием тандема-МС (MS-MS) на наиболее распространенных многократно заряженных ионах-предшественников в течение максимум 3 с.ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты Tandem-MS проводятся с использованием более высокоэнергетической коллизионной диссоциации (HCD) при энергии столкновения 30%, разрешении 30 000, АРУ 1,5 x 105 и времени инъекции 300 мс. Обработайте файлы данных из трех инъекций / образца с помощью программного обеспечения для анализа протеомики LC-MS / MS (например, PEAKS X) с использованием баз данных мыши и человека (UniProtKB / Swiss-Prot (2019_09)). Выберите «Неуточненное переваривание ферментов» для параметра фермента и 10 ppm и 0,01 Da для массовых допусков на ионы предшественников и фрагментов соответственно.ПРИМЕЧАНИЕ: Переменными модификациями являются деамидация (NQ) и окисление (M). Все остальные параметры поиска являются значениями по умолчанию. Окончательные списки пептидов фильтруются с использованием ALC 80% и с коэффициентом ложного обнаружения (FDR) 1% с использованием программного обеспечения для анализа протеомики LC-MS / MS. 5. Визуализация данных иммунопептидомики ПРИМЕЧАНИЕ: Качество данных об иммунопептидомике, генерируемых РС, может быть оценено несколькими способами, как недавно описано22,23. Для визуализации данных и оценки их общего качества, состава и специфичности MHC можно использовать программный инструмент MhcVizPipe (MVP). Следуйте всем инструкциям и соответствующей документации для установки и запуска программного обеспечения MVP, доступного на веб-сайте Caron Lab GitHub24.ПРИМЕЧАНИЕ: MVP обеспечивает быстрое и консолидированное представление о качестве образца, составе и специфичности MHC. MVP распараллеливает использование хорошо зарекомендовавших себя алгоритмов иммунопептидомики (NetMHCpan25, NetMHCIIpan26 и GibbsCluster27) и генерирует организованные и простые для понимания отчеты в формате HTML (HyperText Markup Language). Отчеты полностью портативны и могут быть просмотрены на любом компьютере с современным веб-браузером. Примеры HTML-отчетов см. в разделе Дополнительные данные 1–4.

Representative Results

Общий рабочий процесс выделения MHC-пептидных комплексов для анализа иммунопептидомов РС проиллюстрирован на рисунке 1. Показаны репрезентативные результаты для верификации бусиносвязывающей эффективности антитела (фиг.2) (с использованием антитела Y3 против H2Kb) и эффективности элюирования MHC-пептидных комплексов из шариков (фиг.3) (с использованием антитела W6/32 анти-HLA-ABC). Количественные анализы на основе проточной цитометрии21 также применялись для измерения абсолютного числа молекул класса I MHC на клетку EL4 (H2Kb и H2Db) и клетку JY (HLA-ABC), как показано на рисунке 4A. Внутри- и межиндивидуальная воспроизводимость результатов с использованием текущего протокола показана на рисунке 4B-E. Репрезентативные результаты показаны для пептидов MHC класса I, идентифицированных из 1 x 108 клеток EL4 и 1 x 108 JY-клеток. Результаты были получены от двух разных членов лаборатории (Пользователь 1 и Пользователь 2). Для Пользователя 1 среднее число MHCI-специфических пептидов, обнаруженных из клеток EL4 и JY, составило 1341 и 6361 соответственно; для пользователя 2, 1933 и 7238, соответственно (рисунок 4B,D). Средний коэффициент вариации (CV) для числа пептидов, обнаруженных в трех различных биологических репликатах/экспериментах, варьируется от 1,9% до 11% (рисунок 4B,D). Хотя резюме по количеству пептидов, обнаруженных в трех различных экспериментах, были относительно небольшими, идентичность пептидов значительно варьировалась (рисунок 4C, E). Действительно, репрезентативные диаграммы Венна показывают, что доля пептидов, которые были воспроизводимо обнаружены в трех биологических репликатах, варьировалась от 39% (клетки пользователя 2, EL4) до 63% (пользователь 1, клетки JY) (рисунок 4C, E и дополнительная таблица 2). Тепловые карты, сгенерированные программным обеспечением MVP, показывают предсказанную силу связывания MHC идентифицированных пептидов с использованием инструментов пакета NetMHCpan25,26,28. Два варианта процедуры GibbsCluster, которые называются «Unsupervised GibbsCluster» и «Allele-Specific GibbsCluster», также выполняются MVP для извлечения пептид-связывающих мотивов MHC. Обратите внимание, что MVP имеет ограничения; его основная цель состоит не в том, чтобы извлекать аллель-специфические мотивы и аннотировать пептиды высокоточным образом, а скорее в том, чтобы обеспечить взгляд с высоты птичьего полета на общее качество, состав и специфичность MHC образцов. Для мышиных пептидов MHC класса I (H2Db и H2Kb) в клетках EL4 (рисунок 5A; верхние панели и дополнительные данные 1) репрезентативная тепловая карта показывает, что 89% всех обнаруженных 8-12-мерных пептидов, по прогнозам, являются сильными связующими (SB: NetMHCpan % Rank <0,5) или слабыми связующими (WB: NetMHCpan % Rank <2) для молекул H2Db или H2Kb. Кластеры последовательностей, полученные из 8-12-мерных пептидов, согласуются с зарегистрированными логотипами для H2Db (аспарагин в P5 и лейцин в P9) и H2Kb (фенилаланин в P5 и лейцин в P8) (рисунок 5)29. Стоит отметить, что третий доминирующий мотив (гистидин в P7 и лейцин в P9), а также дополнительные «артефактные» мотивы можно наблюдать с использованием антитела M1 (Дополнительные данные 1). Фактически, известно, что антитело M1 перекрестно реагирует с неклассической молекулой Qa2, и, следовательно, Qa2-ассоциированные пептиды также обнаруживаются MS (Дополнительные данные 1). Здесь, для простоты, рисунок 5 фокусируется на отображении хорошо зарекомендовавших себя мотивов связывания пептидов для двух классических аллелей H2b (т.е. H2Db или H2Kb), экспрессируемых в клетках EL4. Для пептидов HLA класса I (HLA-ABC) человека в клетках JY (рисунок 5A; нижние панели и дополнительные данные 2) репрезентативная тепловая карта показывает, что 97% всех обнаруженных 8-12-мерных пептидов, по прогнозам, будут SB или WB для HLA-A*0201, -B*0702 или -C*0702. Пептиды были сгруппированы для визуализации мотивов связывания пептидов для HLA-A*0201 и -B*0702. Мотив связывания для HLA-C*0702 не показан на рисунке 5A, поскольку аллель C*0702 имеет относительно низкий уровень экспрессии. Поэтому было выделено слишком мало пептидов C*0702 и идентифицировано для получения репрезентативного мотива C*0702. Обратите внимание, что мотив C*0702 может быть визуализирован в других исследованиях30,31,32 или с веб-сайта NetMHCpan 4.1 Motif Viewer33. Для пептидов HLA класса II (HLA-DR) человека в клетках JY (рисунок 5B; верхние панели и дополнительные данные S3) репрезентативная тепловая карта показывает, что 70% всех обнаруженных 9-22-мерных пептидов, по прогнозам, будут SB или WB для HLA-DRB1 * 0404 и -DRB1 * 1301. Показаны мотивы связывания пептидов для этих двух аллелей (рисунок 5B). Обратите внимание, что пептидсвязывающие мотивы, показанные здесь, могут не полностью соответствовать недавно опубликованным логотипам HLA-DRB1 * 0404 и -DRB1 * 130134. Это несоответствие подчеркивает текущую неспособность MVP/NetMHCpan точно аннотировать пептиды к аллелям класса II HLA, которые менее характерны, таким как HLA-DRB1*0404 и -DRB1*1301, экспрессируемым в клетках JY. Дополнительную информацию о мотивах связывания пептидов класса II можно найти в других исследованиях34,35 и на веб-сайте NetMHCIIpan 4.0 Motif Viewer36. Наконец, для мышиных пептидов MHC класса II (H2-IAD и H2-IED) в клетках A20 (рисунок 5B; нижние панели и дополнительные данные 4) репрезентативная тепловая карта показывает, что 87% всех обнаруженных 9-22-мерных пептидов, по прогнозам, будут SB или WB для H2-IAD или H2-IED. Мотивы связывания пептидов для этих двух аллелей согласуются с зарегистрированными логотипами37. Полные HTML-отчеты, сгенерированные программным обеспечением MVP для оценки общего качества и MHC-специфичности образцов, доступны в Дополнительных данных 1-4. Рисунок 1: Схема полной процедуры выделения пептидов MHC класса I и II. (A-B)100 миллионов клеток гранулируются и лизируются с 0,5% буфером Chaps. (C) Клеточный лизат центрифугируют, а супернатант добавляют к шарикам CNBr-сефарозы, соединенным с желаемым антителом заранее и (D) инкубируют 14-18 ч при 4°C. (E) После иммунозахвата шарики переносят в полипропиленовую колонку и промывают, а комплексы MHC-пептидов элюируют 1% раствором TFA. (F) Пептиды обессоливаются и элюируются с помощью колонки C18. (G) Впоследствии пептиды высушиваются со скоростью вакуума и анализируются с помощью тандемной масс-спектрометрии. (H) Качество изолированных пептидов MHC класса I и II может быть оценено на основе подтипов HLA с использованием свободно доступного программного обеспечения MhcVizPipe. Рисунок создан с помощью BioRender.com (NT22ZL8QSL). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Окрашивание геля Coomassie для отслеживания эффективности связывания антител с сефарозными БУСИНАМИ, активированными CNBr. Аликвоты эквивалентных объемов загружали на 12% гель SDS-PAGE с последующим окрашиванием синим цветом Coomassie: шарики + предварительное соединение антител (1), несвязанное антитело после стадии соединения (2), супернатант после последней промывки после сцепления (3) и шарики в сочетании с антителом (4). Эффективность связывания иллюстрируется значительным снижением интенсивности окрашивания сигнала легких и тяжелых цепей H2Kb при ковалентной связке бусин (полоса 4) с шариками CNBr по сравнению с антителом перед соединением (полоса 1). Рисунок был перепечатан и адаптирован из bioRxiv38. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Вестерн-блоттинг для отслеживания MHC-пептидных комплексов после кислотного элюирования из связанных с антителами CNBr-активированных шариков. Аликвоты, взятые из шагов, указанных в протоколе (1/100 от общего измеренного объема), загружали на 12% гель SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану: шарики + лизат после иммунозахвата и последней промывки (А); супернатант последней промывки (В) и MHC-пептидных комплексов, элюированных из шариков (С). Сильный сигнал обнаружения MHC-пептидных комплексов в (C) с использованием анти-HLA-ABC тяжелоцепочечных антител (Abcam, #ab 70328, 1:5000) подтвердил выделение MHC-пептидных комплексов после кислотного элюирования. Обратите внимание, что можно оценить долю MHC-пептидных комплексов, которые не были захвачены бусинами, связанными с антителами, путем сбора проточного потока с этапа 3.1.6. К вестерн-блоту можно добавить аликвоту (не показана на этом геле). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Идентификация пептидов MHC класса I из клеток JY и EL4. (A) Гистограмма, показывающая абсолютное число молекул H2Db и H2Kb поверхности клетки на клетку EL4 и молекул HLA-ABC на клетку JY. Количественную оценку проводили методом проточной цитометрии. Средняя и стандартная погрешность среднего значения были получены из трех биологических реплик. (В, Г) Гистограмма, показывающая среднее число и стандартное отклонение среднего значения пептидов MHC класса I, идентифицированных двумя независимыми пользователями (USER_1 [U1] и USER_2 [U2]). Показано среднее число и стандартное отклонение среднего значения пептидов MHC класса I, обнаруженных в клетках EL4 мыши (B) и клетках JY человека (D). Указаны коэффициенты вариации (CV) по трем независимым биологическим репликатам. (С, Е) Диаграммы Венна, показывающие количество пептидов, которые были воспроизводимо обнаружены в клетках EL4 (C) и JY (E) двумя независимыми пользователями (U1 и U2) в трех независимых биологических репликатах. Рисунок 4A был перепечатан и адаптирован из bioRxiv38. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Визуализация данных иммунопептидомики с помощью программного инструмента MVP. Анализ данных мышиных и человеческих (A) пептидов MHC класса I и (B) MHC класса II. Показаны репрезентативные тепловые карты сходства связывания (левые панели) и мотивы связывания пептидов (правые панели). Цвета тепловых карт представляют сродство привязки MHC, предсказанное NetMHCpan 4.1 (%rank). Сильные связующие красные (%ранг <0,5), слабые связующие синие (%ранг 2). В скобках указана доля (%) 8-12мерных пептидов (А) и 9-22мерных пептидов (В), являющихся SB или WB. Мотивы связывания пептидов были сгенерированы MVP с использованием опции «Аллель-специфический Gibbscluster». Эти репрезентативные результаты были получены из 1 х 108 клеток и с использованием следующих антител и клеточных линий: антитела M1 и клетки EL4 для мышиных пептидов MHC класса I; W6/32 антитела и JY-клетки для пептидов MHC класса I человека; Антитела M5 и клетки A20 для мышиных пептидов MHC класса II; Антитела L243 и клетки JY для пептидов MHC класса II человека. Обратитесь к Дополнительным данным 1-4 для доступа к полным HTML-отчетам, созданным программным обеспечением MVP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Дополнительные данные 1-4: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительные данные 1: HTML-отчет, сгенерированный программным обеспечением MVP из пептидов, которые были выделены из 1 x 108 КЛЕТОКEL4 с использованием антитела M1. Показаны три биологические реплики. Этот отчет связан с рисунками 4 и 5, а репрезентативные пептиды перечислены в дополнительной таблице 2. Дополнительные данные 2: HTML-отчет, сгенерированный программным обеспечением MVP из пептидов, которые были выделены из 1 x 108JY клеток с использованием антитела W6/32. Показаны три биологические пластинки. Этот отчет связан с рисунком 4 и рисунком 5, а репрезентативные пептиды перечислены в дополнительной таблице 2. Дополнительные данные 3: HTML-отчет, сгенерированный программным обеспечением MVP из пептидов, которые были выделены из 1 x 108JY клеток с использованием антитела L243. Этот отчет связан с рисунком 5, а репрезентативные пептиды перечислены в дополнительной таблице 2. Дополнительные данные 4: HTML-отчет, сгенерированный программным обеспечением MVP из пептидов, которые были выделены из 1 x 108A20 клеток с использованием антитела M5. Этот отчет связан с рисунком 5, а репрезентативные пептиды перечислены в дополнительной таблице 2. Дополнительная таблица 1: Список буферов. Описаны рецепты для всех буферов, используемых в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу. Дополнительная таблица 2: Репрезентативные перечни пептидов, связанных с H2Db/Kb, HLA-ABC, HLA-DR и H2-IAD/IED. Эта таблица содержит списки репрезентативных пептидов MHC класса I и II, выделенных из клеточных линий EL4 и A20 мыши, соответственно, и HLA классов I и II из клеточной линии JY человека. Эти данные были депонированы на ProteomeXchange (PXD028633). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу. ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ: Наборы данных, используемые в этой рукописи, были депонированы на ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset): PXD028633.

Discussion

Две клеточные линии мышей (EL4 и A20), одна клеточная линия человека (JY) и пять коммерчески доступных антител [M1 (анти-H2Db / Kb), Y3 (анти-H2Kb), M5 (анти-H2-IAD / IED), W6/32 (анти-HLA-ABC) и L243 (анти-HLA-DR)] были протестированы и проверены в контексте этого протокола и предоставили высококачественные данные иммунопептидомики. Другие анти-HLA антитела доступны (например, анти-HLA-A2 BB7.2), но не были протестированы здесь. Обратите внимание, что антитело W6/32 широко используется и является наиболее признанным антителом в этой области; он позволяет выделять пептиды, представленные всеми молекулами HLA-ABC в организме человека и ранее сообщалось экспертными лабораториями, для работы из различных биологических источников, таких как свежие или замороженные ткани8,39, мононуклеарные клетки периферической крови и мононуклеарные клетки костного мозга40, биопсии41, ксенотрансплантаты41,42, вскрытия43 и образцы плазмы44,45.

Приготовление свежих растворов, которые используются на протяжении всего протокола, имеет решающее значение. В частности, использование свежих кислых растворов в стеклянных бутылках имеет решающее значение для предотвращения последующего загрязнения образцов, проанализированных РС. Кроме того, когда протокол делается в первый раз и / или с новым антителом, важно оценить, что антитело действительно связано с шариками CNBr Sepharose с использованием синего геля Coomassie. Этапы промывки шариков, связанных с антителами, после иммунозахвата MHC-пептидных комплексов также имеют решающее значение для предотвращения загрязнения пептидов, не связанных с MHC. Наконец, требуется особая осторожность, чтобы не выбрасывать элюаты после элюирования MHC-пептидных комплексов с 1% TFA и элюирования пептидов из колонки C18 с ACN28%/0,1% FA.

Существующие протоколы, доступные в литературе, описывают дополнительные этапы дальнейшей очистки пептидов в конце процедуры выделения, например, фракционирование пептидов различными методами14,46 или ультрафильтрацию с использованием фильтров 10-30 кДа13,47. Текущий протокол не содержит подробной информации об этих дополнительных шагах и является достаточным для предоставления высококачественных данных об иммунопептидомике. Однако такие шаги могут быть рассмотрены неспециалистами для модификации и устранения неполадок для дальнейшей оптимизации процедуры выделения пептидов.

Тип бусин и тип кислотного элюционного буфера, которые используются для элюирования MHC-комплексов из бусин, также могут быть изменены для устранения неполадок13,14,15,16,17,18,19. В этом отношении сефарозные CNBr-активированные шарики, как правило, являются хорошей отправной точкой, поскольку они относительно недороги в дополнение к тому, чтобы проявлять гибкость с точки зрения связывания с различными типами антител. В текущем протоколе было показано, что сефарозные CNBr-активированные шарики относительно хорошо работают с использованием пяти различных коммерчески доступных антител (т.е. M1, Y3, W6/32, L243 и M5). Помимо бусин, активированных сефарозой CNBr, бусины Fast Flow с белком A или G или A / G sepharose 4 также просты в обращении и, хотя относительно дороже, могут генерировать аналогичные результаты. Другим фактором, который следует учитывать, является сродство антитела к белку A или G. Кроме того, магнитные бусины сефарозы также очень просты в использовании, но относительно дороги. Независимо от типа бусин, выбранных неспециалистами, рекомендуется собирать аликвоты на критических этапах протокола и выполнять синие гели SDS-PAGE, окрашенные Кумасси, для отслеживания эффективности связывания антитела с бусинами, как показано на рисунке 2.

Другим важным фактором, влияющим на успешность выделения пептидов MHC, является тип буфера кислотного элюирования, используемого для выделения MHC-пептидных комплексов из шариков. Сообщалось о различных буферах, включая 0,1%, 1% или 10% TFA, 0,2% FA и 10% уксусной кислоты. 1% TFA был буфером элюирования, работающим для всех протестированных антител. Этот шаг также может быть прослежен путем западного блоттинга против молекул MHC, используемых для захвата пептидов MHC, как показано на рисунке 3.

Все буферы, содержащие ацетонитрил (ACN) и/или трифторуксусную кислоту (TFA), являются агрессивными и могут привести к загрязнению образца мелкими молекулярными и полимерными веществами, такими как пластификаторы, при контакте с пластиком. Чтобы избежать таких проблем, все растворы, содержащие органический растворитель и / или TFA, ежедневно готовят в свежем виде и хранят в стеклянной бутылке до использования. Большинство шагов выполняются в пластиковой трубке Protein LoBind. Эти трубки специально разработаны для протеомики и изготовлены из первичного полипропилена высочайшего качества, без биоцидов, пластификаторов и латекса. Они также производятся с оптимизированными, высоко отполированными формами без использования скользящих агентов. Эти меры предосторожности важно учитывать, чтобы обеспечить получение высококачественных данных об иммунопептидомике.

Антитело является важным ограничением для выделения пептидов, связанных с MHC. Антитело W6/32 позволяет выделять пептиды, представленные всеми молекулами класса I HLA-ABC у людей, и является наиболее широко используемым и установленным антителом в этой области. HLA-типирование высокого разрешения нехарактеризованных клеточных линий человека или биообразцов не является необходимостью при применении антитела W6/32, но, тем не менее, рекомендуется для определенных применений для облегчения интерпретации данных48. Информацию о типизации HLA/MHC также можно найти в общедоступных ресурсах для нескольких клеточных линий и моделей мыши49. Помимо антитела W6/32, все четыре других антитела (M1, M5, Y3 и L243), которые были протестированы и валидированы в контексте этого протокола, являются коммерчески доступными. С другой стороны, многие другие антитела, о которых сообщалось в предыдущих исследованиях иммунопептидомики, не были в значительной степени приняты сообществом и не являются коммерчески доступными или доступны через культуру клеточных линий гибридомы, что является относительно дорогим.

Другим важным ограничением для выделения пептидов, связанных с MHC, является количество необходимого исходного материала. Требуемое количество обратно пропорционально уровню экспрессии молекул MHC на поверхности клетки, который может быть количественно определен с помощью проточной цитометрии (рисунок 4A). Клетки, демонстрирующие высокие уровни экспрессии молекул MHC (например, дендритные клетки и кроветворные клетки в целом), как правило, дают высококачественные данные иммунопептидомики. Экспертные лаборатории используют от 50 миллионов клеток50, но от 100 миллионов до 1 миллиарда клеток рекомендуются для неспециалистов. Также сообщалось об использовании образцов биопсии тканей (<13 мг)41, ксенотрансплантата42,43, вскрытия44 и плазмы45,46, но они остаются сложными для неэкспертных лабораторий. Кроме того, общее количество ожидаемых пептидов, связанных с MHC, хорошо документировано для установленных клеточных линий (здесь от ~ 2000 до ~ 10000 пептидов в зависимости от используемой клеточной линии и антител), но абсолютное количество естественно представленных пептидов, которые эффективно удаляются методом, остаются спорными. Действительно, предыдущие исследования показали, что эффективность процедуры выделения зависит от пептидов и может составлять от 0,5% до 2%51. Другими ограничениями в иммунопептидомике являются воспроизводимость методов и неспособность инструментов набора NetMHCpan правильно аннотировать пептиды к аллелям MHC, которые менее характерны. В связи с этим продолжается разработка и применение относительно новых данных-независимых методов сбора МС7,32,52, а также новых алгоритмов прогнозирования кластеризации пептидов и связывания пептидов MHC31,34,53,54 ожидается улучшение воспроизводимости и точности пептидной аннотации в иммунопептидомике. Иммунопептидомика сталкивается с другими ограничениями в отношении получения РС и вычислительного анализа пептидов, связанных с MHC, и охватывается в других местах1,6,55.

Если выделение HLA-ABC-ассоциированных пептидов из образцов человека с использованием антитела W6/32 хорошо установлено и широко применяется многими исследовательскими группами, выделение мышиных пептидов MHC класса I и II относительно менее установлено. Следовательно, необходимы надежные протоколы для выделения лигандов MHC мыши. Здесь мы предоставляем протокол, оптимизированный для выделения пептидов MHC класса I и пептидов MHC класса II из двух клеточных линий мыши происхождения C57BL/6 и BALB/c соответственно. В частности, протокол позволяет выделять H2Kb- и H2Db-ассоциированные пептиды класса I с использованием антитела M1, а также пептиды класса II H2-IAD и H2-IED-ассоциированные пептиды с использованием антитела M5. Таким образом, распространение и применение текущего протокола должно облегчить фундаментальные и трансляционные исследования иммунопептидомики на различных мышиных моделях.

Протокол может быть использован для создания и стандартизации рабочего процесса иммунопептидомики, а также для сравнения новых протоколов. Например, он может быть адаптирован и дополнительно оптимизирован для проведения скрининга иммунопептидомики в различных биологических матрицах, начиная от крови / плазмы до свежих или замороженных тканей до FFPE (формалин-фиксированный парафин-embedded). Кроме того, протокол будет способствовать внутри- и межлабораторной воспроизводимости процедуры пробоподготовки при иммунопептидомике и, следовательно, как ожидается, найдет широкое применение в фундаментальных и клинических исследованиях.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Пьера Тибо, Эрика Боннейля, Жоэля Лануа, Каролин Коте (Институт исследований в области иммунологии и рака, Монреальский университет) и Энтони Перселла (Университет Монаша) за их проницательные комментарии. Эта работа была поддержана финансированием Фонда исследований Квебека – Санте (FRQS), Фонда Коула, CHU Sainte-Justine и Фонда Шарля-Бруно, Канадского фонда инноваций, Национального совета по наукам и инженерным исследованиям (NSERC) (#RGPIN-2020-05232) и Канадских институтов исследований в области здравоохранения (CIHR) (#174924).

Materials

A20 cell line ATCC TIB-208 mouse B lymphoblast
Acetonitrile, LC/MS Grade FisherScientific A955-4
anti-Human HLA A, B, C (W6/32) – MHC class I BioXcell BE0079
anti-Human/Monkey HLA-DR (L243) – MHC class II BioXcell BE0308
anti-Mouse H2 (M1/42.3.9.8) – MHC class I BioXcell BE0077
anti-Mouse H2-IAd/IEd (M5/114) – MHC class II BioXcell BE00108
anti-Mouse H2Kb (Y3) – MHC class I BioXcell BE0172
BupH Phosphate Buffered Saline Packs (PBS) ThermoFisher 28372 Pouch contents dissolved in a final volume of 500 mL deionized water (FisherScientific, W64)
CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate) EMDMilipore 220201-10MG
CNBr-activated Sepharose Cytivia # 17-0430-01
EL4 cell line ATCC TIB-39 mouse T lymphoblast
epTIPS LoRetention Tips, 1000 µL/Eppendorf FisherScientific 02-717-352 Better results with low retention material
epTIPS LoRetention Tips, 200 µL/Eppendorf FisherScientific 02-717-351 Better results with low retention material
Formic Acid, LC/MS Grade FisherScientific A117-50
Glycine FisherScientific RDCG0250500
Hydrochloric acid solution FisherScientific 60-007-11
JY cell line Sigma Aldrich 94022533-1VL EBV-immortalised B cell lymphoblastoid line
Methanol, LC/MS Grade FisherScientific A456-4
Poly prep chromatography columns (polypropylene column) Bio-Rad 731-1550 referred as polypropylene column in the protocol
Proteases inhibitor ThermoFisher A32963 1 pellet per 10 mL of cell lysis buffer
Qifikit Dako K007811-8
Sodium Bicarbonate Amresco # 0865-1kg
Sodium Chloride FisherScientific MSX04201
Solid phase extraction disk, ultramicrospin column C18 The nest group SEMSS18V capacity of 6–60 µg, max volume of 200 µL
Trifluoroacetic Acid (TFA), LC-MS Grade FisherScientific PI85183
Tris FisherScientific T395-500
Tris-HCl FisherScientific #10812846001
Tube LoBind 1.5 mL/Eppendorf FisherScientific E925000090 Better results with low retention material
Tube LoBind 2 mL/Eppendorf FisherScientific 13-698-795 Better results with low retention material
Water, LC/MS Grade FisherScientific W64
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vizcaíno, J. A., et al. The human immunopeptidome project: A roadmap to predict and treat immune diseases. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (1), 31-49 (2019).
  2. Caron, E., Aebersold, R., Banaei-Esfahani, A., Chong, C., Bassani-Sternberg, M. A case for a human immuno-peptidome project consortium. Immunity. 47 (2), 203-208 (2017).
  3. Arnaud, M., Duchamp, M., Bobisse, S., Renaud, P., Coukos, G., Harari, A. Biotechnologies to tackle the challenge of neoantigen identification. Current Opinion in Biotechnology. 65, 52-59 (2020).
  4. Caron, E., et al. The MHC I immunopeptidome conveys to the cell surface an integrative view of cellular regulation. Molecular Systems Biology. 7 (1), 533 (2011).
  5. Istrail, S., et al. Comparative immunopeptidomics of humans and their pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13268-13272 (2004).
  6. Caron, E., Kowalewski, D. J., Koh, C. C., Sturm, T., Schuster, H., Aebersold, R. Analysis of major histocompatibility complex (MHC) immunopeptidomes using mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (12), 3105-3117 (2015).
  7. Caron, E., et al. An open-source computational and data resource to analyze digital maps of immunopeptidomes. eLife. 4, 07661 (2015).
  8. Bassani-Sternberg, M., et al. Direct identification of clinically relevant neoepitopes presented on native human melanoma tissue by mass spectrometry. Nature Communications. 7 (1), 13404 (2016).
  9. Gubin, M. M., et al. Checkpoint blockade cancer immunotherapy targets tumour-specific mutant antigens. Nature. 515 (7528), 577 (2014).
  10. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572-576 (2015).
  11. Laumont, C. M., et al. Noncoding regions are the main source of targetable tumor-specific antigens. Science Translational Medicine. 10 (470), 5516 (2018).
  12. Lill, J. R., et al. Minimal information about an immuno-peptidomics experiment (MIAIPE). Proteomics. 18 (12), 1800110 (2018).
  13. Nelde, A., Kowalewski, D. J., Stevanović, S. Antigen processing, methods and protocols. Methods in molecular biology. 1988, 123-136 (2019).
  14. Purcell, A. W., Ramarathinam, S. H., Ternette, N. Mass spectrometry-based identification of MHC-bound peptides for immunopeptidomics. Nature Protocols. 14 (6), 1687-1707 (2019).
  15. Ebrahimi-Nik, H., et al. Mass spectrometry driven exploration reveals nuances of neoepitope-driven tumor rejection. JCI Insight. 5 (14), 129152 (2019).
  16. Schuster, H., et al. A tissue-based draft map of the murine MHC class I immunopeptidome. Scientific Data. 5, 180157 (2018).
  17. Ritz, D., Gloger, A., Weide, B., Garbe, C., Neri, D., Fugmann, T. High-sensitivity HLA class I peptidome analysis enables a precise definition of peptide motifs and the identification of peptides from cell lines and patients sera. PROTEOMICS. 16 (10), 1570-1580 (2016).
  18. Bassani-Sternberg, M. Mass spectrometry based immunopeptidomics for the discovery of cancer neoantigens. Methods Mol Biol. 1719, 209-221 (2018).
  19. Lanoix, J., et al. Comparison of the MHC I Immunopeptidome Repertoire of B-Cell Lymphoblasts Using Two Isolation Methods. Proteomics. 18 (12), 1700251 (2018).
  20. Kuznetsov, A., Voronina, A., Govorun, V., Arapidi, G. Critical review of existing MHC I immunopeptidome isolation methods. Molecules. 25 (22), 5409 (2020).
  21. Urlaub, D., Watzl, C. Coated latex beads as artificial cells for quantitative investigations of receptor/ligand interactions. Current Protocols in Immunology. 131 (1), 111 (2020).
  22. Ghosh, M., et al. Guidance document: Validation of a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry immunopeptidomics assay for the identification of HLA class I ligands suitable for pharmaceutical therapies*. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (3), 432-443 (2020).
  23. Fritsche, J., et al. Pitfalls in HLA ligandomics – How to catch a li(e)gand. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100110 (2021).
  24. Caron Lab. GitHub Available from: https://github.com/CaronLab/MhcVizPipe (2021)
  25. Jurtz, V., Paul, S., Andreatta, M., Marcatili, P., Peters, B., Nielsen, M. NetMHCpan-4.0: Improved peptide-MHC Class I interaction predictions integrating eluted ligand and peptide binding affinity data. The Journal of Immunology. 199 (9), 3360-3368 (2017).
  26. Reynisson, B., Alvarez, B., Paul, S., Peters, B., Nielsen, M. NetMHCpan-4.1 and NetMHCIIpan-4.0: improved predictions of MHC antigen presentation by concurrent motif deconvolution and integration of MS MHC eluted ligand data. Nucleic Acids Research. 48, 449-454 (2020).
  27. Andreatta, M., Alvarez, B., Nielsen, M. GibbsCluster: unsupervised clustering and alignment of peptide sequences. Nucleic Acids Research. 45 (1), 458-463 (2017).
  28. Nielsen, M., et al. NetMHCpan, a method for quantitative predictions of peptide binding to any HLA-A and -B Locus protein of known sequence. PLoS ONE. 2 (8), 796 (2007).
  29. Fortier, M. -. H., et al. The MHC class I peptide repertoire is molded by the transcriptome. The Journal of Experimental Medicine. 205 (3), 595-610 (2008).
  30. Marco, M. D., Schuster, H., Backert, L., Ghosh, M., Rammensee, H. -. G., Stevanovic, S. Unveiling the peptide motifs of HLA-C and HLA-G from naturally presented peptides and generation of binding prediction matrices. The Journal of Immunology. 199 (8), 2639-2651 (2017).
  31. Sarkizova, S., et al. A large peptidome dataset improves HLA class I epitope prediction across most of the human population. Nature Biotechnology. 38 (2), 199-209 (2019).
  32. Pak, H., et al. . Sensitive immunopeptidomics by leveraging available large-scale multi-HLA spectral libraries, data-independent acquisition and MS/MS prediction. 20, 100080 (2021).
  33. Racle, J., et al. Robust prediction of HLA class II epitopes by deep motif deconvolution of immunopeptidomes. Nature Biotechnology. 37 (11), 1283-1286 (2019).
  34. Abelin, J. G., et al. Defining HLA-II ligand processing and binding rules with mass spectrometry enhances cancer epitope prediction. Immunity. 51 (4), 766-779 (2019).
  35. Sofron, A., Ritz, D., Neri, D., Fugmann, T. High-resolution analysis of the murine MHC class II immunopeptidome. European Journal of Immunology. 46 (2), 319-328 (2015).
  36. Kovalchik, K. A., et al. Immunopeptidomics for Dummies: Detailed Experimental Protocols and Rapid, User-Friendly Visualization of MHC I and II Ligand Datasets with MhcVizPipe. bioRxiv. , (2020).
  37. Schuster, H., et al. The immunopeptidomic landscape of ovarian carcinomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 9942-9951 (2017).
  38. Berlin, C., et al. Mapping the HLA ligandome landscape of acute myeloid leukemia: a targeted approach toward peptide-based immunotherapy. Leukemia. 29 (3), 1-13 (2014).
  39. Rijensky, N. M., et al. Identification of tumor antigens in the HLA peptidome of patient-derived xenograft tumors in mouse. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (8), 1360-1374 (2020).
  40. Heather, J. M., et al. Murine xenograft bioreactors for human immunopeptidome discovery. Scientific Reports. 9 (1), 18558 (2019).
  41. Marcu, A., et al. HLA ligand atlas: A benign reference of HLA-presented peptides to improve T-cell-based cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (4), 002071 (2021).
  42. Shraibman, B., et al. Identification of tumor antigens among the HLA peptidomes of glioblastoma tumors and plasma. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (6), 1255-1268 (2019).
  43. Bassani-Sternberg, M., Barnea, E., Beer, I., Avivi, I., Katz, T., Admon, A. Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (44), 18769-18776 (2010).
  44. Demmers, L. C., Heck, A. J. R., Wu, W. Pre-fractionation extends, but also creates a bias in the detectable HLA class Ι ligandome. Journal of Proteome Research. 18 (4), 1634-1643 (2019).
  45. Kowalewski, D. J., Stevanović, S. Antigen processing,. Methods and Protocols. 960, 145-157 (2013).
  46. Bentley, G., et al. High-resolution, high-throughput HLA genotyping by next-generation sequencing. Tissue Antigens. 74 (5), 393-403 (2009).
  47. Boegel, S., Löwer, M., Bukur, T., Sahin, U., Castle, J. C. A catalog of HLA type, HLA expression, and neo-epitope candidates in human cancer cell lines. OncoImmunology. 3 (8), 954893 (2014).
  48. Klaeger, S., et al. Optimized liquid and gas phase fractionation increases HLA-peptidome coverage for primary cell and tissue samples. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100133 (2021).
  49. Hassan, C., et al. Accurate quantitation of MHC-bound peptides by application of isotopically labeled peptide MHC complexes. Journal of Proteomics. 109, 240-244 (2014).
  50. Ritz, D., Kinzi, J., Neri, D., Fugmann, T. Data-independent acquisition of HLA Class I peptidomes on the Q exactive mass spectrometer platform. Proteomics. 17 (19), (2017).
  51. O’Donnell, T. J., Rubinsteyn, A., Laserson, U. MHCflurry 2.0: Improved pan-allele prediction of MHC Class I-presented peptides by incorporating antigen processing. Cell Systems. 11 (1), 42-48 (2020).
  52. O’Donnell, T. J., Rubinsteyn, A., Bonsack, M., Riemer, A. B., Laserson, U., Hammerbacher, J. MHCflurry: Open-source Class I MHC binding affinity prediction. Cell Systems. 7 (1), 129-132 (2018).
  53. Faridi, P., Purcell, A. W., Croft, N. P. In immunopeptidomics we need a sniper instead of a shotgun. Proteomics. 18 (12), 1700464 (2018).

Tags

ImmunopeptidomicsMHC Class IMHC Class IIPeptide IsolationMass SpectrometryHumanMouseAutoimmune DiseasesCancerVirologySepharose BeadsAntibody CouplingBlockingWashingCell LysisPeptide Elution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sirois, I., Isabelle, M., Duquette, J. D., Saab, F., Caron, E. Immunopeptidomics: Isolation of Mouse and Human MHC Class I- and II-Associated Peptides for Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (176), e63052, doi:10.3791/63052 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image