免疫ペプチドミクス:マウスとヒトMHCクラスI-およびII関連ペプチドの分離による質量分析

ここで提供されるプロトコルは確立されたプロトコル13,14,15,16,17,18,19,20から適応された。MHCクラスIおよびIIペプチドの免疫親和性精製(IP)の全体的な手順を図1に示す。使用する細胞株と抗体の詳細については、資料表を参照してください。 1. 抗体と結合するビーズ(1日目):抗体をセファロースCNBr活性化ビーズに結合 注: 新しい実験ごとに新しいソリューションを準備します。試薬とソリューションのレシピのリストについては、 材料表 および 補足表1 を参照してください。すべてのステップは室温(RT)で行われる。新しい抗体を使用する場合は、キーアリコートを収集し(OPTIONALの指示を参照)、クーマシーブルー染色SDS-PAGE(図2)を行うことにより、結合効率を確認してください。 セファロースCNBrビーズの活性化 セファローズCNBr活性ビーズの重量を80mg、15 mL円錐管に移します。 乾燥ビーズの再懸濁を容易にするために、まず、1 mM HClの5 mLとピペットを5回上下に加える。次に、1 mM HCl の追加 8.5 mL で円錐管を充填します。 ローテーターデバイスを使用してRTで30分間、20 rpm(1分あたりの回転数)で回転させます。200 x g で 200 g で 2 分間の遠心分離機 RT で 2 分間、吸引によって上清を除去します。 500 μL のカップリングバッファーをビーズペレットに加え、新しい 2.0 mL 遠心管に移し、ステップ 1.2.2 を維持します。 CNBr活性化ビーズへの抗体の結合 MHCクラスIまたはIIペプチドの単離のために選択した抗体を新しい2.0 mLマイクロ遠心分離管に2mgの抗体を加えて調製します(メーカーが指定した濃度に従います)。カップリングバッファー溶液で体積を 1 mL に完了し、2 mg/mL の最終濃度を得ます。 ステップ1.1.4から200 x g の2分間RTで2分間のビーズを遠心分離し、吸引によって上清を取り除きます。 活性化ビーズを含む2.0 mLマイクロ遠心分離管に抗体溶液を加えます。 (オプション)18 μL (INPUT) のアリコートを取り、6 μL の 4x SDS-PAGE バッファを追加し、すぐに凍結します。 回転装置を使用して、ステップ1.2.3から20rpmで120分間マイクロ遠心管を120分間回転させます。200 x g で 200 g でビーズを遠心分離し、上清を取り除きます。 (オプション)上清(非結合抗体)の18 μLのアリコートを取り、6 μLの4x SDS-PAGEバッファーを加え、すぐに凍結します。 抗体結合ビーズの遮断および洗浄 ステップ1.2.5から抗体結合ビーズを含むマイクロ遠心分離チューブに0.2 Mグリシンの1 mLを加えます。ローテーターデバイスを使用して、RTで60分間20rpmで回転させます。 200 x g でビーズを 2 分間遠心し、上清を取り除きます。PBS(リン酸緩衝生理食塩分)を1 mL加えます。 200 x g でビーズを 2 分間遠心し、上清を取り除きます。 (オプション)上清(非結合抗体、最後の洗浄)の18 μLのアリコートを取り、6 μLの4倍のSDS-PAGEバッファを加え、すぐに凍結します。 ステップ 1.3.3 のビーズに PBS の 1 mL を追加します。 (オプション)18 μL のビーズ混合物(ビーズと抗体を結合)のアリコートを取り、4x SDS-PAGE バッファーの 6 μL を加え、すぐに凍結します。 ステップ2.5で同じ日に使用するまで4°Cに保ちます。注:ビーズは免疫キャプチャの前日に準備することができますが、より長いストレージはテストされていません。 2. 抗体結合ビーズによる細胞のリシスと免疫の取り込み(1日目) 注:MHC分子のレベルは、ある細胞タイプによって異なり、細胞当たりのMHC/HLA分子の定量化が推奨される21(図4A)。IP ごとに、最低 1 x 108 個のセルを使用することをお勧めします。この細胞数は、JY、EL4、およびA20細胞から6〜10mgのタンパク質に相当し、0.5%のチャップスバッファーで可溶化した。IP用の細胞ペレットを調製するために、細胞を採取し、遠心し、5mLのPBSで2回洗浄する必要があります。次いで、細胞ペレットは、IPの時間まで-80°Cで1.5 mLマイクロ遠心チューブまたは15 mL円錐管に保存することができる。IP は、新鮮な収穫または凍結した細胞ペレットに対して実行できることに注意してください。 MHCクラスIまたはIIペプチドを単離するために、1 x 108 細胞の凍結ペレットを、手のひらでチューブの底部を温めることにより解凍する。500 μLのPBSをペレットに加え、ピペットを上下に加え、懸濁液が均質になるまで加えます。注:細胞の種類によって、細胞ペレットの容積は大きく異なる場合があります。500 μLのPBSが細胞ペレットを溶解するのに十分でない場合は、細胞が上下にピペッティングしながら容易に分解されるまで、より多くのPBSを使用してください。 PBSで再懸濁されたペレットの総体積を測定し、新しいチューブ2 mLマイクロ遠心チューブに移します。必要に応じて、より多くのチューブに分割します。 細胞溶菌緩衝液の体積(プロテアーゼ阻害剤を含有するPBS中の1%チャップスバッファー、1ペレット/10mLの緩衝液)を加え、前工程で測定したPBS中で再懸濁した細胞ペレットの体積と同等である。リシスバッファーの最終的な濃度は、チャップスの 0.5% です。 回転装置を使用して、4°Cで60分間10 rpmで回転させます。フルブレーキで4°Cで20分間18,000 x g で細胞リセートを遠心分離し、新しい2.0 mLマイクロ遠心チューブに上清(MHCペプチド複合体を含む)を移管します。 200 x g で 200 x g の遠心分離により、ステップ 1.3.7 から抗体結合ビーズを 2 分間回収し、上清を除去します。 ステップ2.4の細胞ライセート上清を抗体結合ビーズに移し、回転装置を使用して4°Cで14〜18時間(一晩)回転(10rpm)でインキュベートします。 3. MHCペプチドの溶出(2日目) 注:ポリプロピレンカラムは、カラムにビーズを保持しながら、MHCペプチド複合体の溶出を可能にします。1%TFA(トリフルオロ酢酸)と酸性溶出前後のビーズに結合したMHCペプチド複合体の割合を評価するために、プロトコル中に重要なステップで取られたアリコートを用いてウェスタンブロットを実行することができる(省略可能な指標を参照)。 図3 に示すウェスタンブロッティングは、1%TFAでの酸性溶出後のMHCペプチド複合体の濃縮を明らかにする。この分数にシグナルが存在しない場合、溶出ステップが成功しなかったということを示します。なお、ビーズに対する非結合MHCペプチド複合体の割合は、ステップ3.1.6に記載されたアリコートを用いたウェスタンブロッティングにより並行して評価することもできる。 抗体結合ビーズからのMHCペプチド複合体の溶出 ポリプロピレンカラムの底蓋を取り外し、カラムをポリプロピレンカラムラックの上に置き、その下に空の容器を取り付けて流れを通します。注: 1 つのサンプルにつき 1 列が必要です。 ポリプロピレンカラムを10 mLの緩衝Aでリンスし、重力で排水します。液溶出の流速が遅すぎる場合は、ポリプロピレンカラムの下端をさらに切る。 ステップ2.5からビーズ-ライセート混合物(〜2mL)を測定し、回収し、ポリプロピレンカラムに移します。 (オプション)ウェスタンブロッティングと凍結のための20 μL(または総体積から1/100)のアリコートを取ります。この画分は、ビーズと共にインキュベートされた全MHCペプチド複合体に相当する。 液体混合物を重力で溶かしましょう。 (オプション)フロースルーを収集して測定し、ウェスタンブロッティングと凍結のために20 μL(または全容量のうち1/100)のアリコートを取ります。この分数は、残留非結合MHCペプチド複合体を表す。 ビーズ-ライセート混合物を可能な限り回収するには、ステップ3.1.3から1mLのバッファーAでチューブをすすぎ、ポリプロピレンカラムに移します。 10 mLのバッファーAを加えて、ポリプロピレンカラムに保持されているビーズを洗浄します。洗浄バッファーを重力で溶かしましょう。 洗浄工程をバッファーBの10mL、バッファAの10mL、そして10mLの緩衝液Cで繰り返します。 ラックからポリプロピレンカラムを取り外し、新しい2.0 mLマイクロ遠心チューブの上部に置きます。柱とチューブを手で一緒に持ちます。 ポリプロピレンカラムに1%TFAの300 μLを加え、上下に5回ピペットしてビーズを混ぜます。注:ビーズはポリプロピレンカラムに保持され、MHC結合ペプチドは2.0 mLマイクロ遠心分離管で溶出します。 新しい2.0 mLマイクロ遠心チューブで溶出液を移します。ステップ3.1.11を繰り返し、2つの溶出液をプールします(MHCペプチド複合体を含む溶出液は合計600 μLに対応する必要があり、ステップ3.2.4で使用されます)。 (オプション)ウェスタンブロッティングと凍結のための6 μL(または総体積の1/100)のアリコートを収集します。この分数は、ビーズから溶出したMHCペプチド複合体に相当する。 MHCペプチドの脱塩と溶出注:MHCペプチドの脱塩と溶出ステップは、C18カラムを2.0 mLマイクロ遠心分離チューブに取り付けることによって行うことができます。より良い適合のために、C18カラムと2.0 mLマイクロ遠心チューブの間に製造業者が提供するアニールを取り付けます。このプロトコルでは、C18カラムが5~200 μL(6~60 μg)の容量で使用されます。すべてのステップはRTで行われます。 C18カラムの上に200μLのメタノールを加え、1546 x g で遠心分離機を3分間加えます。フロースルーを破棄します。 C18カラムの上に80N(アセトニトリル)/0.1%TFAの200 μLを加え、1546 x g で遠心分離機を3分間加えます。フロースルーを破棄します。 C18カラムの上に0.1%TFAの200 μLを加え、遠心分離機を1546 x g で3分間加えます。フロースルーを破棄します。 ステップ3.1.12からC18カラムの上にMHCペプチド複合体の200 μLをロードします。遠心分離機は1546 x g で3分間、流れを捨てます。 ボリューム全体がロードされるまで、ステップ 3.2.4 を 2 回繰り返します。なお、MHCペプチドはC18カラムに保持されている。 0.1%TFAの200 μLをC18カラムに加え、遠心分離機を1546 x g で3分間追加します。フロースルーを破棄します。 C18カラムを新しい2.0 mLマイクロ遠心分離チューブに移します。28N/0.1%TFAの150 μLを加えることによってC18カラムからMHCペプチドをエルテ。 遠心分離機 1546 x g で 3 分間 フロースルーを新しい1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移します。フロースルーを破棄しないように注意してください。それは、単離されたMHCクラスIまたはIIペプチドを含む。 合計体積450μLの場合は、ステップ3.2.7~3.2.9を2回繰り返します。 LC-MSMSでサンプルを分析するまで、450 μLの溶出液(精製MHCクラスIまたはIIペプチド)を-20 °Cで凍結します。 LC-MS/MS分析の前に、ステップ3.2.11から精製されたMHCクラスIまたはIIペプチドは、2時間45°Cの真空濃縮器、真空レベル:100 mTorrおよび真空ランプを使用して乾燥に蒸発する: 5.注:凍結したサンプルの蒸発は非常に効率的です。乾燥したペプチドは、分析まで再凍結することができる。 4. LC-MS/MSによるMHCクラスIおよびIIペプチドの同定 注:高性能オービトラップと高分解能の四重極時間質量分析計6を使用して、MHCクラスIおよびII免疫ペプチドームを分析します。以下の情報は、既存の様々なタンデム質量分析計装置が異なる運用基準に従って動作することを考慮して、唯一の指標として与えられる。手順の簡単な概要を以下に説明します。 乾燥したサンプル(ステップ3.2.12から)を4%のギ酸(FA)の50 μLで可溶化します。 各サンプルに16 μLの3回の注入をロードし、自家製の逆相カラム(150-μm i.d.×250 mm長、木星3 μm C18 300 Å)で、5%-30N-0.1の勾配と600 nL/min流量をナノフローUHPLCに接続したMSに接続したMSにロードします。 最大3秒の最大の120000の解像度で各完全なMSスペクトルを取得し、射出時間の自動モードとスペクトルを持つ4 x 105 のAGCを取得し、最大3秒の最も豊富な乗算前駆体イオンにタンデムMS(MS-MS)を使用してスペクトルを生成します。注: タンデム-MS実験は、衝突エネルギー 30%、分解率 30,000、AGC 1.5 x 105、射出時間 300 ms で高エネルギー衝突解離(HCD)を使用して行われます。 マウスおよびヒトデータベース(UniProtKB/Swiss-Prot(2019_09))を使用して、プロテオミクスLC-MS/MS解析ソフトウェア(PEAKS Xなど)を使用して、3つの注射/サンプルからのデータファイルを処理します。 酵素パラメータには「不特定酵素消化」を、前駆体イオンとフラグメントイオンの質量許容度としては10ppmと0.01 Daをそれぞれ選択します。注:可変的な変更は、脱アミド(NQ)および酸化(M)です。その他の検索パラメータはすべてデフォルト値です。最終的なペプチドリストは、プロテオミクスLC-MS/MS解析ソフトウェアを使用して、80%のALCと1%の偽発見率(FDR)を使用してフィルタリングされます。 5. 免疫ペプチドミクスデータの可視化 注:MSによって生成された免疫ペプチドミクスデータの品質は、最近説明したように、複数の方法で評価することができます22,23。データを視覚化し、その全体的な品質、組成、および MHC 特異性を評価するために、MhcVizPipe (MVP) ソフトウェア ツールを使用できます。 すべての手順と関連ドキュメントに従って、Caron Lab GitHub Web サイト 24 で利用可能な MVP ソフトウェアをインストールして実行します。注: MVP は、サンプルの品質、構成、および MHC 特異性を迅速かつ統合したビューを提供します。MVP は、確立された免疫ペプチドミクス アルゴリズム (NetMHCpan25、NetMHCIIpan26、および GibbsCluster27) の使用を並列化し、HTML (ハイパーテキスト マークアップ言語) 形式で整理されたわかりやすいレポートを生成します。レポートは完全にポータブルで、最新のWebブラウザを使用して任意のコンピュータで表示できます。HTML レポートの例については、補足データ 1-4 を参照してください。