Zellfreie skalierte Produktion und adjuvante Zugabe zu einem rekombinanten Haupt-Außenmembranprotein aus Chlamydia muridarum für die Impfstoffentwicklung

Alle Tierstudien wurden an der University of California, Irvine, in Einrichtungen durchgeführt, die vom Public Health Service (PHS) in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee durchgeführt wurden. 1. Vorbereitung der Glaswaren HINWEIS: Alle Materialien, die bei der Herstellung von Impfstoffformulierungen für Tiere verwendet werden, sind endotoxinfrei. Um kontaminierendes Endotoxin zu zerstören, backen Sie gereinigte Gläser, die Puffer in einem Ofen bei 180 °C für 4 Stunden halten. 2. Vorbereitung des Puffers Bereiten Sie 250 ml der in Tabelle 1 aufgeführten Ni-Affinitätsreinigungspuffer vor. Lagern Sie sie bis zu 6 Monate bei 4 °C. 3. Vorbereitung der Reaktion 20 mg 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC) werden in ein endotoxinfreies 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen eingewogen. Lösen Sie es in 1 ml endotoxinfreiem Wasser auf, sondizieren Sie es mindestens viermal bei 6 A für 1 Minute, mit 1 Minute Pause dazwischen, bis es klar ist. Entfernen Sie jegliches verunreinigte Metall aus der Sonde durch Zentrifugation bei 13.000 × g für 2 Minuten bei 22 °C und überführen Sie dann das gelöste Lipid in ein neues endotoxinfreies 1,5-ml-Röhrchen. Wiegen Sie 1 mg PEG5k-CA8 Telodendrimer in ein endotoxinfreies 1,5-ml-Röhrchen. In endotoxinfreiem Wasser bis zu einer Konzentration von 20 mg/ml auflösen. Vortex, bis es vollständig aufgelöst und auf 2 mg/ml verdünnt ist. In einem neuen endotoxinfreien Röhrchen 210 μl 20 mg/ml DMPC-Lösung mit 210 μl 2 mg/ml Telodendrimer-Lösung mischen. 4. Zellfreie Herstellung von MOMP-tNLPs für Untereinheiten-Impfstoffformulierungen Bereiten Sie MOMP-tNLPs mit zellfreien Methoden vor, die von einem zuvor veröffentlichten Protokollmodifiziert wurden 5.Öffnen Sie zwei Stunden vor Beginn der zellfreien Reaktion das prokaryotische zellfreie Proteinexpressionskit und tauen Sie einen der Rekonstitutionspuffer auf. Nach dem Auftauen eine Tablette EDTA-freien Proteasehemmer-Cocktail hinzufügen und vollständig auflösen lassen. Befolgen Sie dieses Protokoll mit einem Kit, das für die Durchführung von 5 x 1-ml-Reaktionen ausgelegt ist.HINWEIS: Eine typische Scale-up-Produktion ist 3 x 1 ml.Für jede 1-ml-Reaktion werden 525 μl Rekonstitutionspuffer in die E. coli-Lysatflasche gegeben und vorsichtig gerollt, um sich aufzulösen . Geben Sie 250 μl Rekonstitutionspuffer in die Flasche mit Reaktionsadditiven (z. B. ATP, GTP) und rollen Sie sie vorsichtig, um sich aufzulösen. 8,1 ml Rekonstitutionspuffer in die Reaktionsflaschen geben, mit einem Gummistopfen wieder verschließen (darauf achten, dass die Innenseite des Gummistopfens nicht berührt wird) und vorsichtig umdrehen/rollen, um sich aufzulösen. Geben Sie 3 ml Rekonstitutionspuffer in die Flasche mit der Aminosäuremischung, verschließen Sie sie mit einem Gummistopfen und drehen Sie sie vorsichtig um, um sich aufzulösen.HINWEIS: Achten Sie darauf, die Innenseite des Gummistopfens nicht zu berühren, da dies zu einer Kontamination führen kann. Geben Sie 1,8 ml Rekonstitutionspuffer in die Methioninflasche, rollen Sie sie vorsichtig, um sich aufzulösen, und lagern Sie sie dann bis zur Verwendung auf Eis. Bereiten Sie die Reaktionslösung vor.In die E. coli-Lysatflasche werden 225 μl rekonstituierte Reaktionsmischung, 270 μl rekonstituierte Aminosäuremischung ohne Methionin und 30 μl rekonstituiertes Methionin gegeben . Zusätzlich werden 400 μl der DMPC/Telodendrimer-Mischung, 15 μg MOMP-Plasmid und 0,6 μg Δ49ApoA1-Plasmid zugegeben. Zum Mischen leicht rollen/schütteln.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass beide Plasmide aus demselben Plasmid-Rückgrat bestehen. Keine Wirbel machen. Nehmen Sie 20 μl der Gesamtlösung und stellen Sie sie in einem 1,5-ml-Röhrchen für die GFP-exprimierende Kontrollreaktion beiseite (siehe unten). Bereiten Sie die Futterlösung vor. In die Futtermischungsflasche werden 2,65 ml rekonstituierte Aminosäuremischung ohne Methionin und 300 μl rekonstituiertes Methionin gegeben. Rollen/vorsichtig schütteln, um sich aufzulösen.HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können der unbenutzte Rekonstitutionspuffer und das Methionin zur Lagerung in den Gefrierschrank zurückgelegt werden. 1 ml der Reaktionslösung in die innere Reaktionskammer überführen, die im zellfreien Reaktionskit enthalten ist, und nach dem Befüllen versiegeln. 10 ml der Zufuhrlösung werden in die äußere Kammer des Reaktionsgefäßes überführt und abgedichtet.HINWEIS: Die Kammern nicht überfüllen! Das Vorhandensein von Luftblasen an der Oberseite sowohl der inneren Reaktionskammer als auch der inneren Zufuhrkammer wirkt sich negativ auf die Reaktion aus. Die verbleibende Reaktionslösung kann in ein 1,5-ml-Röhrchen gegeben und neben dem Hauptgefäß gemischt werden. 0,5 μl des GFP-Kontrollplasmids (0,5 mg/ml) werden zu dem zuvor aliquotierten 20-μl-Reaktionsgemisch gegeben.HINWEIS: Viele Kits werden mit einem Kontrollplasmid zur Qualitätskontrolle geliefert. Die meisten GFP-exprimierenden Plasmide mit einem T7-Promotor und einer E.coli-Ribosomen-Bindungsstelle (RBS) können auch als Kontrollplasmid verwendet werden. Die Reaktion wird in einem Schüttler bei 300 U/min bei 30 °C bis zu 18 h eingegeben. Um zu überprüfen, ob die Reaktion erfolgreich war, verwenden Sie eine UV-Lichtquelle, um die Fluoreszenz aufgrund der Synthese des Kontroll-GFP (Abbildung 1A) nach nur 15 Minuten Inkubation zu überprüfen.ANMERKUNG: Diese Bedingungen, insbesondere die Temperatur, müssen möglicherweise für die Expression anderer Membranproteine optimiert werden. 5. MOMP-tNLP-Reinigung Verwenden Sie die immobilisierte Nickel-Affinitätschromatographie, um den MOMP-tNLP-Nanopartikelkomplex aus dem zellfreien Reaktionsgemisch unter Verwendung des His-Tags auf dem Δ49ApoA1-Protein zu reinigen.1 ml einer 50%igen Aufschlämmung des His-Tag-Reinigungsharzes in eine 10-ml-Einweg-Chromatographiesäule überführen und mit 3 ml Bindungspuffer äquilibrieren. Lassen Sie den Puffer ablaufen, verschließen Sie den Auslass und geben Sie 250 μl Bindepuffer in das Harz. Bevor Sie die zellfreie Reaktion in die Säule geben, bewahren Sie 20 μl für die spätere Analyse mit SDS-PAGE auf. Mischen Sie die zellfreie Reaktion mit dem äquilibrierten Harz und inkubieren Sie es auf einem Laborrocker bei 4 °C für 1 h. Lösen Sie die Kappe der Säule, waschen Sie die Kappe mit 500 μl zusätzlichem Bindepuffer und geben Sie diese Flüssigkeit in den Rest der Säule. Sammeln Sie den Flüssigkeitsdurchfluss aus der Säule für die spätere Analyse mit SDS-PAGE. Waschen Sie die Säule sechsmal mit 1 ml Waschpuffer mit 20 mM Imidazol und sammeln Sie die Fraktionen. Achten Sie darauf, das Harz zwischen den Wäschen nicht austrocknen zu lassen. Bei der zweiten Wäsche wird das Harz kräftig gerührt, indem Sie es mit einer 1-ml-Pipette auf und ab pipettieren. Die MOMP-tNLPs werden in sechs 300-μl-Fraktionen des Elutionspuffers 1 (mit 250 mM Imidazol) eluiert, gefolgt von einer abschließenden Elution mit 300 μl Elutionspuffer 2 (mit 500 mM Imidazol). Bei der zweiten Elution wird das Harz kräftig gerührt, indem Sie mit einer 1-ml-Pipette auf und ab pipettieren. 6. Analyse durch SDS-PAGE HINWEIS: Alle Elutionsfraktionen sollten mit SDS-PAGE analysiert werden, um die Menge und Reinheit des interessierenden Proteins zu überprüfen. Laden Sie jeweils 1 μl des gesamten Lysats und des Durchflusses und dann 5 μl für alle gesammelten Wasch- und Elutionsfraktionen.Mischen Sie Aliquots der eluierten MOMP-tNLPs, Waschungen, Durchfluss- und Gesamtlysate mit 4x SDS-PAGE-Probenladepuffer. Mischen und denaturieren Sie die Proben mit dem 10-fachen Reduktionsmittel, sofern nicht anders angegeben. Analysieren Sie die Fraktionen mittels Gelelektrophorese mit 1,0 mm, 4 bis 12 %, Bis-Tris SDS-PAGE-Gelen mit 1x MES-SDS-Laufpuffer, zusammen mit einem geeigneten Molekulargewichtsstandard. Lassen Sie die Gele 35 Minuten lang bei 200 V laufen. Färben Sie die Gele gemäß den Anweisungen des Herstellers.Nehmen Sie das Gel aus der Kassette und geben Sie es in 60 ml Gelbeibe. Erhitzen Sie das Gel 30 Sekunden lang in der Mikrowelle und wiegen Sie den Behälter 30 Sekunden lang vorsichtig, um die Hitze gleichmäßig zu verteilen. Erhitzen Sie das Gel im Fleck für weitere 30 Sekunden auf 80–85 °C in der Mikrowelle und geben Sie das Gel 5 Minuten lang auf einen Orbitalschüttler, um es zu rocken. Erhitzen Sie das Gel ein drittes Mal für 30 Sekunden in der Mikrowelle und kehren Sie dann zum Orbitalschüttler zurück, um es weitere 23 Minuten lang zu rocken. Geben Sie das Gel in einen sauberen Behälter und waschen Sie es 30 Minuten lang in 100 ml Waschlösung (10 % Methanol, 7 % Essigsäure).HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt, da es wichtig ist, das Erhitzen der Waschlösung zu vermeiden. Andernfalls kann es zu Hintergrundverfärbungen und Unregelmäßigkeiten im endgültigen Gelbild kommen. Spülen Sie das Gel nach dem Waschen zweimal für jeweils 5 Minuten in Reinstwasser aus. Bilden Sie die Gele mit einem Gel-Imager bei 600 nm ab (Abbildung 2). Verwenden Sie SDS-PAGE, um die Menge des einzelnen Proteins in der Nanopartikellösung zu quantifizieren, wenn es einen Proteinstandard zum Vergleich gibt.ANMERKUNG: In diesem Beispiel werden serielle Verdünnungen von rekombinant exprimiertem MOMP durch SDS-PAGE aufgelöst und die Dichten der Banden mit Hilfe der Gerätesoftware quantifiziert. Generieren Sie eine Standardkurve mit den Dichten der MOMP-Bänder. Lösen Sie die MOMP-tNLP-Proben auf demselben SDS-PAGE-Gel auf und berechnen Sie die MOMP-Komponente der Partikel anhand der MOMP-Standardkurve (Abbildung 3). 7. Western- und Dot-Blots und Lagerung Für das Western Blotting lösen Sie die Proben mit SDS-PAGE auf und übertragen die Gele mit einem handelsüblichen Trockenblotting-System mit Standardeinstellungen gemäß dem Protokoll des Herstellers.Entfernen Sie die Blots nach Abschluss des Transfers aus dem Stapel und inkubieren Sie jeden Blot über Nacht bei 4 °C in einem geeigneten Blockierungspuffer, der 0,2 % Tween 20 und entweder 0,5 mg/ml MAb40 oder 0,2 mg/ml MAbHIS-Anti-His-Tag-Antikörper enthält, der gegen den His-Tag des Δ49ApoA1-Proteins gerichtet ist.HINWEIS: Die für das Blotting verwendeten Antikörperverdünnungen betragen 1:1.000 für MAb40 und 1:500–1.000 für MAbHIS-Antikörper. Waschen Sie jeden Tupfer 3 Mal für 5 Minuten mit PBS-T (1x PBS, 0,2 % Tween 20, pH 7,4). Inkubieren Sie die Blots für 1 Stunde in einem Blockierungspuffer, der sekundäre Antikörper enthält, die an einen Fluorophor (z. B. IRDye) in einer Verdünnung von 1:10.000 konjugiert sind. Waschen Sie die Kleckse 3 Mal für 5 Minuten mit PBS-T. Verwenden Sie einen Fluoreszenz-Imager, um die Kleckse nach der letzten Wäsche abzubilden. Bei Dot-Blots werden 3 μg gereinigtes MOMP-tNLP getupft und tNLP mit einem Dot-Blot-Gerät entleert. Blockieren und entwickeln Sie die Blots mit den gleichen Methoden, die oben für das Western Blot beschrieben wurden. 8. Bewertung des Endotoxingehalts Quantifizierung des Endotoxinspiegels mit einem Endotoxin-Testsystem, das auf dem Limulus-Amöbozyten-Lysat-Assay (LAL) basiert. Endotoxinfreies 25 mM Tris, pH 7,4, Probenpuffer mit 1 M Trishydrochloridlösung und endotoxinfreiem Wasser herstellen.HINWEIS: In der Regel müssen Proben mit diesem Probenpuffer verdünnt und die Verdünnungen angepasst werden, um den geeigneten Bereich für einzelne Proben zu finden. Hier werden MOMP-tNLP-Proben 500-fach in Probenpuffer verdünnt und 25 μl in jede Vertiefung einer Gerätekartusche mit einer Empfindlichkeit von 0,05 EU/ml geladen. Die Endotoxingehalte von MOMP-tNLP und leerem tNLP, die in den unten beschriebenen Mausstudien verwendet wurden, liegen je nach Probe zwischen 0,4 und 12 EU/μg Protein. 9. Gefriertrocknung Lyophilisieren und lagern Sie die MOMP-tNLP-Nanopartikel für den Langzeitgebrauch (bis zu Jahren) bei -20 °C. Um tNLP- und MOMP-tNLP-Suspensionen für die Gefriertrocknung vorzubereiten, fügen Sie Trehalose als Schutzmittel während des Gefrier- und Gefriertrocknungsprozesses hinzu.HINWEIS: Dieses Verfahren wurde für eine Vielzahl von tNLP-Formulierungen umfassend validiert 7,8. Das Stromvolumen der MOMP-tNLP-Lösung wird durch 9 dividiert, um das Volumen von 1 M Trehalose in sterilem, endotoxinfreiem, deionisiertem Wasser zu erhalten, das erforderlich ist, um eine Endkonzentration von 0,1 M Trehalose zu erreichen. Notieren Sie sich das Endvolumen und aliquotieren Sie es je nach Wunsch in endotoxinfreie 15-ml- oder 50-ml-Polypropylenröhrchen. Die gemischte Lösung auf Trockeneis einfrieren und über Nacht mit einem Gefriertrockner gefrieren. Lagern Sie die getrockneten Formulierungen bis zur Verwendung bei -20 °C. Rekonstituieren Sie lyophilisierte tNLPs mit endotoxinfreiem Wasser. Vorsichtig ausrollen, bis sich der gefriergetrocknete Kuchen vollständig aufgelöst und rehydriert hat. Um Trehalose zu entfernen, dialysieren Sie die Lösung gegen PBS mit einer 3,5-kDa-Cutoff-Dialysemembran. 10. Adjuvante Zugabe HINWEIS: Diese und andere ähnliche NLP-basierte Sub-Unit-Impfstoffformulierungen können problemlos lipophile Adjuvantien wie CpG-ODN1826 und FSL-1 enthalten. CpG-ODN1826 ist ein modifiziertes CpG-Oligonukleotid der Klasse B (5′-tccatgacgttcctgacgtt-3′) mit einem vollständigen Phosphorthioat-Rückgrat mit einem 5′-Cholesterinanteil (5′-chol-C6). Die Konjugation von CpG-ODN1826 an tNLPs wird durch die hydrophoben Wechselwirkungen zwischen dem Cholesterinanteil und der Phospholipid-Doppelschicht des tNLP vermittelt und wurde, wie bereits berichtet 9,10, nachgewiesen und gut charakterisiert. Vor der Einarbeitung in diese Formulierungen ist das cholesterinmodifizierte CpG durch Umkehrphasenchromatographie zu reinigen, um kontaminierendes Endotoxin sowie alle unmodifizierten CpG-Moleküle zu entfernen.Nach Erhalt durch den Lieferanten wird das lyophilisierte CpG-Material in endotoxinfreiem Wasser rehydriert und auf einer präparativen C4-RP-HPLC-Säule unter Verwendung eines Trenngradienten aus 10 mM Triethylammoniumacetat (TEAA) (mobile Phase A) und Acetonitril (mobile Phase B) gereinigt.HINWEIS: Weitere Details finden Sie in Tabelle 2. Die Fraktionen, die Cholesterin-modifiziertes CpG enthalten, werden gepoolt und gefriergetrocknet. Um eine vollständige Entfernung des restlichen TEAA zu gewährleisten, wird das CpG mit 15 ml endotoxinfreiem Wasser rekonstituiert und dreimal relyophilisiert. Nach der abschließenden Gefriertrocknung wird CpG in endotoxinfreiem Wasser (>20 mg/ml endgültige CpG-Konzentration) aliquot rekonstituiert und bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert. Für die Zugabe zu Formulierungen wird das CpG auf eine Konzentration von 1–2,5 mg/ml verdünnt.HINWEIS: FSL-1 ist als gefriergetrocknetes Pulver in Impfstoffqualität erhältlich. Diese wird mit sterilem und endotoxinfreiem Wasser in einer Konzentration von 1 mg/ml rekonstituiert. Der Impfstoff wird intramuskulär (i.m.) verabreicht, wobei jede Dosis 10 μg MOMP in einem Gesamtvolumen von 50 μl enthält. Um die gewünschte Formulierungsdosis zu erreichen, dialysieren Sie die Nanopartikel zu PBS und konzentrieren Sie sie mit einem zentrifugalen Vakuumkonzentrator vor der adjuvanten Zugabe. Achten Sie dabei darauf, eine vollständige Trocknung der Probe zu vermeiden – überprüfen Sie das Probenvolumen während der Zentrifugation alle 20 bis 30 Minuten. Geben Sie das Adjuvans unter sterilen Bedingungen in eine Biosicherheitswerkbank. Um die erfolgreiche Einarbeitung zu beurteilen, analysieren Sie die endgültigen Formulierungen und ihre Bestandteile mittels analytischer Größenausschlusschromatographie (SEC).HINWEIS: Für diese Vorbereitungen wurde eine SEC-Säule in PBS-Puffer (0,5 ml/m Flussrate) verwendet, und die Elution wurde mit einem UV-Vis-Diodenarray-Detektor detektiert. Die Inkorporation wurde bewertet, indem die Absorption der adjuvantierten Partikel mit der der nicht adjuvantierten Partikel bei 214 und 280 nm verglichen wurde. Lagern Sie das adjuvantierte MOMP-tNLP und entleeren Sie tNLP bei 4 °C vor der Tieranwendung für einen Zeitraum von bis zu 14 Tagen. Um die Stabilität einer neuen tNLP-Formulierung vollständig beurteilen zu können, analysieren Sie die gespeicherten tNLPs regelmäßig per SEC.HINWEIS: Die Stabilität variiert von Formulierung zu Formulierung. 11. Serum-Tests Besorgen Sie sich weibliche 3 Wochen alte Mäuse (BALB/c, n = 6). Die Mäuse werden intramuskulär (i.m.) in jeder Hintergliedmaße mit 10 μg MOMP in Form von MOMP-tNLP adjuvantiert mit 5 μg CpG und 1 μg FSL-1 (Gesamtvolumen pro Injektion = 50 ml) geimpft. Beobachten Sie die Mäuse nach der Impfung, bis sie in der Lage sind, das Brustbein zu halten. Vier Wochen nach der Erstimpfung (Prime) werden die Tiere ein zweites Mal geimpft (Boost) mit 10 μg MOMP in Form von MOMP-tNLP adjuvantiert mit 5 μg CpG und 1 μg FSL-1 (Gesamtvolumen pro Injektion = 50 ml). Am Tag 56 nach der Erstimpfung Blut entnehmen, um die Antikörpertiter zu bestimmen. Beginnen Sie mit der Betäubung der Mäuse durch Injektion einer Lösung aus Xylazin (0,3 mg/20 g Körpergewicht) und Ketamin (3,0 mg/20 g Körpergewicht). Kneifen Sie die Vorder- und Hinterbeine zusammen, um sicherzustellen, dass kein Ruckeln auftritt. Tragen Sie Vaseline um die Augen herum auf, um Augentrockenheit während der Anästhesie zu verhindern. Mit einem Mikro-Hämatokrit-Kapillarrohr wird der retroorbitale Plexus punktiert. Sammeln Sie 100 ml Blut in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Beobachten Sie die Mäuse nach der Blutentnahme, bis sie sich von der Narkose erholt haben und das Brustbein beibehalten können. Lassen Sie das Blut 30 Minuten bei Raumtemperatur gerinnen und schleudern Sie dann 10 Minuten lang bei 2.000 × g herunter. Das Serum auffangen und bei -80 °C einfrieren. Fordern Sie die Tiere zu diesem Zeitpunkt mit Chlamydia muridarum heraus oder schläfern Sie sie ein. Euthanasieren Sie die Mäuse, indem Sie zuerst eine Lösung aus Xylazin (0,3 mg/20 g Körpergewicht) und Ketamin (3,0 mg/20 g Körpergewicht) injizieren, gefolgt von einer Zervixluxation. Testen Sie Serumantikörper, die spezifisch für MOMP sind, mit Western-Blotting-Techniken, wie oben beschrieben. Pool-Mausseren von allen immunisierten Mäusen und verwenden Sie das gepoolte Serum anstelle eines primären Antikörpers in einer Verdünnung von 1:5.000.