このプロトコルでは、市販の無細胞タンパク質発現キットを使用して、サブユニットワクチンの抗原として使用できるナノディスクに支持された膜タンパク質を産生することを説明しています。
サブユニットワクチンは、安全性、安定性、および標準製造において、従来の不活化または弱毒化全細胞由来ワクチンよりも優れています。効果的なタンパク質ベースのサブユニットワクチンを達成するために、タンパク質抗原はしばしば天然のような立体構造を採用する必要があります。これは、膜結合タンパク質である病原体表面抗原にとって特に重要です。一般にナノディスクとして知られているナノリポタンパク質粒子(NLP)の共翻訳を通じて、正しく折り畳まれた機能的な膜タンパク質を製造するために、無細胞法が首尾よく使用されています。
この戦略は、脂質結合環境で膜タンパク質からなるサブユニットワクチンを製造するために使用できます。ただし、無細胞タンパク質の生産は、多くの場合、小規模(<1 mL)に限定されます。小規模生産工程で生産されるタンパク質の量は、通常、生化学的および生物物理学的研究に十分です。ただし、動物モデルでのワクチン研究に十分なタンパク質を得るために、無細胞プロセスをスケールアップ、最適化、および慎重にテストする必要があります。精製、アジュバント添加、凍結乾燥など、ワクチン製造に関連する他のプロセスは、並行して最適化する必要があります。この論文では、膜結合タンパク質サブユニットワクチンを発現、精製、および製剤化するためのスケールアッププロトコルの開発を報告します。
スケールアップした無細胞反応では、複数のプラスミド発現ベクターを使用する場合のプラスミド濃度と比率の最適化、脂質の選択、およびアジュバント添加により、製剤化されたナノリポタンパク質粒子を高レベルで生産する必要があります。この方法は、クラミジア主要外膜タンパク質(MOMP)の発現でここで実証されていますが、他の膜タンパク質抗原にも広く適用できます。抗原の有効性は、ここで示されているように、抗体産生を測定するための免疫研究を通じて in vivo で評価できます。
タンパク質を無細胞発現させるための原核生物または真核生物ライセートは、目的のタンパク質を合成するための市販製品として容易に入手可能です(完全なレビューについては、 1を参照)。これらの発現系はさまざまなスケールで利用可能であり、 大腸菌、タバコ植物、哺乳類培養物など、さまざまな生物のライセートを利用しています。無細胞ライセートは、使いやすさや堅牢で迅速なタンパク質生産など、従来の組換えタンパク質生産アプローチに比べて複数の利点があります。これらのアプローチは主に可溶性タンパク質の生産に使用されますが、このグループは膜タンパク質を発現するためのアプローチを開拓しました。
この新しいアプローチは、発現のための2つのタンパク質産物、アポリポタンパク質および目的の膜タンパク質をコードするDNAを含むことにより、既存の無細胞発現系にわずかな変更を加える。発現したアポリポタンパク質(ApoA1またはApoE4の誘導体)は、無細胞ライセートに添加された脂質と相互作用して、自発的に(~20 nm)NLPを組み立てます。目的の膜タンパク質と共翻訳すると、NLPと膜タンパク質は可溶性ナノ粒子複合体を形成し、膜タンパク質はNLP脂質二重層内に埋め込まれます。したがって、膜タンパク質は可溶性の離散粒子内に含まれるため、ダウンストリームアプリケーションによりアクセスしやすくなります。このアプローチは、NLP二重層2 内で機能的なオリゴマータンパク質複合体を生成することができ、サブユニットワクチンの抗原成分を生成することができ、その後、親油性アジュバントと混合して、 in vivo 評価に適した共局在抗原およびアジュバントを特徴とするナノ粒子ワクチンを形成することができる。
この現在の方法は、以前に公開されたプロトコル3から変更されています。重要な修飾は、無細胞反応のスケールアップとそれに続くタンパク質-NLP複合体の精製に焦点を当てています。さらなる修飾は、テロデンドリマーとして知られる両親媒性ポリマーの添加を含み、これは、無細胞反応への添加の前に最初に脂質と混合される。テロデンドリマーおよび脂質の存在下でのプラスミドの共翻訳は、テロデンドリマーNLP(tNLP)を生じる。テロデンドリマーの添加はまた、得られるtNLPナノ粒子のサイズおよび単分散性を調節するのを助けます4。このプロトコルは、膜結合サブユニット抗原タンパク質であるクラミジアMOMP5,6を産生するための大規模なワクチン研究に特に最適化されています。この方法は、tNLPに関連する組換えMOMPを生成して、MOMPオリゴマー化を保持する溶解性の高いMOMP-tNLP複合体を形成します。典型的な3 mLのスケールアップ生産では、>1.5 mgの精製MOMPが得られます。無細胞で産生されたMOMP-tNLPは、in vivo免疫原性試験のための迅速なアジュバント添加に適しています。
クラミジアは、男性と女性の両方に影響を与える最も一般的な性感染症です。クラミジアのワクチン研究は何十年にもわたっていますが、大量生産に拡張できる安全で効果的なワクチンはとらえどころのないままです13。クラミジアMOMPは、防御ワクチン抗原としての主要な候補と考えられています。ただし、MOMPは非常に疎水性が高く、誤った折り畳みが発生しやすい14,15。さらなる研究により、MOMPはその免疫原性に不可欠なオリゴマー状態に存在することが明らかになりました11。ここでは、tNLPナノ粒子内で形成されたオリゴマーMOMPをワクチンとして生成し、ライセート3 mLあたり約1.5 mgの精製MOMPを生成する、検証済みの無細胞共発現法について詳しく説明しています。この完全に照合された手順は、工業生産のためにさらに拡張することができ、ワクチンを生成するための有用なアプローチとしての見通しを高めます。
我々は以前、無細胞発現を用いてNLP3,16内に埋め込まれた膜タンパク質を産生すること、およびテロデンドリマー安定化ディスクへの発現について発表しています。しかしながら、この後者の技術は、より大きな不均一性およびより低い溶解性を有する膜タンパク質粒子を生成した。4さらに、MOMPテロデンドリマー粒子の免疫原性は、MOMP-tNLP粒子と比較して不明です6。
この手順は、サブユニットワクチンで使用するための抗原として有望な候補である細菌膜タンパク質の発現を拡大するために適用することができます。この手順は、可溶化された細菌膜タンパク質を生成するだけでなく、コレステロール部分またはFSL-1に結合したCpGを含むがこれらに限定されない様々な親油性ワクチンアジュバントを使用して、ナノ粒子構造全体をさらなる修飾に受け入れることができます。細菌由来の他の候補抗原の発現は可能ですが、最適な収量を達成するためには、発現温度、脂質の選択、発現系の種類などのパラメータを探索する必要があるかもしれません。
さらに、このプロセスではプラスミドの選択と比率が重要です。使用する両方のプラスミドは、同じ骨格から構築する必要があります。インサートの長さがほぼ同じ場合、比率は、ここで説明するように、添加されたプラスミドの質量に基づくことができます。ただし、モルに基づく比率は、特に反応をスケーリングする場合に、より再現性のある結果をもたらします。スクリーンスケール反応(< 0.5 mL)でうまく機能する比率は、より大きな反応には適用できない場合があり、追加の最適化が必要になる場合があります。非膜タンパク質は、無細胞キットを使用して発現させることができますが、可溶性生成物を生成するために脂質ナノ粒子(共発現)を必要としない場合があります。さらに、このプロトコルはCpGおよびFSL-1によるアジュバントについて説明していますが、このシステムは、他の親油性アジュバントとの製剤化または所望により可溶性アジュバントとの混合に適しています。
無細胞発現反応を設定する際には、収率に影響を与える可能性があるため、汚染を避けることが不可欠です。プラスミド自体を含む反応への添加物は、高純度でなければなりません。さらに、発現タンパク質は、エンドトキシン汚染のない材料および溶液とのみ接触する必要があります。候補製剤中のエンドトキシン汚染は、免疫学的アッセイの一貫性のない偽の結果につながる可能性があり、十分な量で有害である可能性があります。ここでは説明しませんが、SDS-PAGEなどの後続の分析ステップで多くの汚染物質が観察される場合は、ニッケルアフィニティークロマトグラフィー後の追加の精製が必要になる場合があります。これはSECで実現できますが、条件によっては定式化ベースでの最適化が必要になる場合があります。
The authors have nothing to disclose.
この作業は、国立アレルギー感染症研究所の公衆衛生サービス助成金R21 AI20925およびU19 AI144184によってサポートされました。この作業は、米国エネルギー省の後援の下、ローレンスリバモア国立研究所が契約DE-AC52-07NA27344 [LLNL-JRNL-822525、LLNL-VIDEO-832788]に基づいて実施しました。
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) as powder | Avanti Polar Lipids | 850345 | |
1.5 mL endotoxin-free centrifuge tubes | Eppendorf | 2600028 | |
1 M Trizma hydrochloride solution | Millipore Sigma | T2194 | |
Acetic acid, glacial, ACS reagent, ≥99.7% | Millipore Sigma | 695092 | |
Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
Buffer Dam for XCell SureLock | Life Technologies | EI0012 | |
C24 Incubator shaker | New Brunswick Scientific | ||
Cell-Free Expression System: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit | BiotechRabbit | BR1400201 | |
cOmplete His-Tag Purification Resin | Roche Molecular Diagnostics | 5893682001 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche Molecular Diagnostics | 4693132001 | |
CpG-ODN1826 | Biosearch Technologies | T9449 | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Millipore Sigma | 71509 | |
Dialysis tubes D-Tube Dialyzer Maxi | Millipore Sigma | 71508-3 | |
Disposable, polypropylene fritted columns 10 mL capacity | Bio-Rad | 7311550EDU | |
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (PBS) | Millipore Sigma | D8537 | |
Electrophoresis Power Supply | |||
Endosafe PTS cartridge | Thermo Fisher Scientific | NC9594798 | |
Endosafe-PTS Testing System | Charles River | ||
Gel wash solution: 10% methanol, 7% acetic acid | |||
HCl and NaOH solutions for pH adjustment | |||
HPLC with UV-vis diode array detector | Shimadzu | ||
HyClone HyPure culture-grade water | VWR | 82007-328 | |
iBlot 2 Dry Blotting System | Life Technologies | ||
iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF | Life Technologies | IB24001 | |
Image Studio V2.0 software | Li-COR Biiosciences | ||
Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
LI-COR Odyssey Fc imager | Li-COR Biiosciences | ||
Lyophilizer | Labconco | ||
Methanol (≥99.9%) | Millipore Sigma | 34860 | |
Microcentrifuge | |||
Microwave oven | |||
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | |
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP000202 | |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Life Technologies | NP0009 | |
Odyssey Blocking Buffer in TBS containing 0.2% Tween 20 | Li-COR Biosciences | 927-50000 | |
Orbital Shaker | |||
PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4) | |||
PEG5K-CA8 Telodendrimer (custom synthesis product) | |||
pIVEX2.4d vector | Roche Molecular Diagnostics | ||
Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
Primary antibody: MAb40 (monoclonal antibody to the variable domain 1 (VD1) of C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4 | |||
Primary antibody: MAbHIS, Penta-His antibody | Qiagen | 34660 | |
Probe sonicator | |||
Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
Qubit Protein Assay Kit | Life Technologies | Q33212 | |
Rainin Pipette tips: LTS 1000 µL | Rainin | 17002428 | |
Rainin Pipette tips: LTS 20 µL | Rainin | 17002429 | |
Rainin Pipette tips: LTS 200 µL | Rainin | 17002426 | |
Rainin Pipettes | Rainin | ||
Secondary antibody: IRDye 800CW goat (polyclonal) anti-mouse IgG (heavy and light) | Li-COR Biosciences | 926-32210 | |
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Life Technologies | LC5925 | |
Sodium chloride NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
Sodium phosphate monobasic NaH2PO4 | Millipore Sigma | S0751 | |
Superdex 200, 5/150 GL column | Cytiva | GE28-9909-45 | |
Synthetic diacylated lipoprotein-TLR2/6 FSL-1 | Invivogen | tlrl-fsl | |
SYPRO Ruby Protein Gel Stain | Life Technologies | S12001 | |
TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | |
UV light source | |||
Vacufuge Bench Top Centrifuge | Eppendorf | ||
Vortexer | |||
VWR 15 mL conicals (89039-666) | VWR | ||
VWR 50 mL conicals (89039-656) | VWR | ||
XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies ) | Life Technologies | EI0001 |