ワクチン開発のためのクラ ミジア・ムリダルム 由来の組換え主要外膜タンパク質への無細胞スケール生産とアジュバント添加

すべての動物実験は、カリフォルニア大学アーバイン校の公衆衛生サービス(PHS)保証施設で、施設動物管理および使用委員会によって設定されたガイドラインに従って実施されました。 1.ガラス製品の準備 注:動物用のワクチングレードの製剤の製造に使用されるすべての材料は、エンドトキシンを含みません。 汚染されたエンドトキシンを破壊するには、バッファーを保持する洗浄ガラス製品を180°Cのオーブンで4時間焼きます。 2. バッファー調製 表1に記載のNiアフィニティー精製バッファーを250mL調製します。4°Cで最大6か月間保管してください。 3. 反応準備 20 mgの1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)をエンドトキシンを含まない1.5 mL遠沈管に計量します。それを1mLのエンドトキシンフリー水に溶解し、プローブ超音波処理を6Aで1分間、1分間、透明になるまで1分間休止させる。13,000 × g で22°Cで2分間遠心分離してプローブから汚染物質金属を除去し、可溶化脂質を新しい1.5 mLエンドトキシンフリーチューブに移します。 1 mgのPEG5k-CA8テロデンドライナーを1.5 mLのエンドトキシンフリーチューブに計量します。エンドトキシンを含まない水に20 mg/mLの濃度まで溶解します。完全に溶解するまで渦化し、2 mg/mLに希釈します。 新しいエンドトキシンフリーチューブで、210 μLの20 mg/mL DMPC溶液と210 μLの2 mg/mLテロデンドリマー溶液を組み合わせます。 4. サブユニットワクチン製剤のためのMOMP-tNLPの無細胞生産 以前に公開されたプロトコルから変更された無細胞法を使用してMOMP-tNLPを調製する5.無細胞反応を開始する2時間前に、原核生物の無細胞タンパク質発現キットを開き、再構成バッファーの1つを解凍します。解凍したら、EDTAフリーのプロテアーゼ阻害剤カクテルを1錠加え、完全に溶かします。 5 x 1 mL反応を実行するように設計されたキットを使用して、このプロトコルに従ってください。注:一般的なスケールアップ生産は3 x 1 mLです。1 mLの反応ごとに、525 μLの再構成バッファーを 大腸菌 ライセートボトルに加え、穏やかに転がして溶解します。反応添加剤(ATP、GTPなど)を入れたボトルに250 μLの再構成バッファーを加え、穏やかに転がして溶解します。 反応供給ボトルに再構成バッファー8.1 mLを加え、ゴム栓でキャップし(ゴム栓の内側に触れないように注意してください)、静かに反転/転がして溶解します。 3 mLの再構成バッファーをアミノ酸混合ボトルに加え、ゴム栓でキャップし、穏やかに反転/転がして溶解します。注意: ゴム栓の内側には、汚染につながる可能性があるため、触れないように注意してください。 1.8 mLの再構成バッファーをメチオニンボトルに加え、穏やかに転がして溶解し、使用するまで氷上で保存します。 反応液を調製する。大腸菌ライセートボトルに、225 μLの再構成反応ミックス、270 μLのメチオニンを含まない再構成アミノ酸ミックス、および30 μLの再構成メチオニンを加えます。さらに、DMPC/テロデンドリマー混合物400 μL、MOMPプラスミド15 μg、およびΔ49ApoA1プラスミド0.6 μgを追加します。転がす/軽く振って混ぜます。注:両方のプラスミドが同じプラスミド骨格から構築されていることを確認してください。渦巻かないでください。 全溶液20 μLを取り、GFP発現制御反応のために1.5 mLチューブに入れておきます(下記参照)。 飼料溶液を調製する。フィードミックスボトルに、メチオニンを含まない再構成アミノ酸ミックス2.65 mLと再構成メチオニン300 μLを追加します。転がす/軽く振って溶かします。注意: この時点で、未使用の再構成バッファーとメチオニンは冷凍庫に戻して保管することができます。 無細胞反応キットに設けられた内部反応室に反応液1mLを移し、充填したら密封する。10 mLの供給溶液を反応容器の外室に移し、密閉する。注意: チャンバーをいっぱいにしないでください!内側の反応室と内側の供給室の両方の上部に気泡が存在すると、反応に悪影響を及ぼします。残りの反応溶液は1.5 mLチューブに入れ、メイン容器と一緒に混合することができます。 0.5 μLのGFPコントロールプラスミド(0.5 mg/mL)を、予め分注した20 μLの反応混合物に加えます。注:多くのキットには、品質管理を目的としたコントロールプラスミドが付属しています。T7プロモーターと 大腸菌 リボソーム結合部位(RBS)を有するほとんどのGFP発現プラスミドもコントロールプラスミドとして用いることができる。 反応物を300 rpm、30°Cで最大18時間シェーカーに入れます。反応が成功したことを確認するには、UV光源を使用して、わずか15分のインキュベーション後にコントロールGFP(図1A)の合成による蛍光を確認します。注:これらの条件、特に温度は、他の膜タンパク質の発現のために最適化する必要があるかもしれません。 5. MOMP-tNLP精製 固定化ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して、Δ49ApoA1タンパク質上のHisタグを使用して、無細胞反応混合物からMOMP-tNLPナノ粒子複合体を精製します。His-Tag 精製樹脂の 50% スラリー 1 mL を使い捨ての 10 mL クロマトグラフィーカラムに移し、3 mL の結合バッファーで平衡化します。 バッファーを排出し、出口にキャップをして、250 μLの結合バッファーを樹脂に加えます。 無細胞反応をカラムに加える前に、後でSDS-PAGEで分析するために20 μLを保存してください。無細胞反応を平衡化樹脂と混合し、実験室のロッカーで4°Cで1時間インキュベートします。 カラムのキャップを外し、500 μLの追加結合バッファーでキャップを洗浄し、この液体をカラムの残りの部分に加えます。 後でSDS-PAGEで分析するために、カラムから液体フロースルーを収集します。 20 mM イミダゾールを含む 1 mL の洗浄バッファーでカラムを 6 回洗浄し、画分を収集します。洗濯の合間にレジンが乾かないように注意してください。2回目の洗浄では、1 mLピペットを使用して上下にピペッティングして樹脂を激しく攪拌します。 MOMP-tNLPを6つの300 μLの溶出バッファー1(250 mMイミダゾールを含む)で溶出し、続いて300 μLの溶出バッファー2(500 mMイミダゾールを含む)で1回溶出します。2回目の溶出では、1 mLピペットを用いて上下にピペッティングして樹脂を激しく撹拌します。 6. SDSページによる分析 注:すべての溶出画分をSDS-PAGEで分析し、目的のタンパク質の量と純度をスクリーニングする必要があります。 全ライセートとフロースルーをそれぞれ1 μLロードし、次に収集したすべての洗浄液と溶出画分に対して5 μLをロードします。溶出したMOMP–tNLP、洗浄液、フロースルー液、および全ライセートのアリコートを4x SDS-PAGEサンプルローディングバッファーと混合します。特に明記されていない限り、サンプルを10倍のサンプル還元剤と混合して熱変性させます。 1.0 mm、4〜12%のビストリスSDS-PAGEゲルと1x MES-SDSランニングバッファー、および適切な分子量標準を使用したゲル電気泳動により画分を分析します。ゲルを200 Vで35分間実行します。 製造元の指示に従ってゲルを染色します。カセットからゲルを取り出し、60 mLのゲルステインに入れます。ゲルステインでゲルを30秒間電子レンジで加熱し、容器を30秒間静かに揺り動かして熱を均等に分散させます。染色剤中のゲルをさらに30秒間80〜85°Cに電子レンジで加熱し、ゲルをオービタルシェーカーに置いて5分間揺り動かします。 ゲルを3回目に電子レンジで30秒間加熱してから、オービタルシェーカーに戻ってさらに23分間揺り動かします。 ゲルを清潔な容器に移し、100 mLの洗浄液(10%メタノール、7%酢酸)で30分間洗浄します。注意: 洗浄液の加熱を避けることが不可欠であるため、これは重要なステップです。そうしないと、最終的なゲル画像に背景の汚れや不規則性が生じる可能性があります。 洗浄後、ゲルを超純水で5分間2回リンスします。 ゲルイメージャーを用いてゲルを600 nmで画像化します(図2)。SDS-PAGEを使用して、比較用のタンパク質標準がある場合は、ナノ粒子溶液中の個々のタンパク質の量を定量します。注:この例では、組換え発現したMOMPの連続希釈はSDS-PAGEによって分解され、バンドの密度は装置ソフトウェアを使用して定量化されます。 MOMP バンドの密度を使用して検量線を生成します。同じSDS-PAGEゲル上でMOMP-tNLPサンプルを分解し、MOMP標準曲線を使用して粒子のMOMP成分を計算します (図3)。 7.ウェスタンブロットとドットブロットとストレージ ウェスタンブロッティングの場合は、SDS-PAGEでサンプルを分離し、メーカーのプロトコルに従った標準設定の市販のドライブロッティングシステムを使用してゲルを転写します。転写が完了したら、ブロットをスタックから取り出し、0.2% Tween 20およびΔ49ApoA1タンパク質由来のHisタグに対する0.5 mg/mL MAb40または0.2 mg/mL MAbHIS抗Hisタグ抗体を含む適切なブロッキングバッファー中で、各ブロットを4°Cで一晩インキュベートします。注:ブロッティングに使用される抗体希釈液は、MAb40の場合は1:1,000、MAbHIS抗体の場合は1:500〜1,000です。 各ブロットをPBS-T(1x PBS、0.2%トゥイーン20、pH 7.4)で5分間3回洗浄します。 蛍光色素に結合した二次抗体(IRDyeなど)を含むブロッキングバッファー中で、1:10,000希釈でブロットを1時間インキュベートします。 ブロットをPBS-Tで5分間3回再洗浄します。蛍光イメージャーを使用して、最終洗浄後のブロットを画像化します。 ドットブロットの場合は、精製MOMP-tNLP3 μgおよび空のtNLPをドットブロット装置を用いてブロッティングします。ブロッキングをブロックし、ウェスタンブロッティングについて上記で説明したのと同じ方法を用いて現像します。 8.エンドトキシン評価 リムルスアメーバ細胞ライセート(LAL)アッセイに基づくエンドトキシン試験システムを使用して、エンドトキシンレベルを定量化します。1 M トリス塩酸塩溶液とエンドトキシンフリー水を使用して、エンドトキシンフリーの25 mM Tris、pH 7.4、サンプルバッファーを調製します。注:通常、サンプルはこのサンプルバッファーを使用して希釈し、個々のサンプルに適した範囲を見つけるように希釈を調整する必要があります。ここでは、MOMP-tNLPサンプルをサンプルバッファーで500倍に希釈し、25 μLを0.05 EU/mLの感度でデバイスカートリッジの各ウェルにロードします。以下に説明するマウス研究で使用されるMOMP-tNLPおよび空のtNLPのエンドトキシンレベルは、サンプルに応じて0.4〜12 EU / μgタンパク質です。 9.凍結乾燥 MOMP-tNLPナノ粒子を凍結乾燥し、-20°Cで長期間(最大数年)使用できるように保存します。 凍結乾燥用のtNLPおよびMOMP-tNLP懸濁液を調製するには、凍結および凍結乾燥プロセス中に保護剤としてトレハロースを添加します。注:このプロセスは、さまざまなtNLP製剤7、8について広く検証されています。 MOMP-tNLP溶液の現在の容量を9で割って、0.1 Mトレハロースの最終濃度に達するために必要な滅菌エンドトキシンフリーの脱イオン水中の1 Mトレハロースの容量を取得します。最終容量をメモし、必要に応じてエンドトキシンフリーの15 mLまたは50 mLポリプロピレンチューブに分注します。 混合溶液をドライアイス上で凍結し、凍結乾燥機を使用して一晩凍結乾燥します。乾燥した製剤を必要になるまで-20°Cで保管してください。 エンドトキシンフリー水を使用して凍結乾燥tNLPを再構成します。凍結乾燥ケーキが完全に溶解して再水和されるまで静かに転がします。トレハロースを除去するには、3.5 kDaカットオフ透析膜を使用してPBSに対して溶液を透析します。 10.アジュバント添加 注:これらおよび他の同様のNLPベースのサブユニットワクチン製剤は、CpG-ODN1826およびFSL-1などの親油性アジュバントを容易に組み込むことができる。CpG-ODN1826は、5’コレステロール部分(5′-chol-C6)を有する完全なホスホロチオエート骨格を有する修飾クラスBCpGオリゴヌクレオチド(5′-tccatgacgttcctgacgtt-3′)です。CpG-ODN1826のtNLPへの結合は、コレステロール部分とtNLPのリン脂質二重層との間の疎水性相互作用によって媒介され、以前に報告されているように実証され、十分に特徴付けられています9,10。 これらの製剤に組み込む前に、コレステロール修飾CpGを逆相クロマトグラフィーで精製し、汚染されたエンドトキシンおよび未修飾のCpG分子を除去します。ベンダーから受領後、凍結乾燥された CpG 材料をエンドトキシンを含まない水で再水和し、10 mM トリエチルアンモニウムアセテート(TEAA)(移動相 A)とアセトニトリル(移動相 B)からなる分離勾配を使用して分取 C4 RP-HPLC カラムで精製します。メモ: 詳細については、 表 2 を参照してください。 コレステロール修飾CpGを含む画分をプールして凍結乾燥する。残留TEAAを完全に除去するには、CpGを15 mLのエンドトキシンフリー水で再構成し、3回再凍結乾燥します。 最終凍結乾燥後、エンドトキシンフリー水(最終CpG濃度>20 mg/mL)でCpGを再構成し、分注し、必要になるまで-80°Cで保存します。製剤に加えて、CpGを1〜2.5 mg / mLの濃度に希釈します。注:FSL-1は、ワクチングレードの凍結乾燥粉末として入手可能です。これは、1 mg/mLの濃度の滅菌およびエンドトキシンを含まない水を使用して再構成されます。ワクチンは筋肉内(i.m)に投与され、各用量は総容量50μLに10μgのMOMPを含む。 所望の製剤用量を達成するには、ナノ粒子をPBSに透析し、アジュバント添加前に遠心真空濃縮器を使用して濃縮します。サンプルが完全に乾燥しないように注意してください—遠心分離中は20〜30分ごとにサンプル量を確認してください。 バイオセーフティキャビネット内の無菌条件下でアジュバントを追加します。組み込みの成功を評価するには、分析サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって最終製剤とその成分を分析します。注:これらの調製では、PBSバッファー(流速0.5 mL/m)中でSECカラムを使用し、UV-visダイオードアレイ検出器を使用して溶出を検出しました。取り込みは、214および280nmにおけるアジュバント粒子の吸収を非アジュバント粒子の吸収と比較することによって評価した。 アジュバント投与されたMOMP-tNLPと空のtNLPは、動物の使用前に4°Cで最大14日間保管してください。新しいtNLP製剤の安定性を完全に評価するには、保存されたtNLPをSECで定期的に分析します。注:安定性は製剤ごとに異なります。 11.血清検査 雌の3週齢マウス(BALB/c、n = 6)を得る。 5μgのCpGおよび1μgのFSL-1(注射当たりの総容量= 50mL)でアジュバントしたMOMP-tNLPの形態のMOMP-tNLPの形態で、各後肢のマウスに筋肉内(すなわち)にワクチン接種する。 ワクチン接種後、胸骨臥を維持できるようになるまでマウスを観察します。 最初のワクチン接種(プライム)の4週間後、5μgのCpGおよび1μgのFSL-1(注射あたりの総容量= 50mL)でアジュバントしたMOMP-tNLPの形で10μgのMOMPを動物に2回目(ブースト)ワクチン接種する。 最初のワクチン接種後56日目に、血液を採取して抗体価を評価します。キシラジン(0.3 mg / 20 g体重)とケタミン(3.0 mg / 20 g体重)の溶液を注射してマウスに麻酔をかけることから始めます。前足と後足をつまんで、けいれんが発生しないことを確認します。麻酔中の目の乾燥を防ぐために、目の周りにワセリンを塗ります。 マイクロヘマトクリット毛細管を使用して、後眼窩神経叢を穿刺する。マイクロ遠心チューブに100 mLの血液を採取します。 採血後、麻酔から回復し、胸骨横臥を維持できるようになるまでマウスを観察します。 室温で30分間血栓を凝固させた後、2,000 × g で10分間スピンダウンします。血清を収集し、-80°Cで凍結します。 この時点で、 クラミジア・ムリダルム で動物に挑戦するか、安楽死させます。最初にキシラジン(0.3 mg / 20 g体重)とケタミン(3.0 mg / 20 g体重)の溶液を注射し、続いて頸部脱臼を注射することにより、マウスを安楽死させます。 MOMPに特異的な血清抗体を上記のようなウェスタンブロッティング技術を用いて試験する。すべての免疫マウスからマウス血清をプールし、1:5,000希釈で一次抗体の代わりにプール血清を使用する。