Este protocolo describe el uso de kits comerciales de expresión de proteínas libres de células para producir proteínas de membrana soportadas en nanodiscos que se pueden usar como antígenos en vacunas de subunidades.
Las vacunas de subunidades ofrecen ventajas sobre las vacunas más tradicionales inactivadas o atenuadas derivadas de células enteras en cuanto a seguridad, estabilidad y fabricación estándar. Para lograr una vacuna eficaz de subunidades basadas en proteínas, el antígeno proteico a menudo necesita adoptar una conformación similar a la nativa. Esto es particularmente importante para los antígenos de superficie de patógenos que son proteínas unidas a la membrana. Los métodos libres de células se han utilizado con éxito para producir proteínas de membrana funcionales correctamente plegadas a través de la cotraducción de partículas de nanolipoproteínas (NLP), comúnmente conocidas como nanodiscos.
Esta estrategia se puede utilizar para producir vacunas de subunidades que consisten en proteínas de membrana en un entorno unido a lípidos. Sin embargo, la producción de proteínas libres de células a menudo se limita a pequeña escala (<1 mL). La cantidad de proteína producida en las series de producción a pequeña escala suele ser suficiente para los estudios bioquímicos y biofísicos. Sin embargo, el proceso libre de células debe ampliarse, optimizarse y probarse cuidadosamente para obtener suficiente proteína para estudios de vacunas en modelos animales. Otros procesos implicados en la producción de vacunas, como la purificación, la adición de adyuvantes y la liofilización, deben optimizarse en paralelo. En este artículo se informa sobre el desarrollo de un protocolo ampliado para expresar, purificar y formular una vacuna de subunidades proteicas unidas a la membrana.
Las reacciones libres de células a escala requieren la optimización de las concentraciones y proporciones de plásmidos cuando se utilizan múltiples vectores de expresión de plásmidos, la selección de lípidos y la adición de adyuvantes para la producción de alto nivel de partículas de nanolipoproteínas formuladas. El método se demuestra aquí con la expresión de una proteína principal de membrana externa (MOMP) de clamidia, pero puede aplicarse ampliamente a otros antígenos de proteínas de membrana. La eficacia del antígeno puede evaluarse in vivo a través de estudios de inmunización para medir la producción de anticuerpos, como se demuestra aquí.
Los lisados procariotas o eucariotas para la expresión libre de células de proteínas están fácilmente disponibles como productos comerciales para sintetizar proteínas de interés (para una revisión completa, ver 1). Estos sistemas de expresión están disponibles a varias escalas y utilizan lisados de varios organismos, incluyendo E. coli, plantas de tabaco y cultivos de mamíferos. Los lisados libres de células ofrecen múltiples beneficios sobre los enfoques tradicionales de producción de proteínas recombinantes, incluida la facilidad de uso y la producción de proteínas robusta y rápida. Si bien estos enfoques se utilizan principalmente para producir proteínas solubles, este grupo ha sido pionero en un enfoque para su uso para expresar proteínas de membrana.
Este novedoso enfoque realiza modificaciones menores en los sistemas de expresión libre de células existentes mediante la inclusión de ADN que codifica dos productos proteicos para la expresión, una apolipoproteína y la proteína de membrana de interés. La apolipoproteína expresada (derivados de ApoA1 o ApoE4) interactúa con los lípidos añadidos al lisado libre de células para ensamblar espontáneamente (~20 nm) los NLP. Cuando se cotraducen con una proteína de membrana de interés, el NLP y la proteína de membrana forman un complejo de nanopartículas solubles en el que la proteína de membrana está incrustada dentro de la bicapa lipídica de NLP. Por lo tanto, la proteína de membrana es más accesible para aplicaciones posteriores, ya que está contenida en partículas solubles y discretas. Este enfoque puede producir complejos de proteínas oligoméricas funcionales dentro de la bicapa2 de NLP y puede producir el componente de antígeno de una vacuna de subunidad, que posteriormente se mezcla con adyuvantes lipofílicos para formar una vacuna de nanopartículas con antígeno colocalizado y adyuvante adecuado para la evaluación in vivo .
Este método actual es una modificación de un protocolo publicado anteriormente3. Las modificaciones clave se centran en el escalado de la reacción libre de células y la posterior purificación del complejo proteína-NLP. Una modificación adicional incluye la adición de un polímero anfifílico conocido como telodendrimer, que primero se mezcla con los lípidos antes de agregarlo a la reacción libre de células. La co-traducción de los plásmidos en presencia del telodendrimer y los lípidos produce un NLP de telodendrimer (tNLP). La adición del telodendrimer también ayuda a modular el tamaño y la monodispersidad de las nanopartículas de tNLPresultantes 4. Este protocolo está específicamente optimizado para estudios de vacunas a gran escala para producir una proteína antigénica de subunidad unida a la membrana, la clamidia MOMP 5,6. El método produce MOMP recombinante asociado con tNLP para formar un complejo MOMP-tNLP altamente soluble que retiene la oligomerización de MOMP. Una producción típica de escalado de 3 ml produce >1,5 mg de MOMP purificado. El MOMP-tNLP producido sin células es susceptible de adición adyuvante rápida para pruebas de inmunogenicidad in vivo.
La clamidia es la infección de transmisión sexual más común que afecta tanto a hombres como a mujeres. Aunque la investigación de la vacuna contra la clamidia abarca décadas, una vacuna segura y eficaz que pueda ampliarse a la producción masiva ha sido difícil de alcanzar13. La clamidia MOMP se considera el principal candidato como antígeno protector de la vacuna; sin embargo, el MOMP es altamente hidrofóbico y propenso a un plegado incorrecto14,15. Estudios posteriores han revelado que MOMP existe en estados oligoméricos que son esenciales para su inmunogenicidad11. Aquí se detalla un método validado de coexpresión libre de células que produce MOMP oligomérico formado dentro de la nanopartícula de tNLP como vacuna, con rendimientos de aproximadamente 1,5 mg de MOMP purificado por 3 ml de lisado. Este procedimiento totalmente cotejado puede ampliarse aún más para la producción industrial, lo que aumenta sus perspectivas como un enfoque útil para la generación de vacunas.
Hemos publicado previamente sobre el uso de la expresión libre de células para producir proteínas de membrana incrustadas en NLPs 3,16, así como la expresión en discos estabilizados con telodendrimer. Sin embargo, esta última técnica produjo partículas de proteína de membrana con mayor heterogeneidad y menor solubilidad. 4 Además, la inmunogenicidad de las partículas de MOMP-telodendrimer no está clara en comparación con las partículas de MOMP-tNLP6.
Este procedimiento se puede adaptar para ampliar la expresión de proteínas de membrana bacteriana que son candidatas prometedoras como antígenos para su uso en vacunas de subunidades. Este procedimiento no solo produce proteínas de membrana bacterianas solubilizadas, sino que la estructura general de nanopartículas es susceptible de modificaciones adicionales utilizando una variedad de adyuvantes de vacunas lipofílicas que incluyen, entre otros, CpG conjugado con una fracción de colesterol o FSL-1. La expresión de otros antígenos candidatos a partir de bacterias es factible, aunque puede ser necesario explorar parámetros como la temperatura de expresión, la elección de lípidos y el tipo de sistema de expresión para lograr rendimientos óptimos.
Además, la elección y la proporción de plásmidos son fundamentales en este proceso. Ambos plásmidos utilizados deben construirse a partir de la misma columna vertebral. Si los insertos tienen aproximadamente la misma longitud, las proporciones se pueden basar en la masa del plásmido agregado, como se describe aquí. Sin embargo, la proporción basada en moles dará resultados más reproducibles, especialmente al escalar las reacciones. Es posible que las proporciones que funcionan bien en reacciones a escala de pantalla (< 0,5 ml) no sean aplicables a reacciones más grandes y requieran una optimización adicional. Las proteínas que no son de membrana aún se pueden expresar utilizando kits libres de células, pero es posible que no requieran la nanopartícula lipídica (coexpresión) para producir un producto soluble. Además, si bien este protocolo describe el adyuvante con CpG y FSL-1, este sistema es susceptible de formulación con otros adyuvantes lipofílicos o mezcla con adyuvantes solubles según se desee.
Es esencial evitar la contaminación al configurar la reacción de expresión libre de células, ya que esto puede afectar los rendimientos. Cualquier aditivo para la reacción, incluidos los propios plásmidos, debe ser muy puro. Además, las proteínas expresadas solo deben estar en contacto con materiales y soluciones que estén libres de contaminación por endotoxinas. La contaminación por endotoxinas en las formulaciones candidatas puede dar lugar a resultados inconsistentes y espurios de los ensayos inmunológicos y puede ser perjudicial en cantidades suficientes. Si bien no se describe aquí, puede ser necesaria una purificación adicional después de la cromatografía de afinidad de níquel si se observan muchos contaminantes en los pasos de análisis posteriores, como a través de SDS-PAGE. Esto podría lograrse con SEC, aunque las condiciones pueden requerir una optimización formulación por formulación.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por la subvención R21 AI20925 y U19 AI144184 del Servicio de Salud Pública del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas. Este trabajo fue realizado bajo los auspicios del Departamento de Energía de los Estados Unidos por el Laboratorio Nacional Lawrence Livermore bajo el contrato DE-AC52-07NA27344 [LLNL-JRNL-822525, LLNL-VIDEO-832788].
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) as powder | Avanti Polar Lipids | 850345 | |
1.5 mL endotoxin-free centrifuge tubes | Eppendorf | 2600028 | |
1 M Trizma hydrochloride solution | Millipore Sigma | T2194 | |
Acetic acid, glacial, ACS reagent, ≥99.7% | Millipore Sigma | 695092 | |
Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
Buffer Dam for XCell SureLock | Life Technologies | EI0012 | |
C24 Incubator shaker | New Brunswick Scientific | ||
Cell-Free Expression System: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit | BiotechRabbit | BR1400201 | |
cOmplete His-Tag Purification Resin | Roche Molecular Diagnostics | 5893682001 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche Molecular Diagnostics | 4693132001 | |
CpG-ODN1826 | Biosearch Technologies | T9449 | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Millipore Sigma | 71509 | |
Dialysis tubes D-Tube Dialyzer Maxi | Millipore Sigma | 71508-3 | |
Disposable, polypropylene fritted columns 10 mL capacity | Bio-Rad | 7311550EDU | |
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (PBS) | Millipore Sigma | D8537 | |
Electrophoresis Power Supply | |||
Endosafe PTS cartridge | Thermo Fisher Scientific | NC9594798 | |
Endosafe-PTS Testing System | Charles River | ||
Gel wash solution: 10% methanol, 7% acetic acid | |||
HCl and NaOH solutions for pH adjustment | |||
HPLC with UV-vis diode array detector | Shimadzu | ||
HyClone HyPure culture-grade water | VWR | 82007-328 | |
iBlot 2 Dry Blotting System | Life Technologies | ||
iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF | Life Technologies | IB24001 | |
Image Studio V2.0 software | Li-COR Biiosciences | ||
Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
LI-COR Odyssey Fc imager | Li-COR Biiosciences | ||
Lyophilizer | Labconco | ||
Methanol (≥99.9%) | Millipore Sigma | 34860 | |
Microcentrifuge | |||
Microwave oven | |||
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | |
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP000202 | |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Life Technologies | NP0009 | |
Odyssey Blocking Buffer in TBS containing 0.2% Tween 20 | Li-COR Biosciences | 927-50000 | |
Orbital Shaker | |||
PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4) | |||
PEG5K-CA8 Telodendrimer (custom synthesis product) | |||
pIVEX2.4d vector | Roche Molecular Diagnostics | ||
Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
Primary antibody: MAb40 (monoclonal antibody to the variable domain 1 (VD1) of C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4 | |||
Primary antibody: MAbHIS, Penta-His antibody | Qiagen | 34660 | |
Probe sonicator | |||
Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
Qubit Protein Assay Kit | Life Technologies | Q33212 | |
Rainin Pipette tips: LTS 1000 µL | Rainin | 17002428 | |
Rainin Pipette tips: LTS 20 µL | Rainin | 17002429 | |
Rainin Pipette tips: LTS 200 µL | Rainin | 17002426 | |
Rainin Pipettes | Rainin | ||
Secondary antibody: IRDye 800CW goat (polyclonal) anti-mouse IgG (heavy and light) | Li-COR Biosciences | 926-32210 | |
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Life Technologies | LC5925 | |
Sodium chloride NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
Sodium phosphate monobasic NaH2PO4 | Millipore Sigma | S0751 | |
Superdex 200, 5/150 GL column | Cytiva | GE28-9909-45 | |
Synthetic diacylated lipoprotein-TLR2/6 FSL-1 | Invivogen | tlrl-fsl | |
SYPRO Ruby Protein Gel Stain | Life Technologies | S12001 | |
TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | |
UV light source | |||
Vacufuge Bench Top Centrifuge | Eppendorf | ||
Vortexer | |||
VWR 15 mL conicals (89039-666) | VWR | ||
VWR 50 mL conicals (89039-656) | VWR | ||
XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies ) | Life Technologies | EI0001 |