Production à l’échelle sans cellules et ajout d’adjuvant à une protéine recombinante de la membrane externe majeure de Chlamydia muridarum pour le développement d’un vaccin

Toutes les études sur les animaux ont été réalisées à l’Université de Californie à Irvine, dans des installations assurées par le Service de santé publique (PHS), conformément aux directives établies par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux. 1. Préparation de la verrerie REMARQUE : Tous les matériaux utilisés dans la production de formulations de qualité vaccinale pour les animaux sont exempts d’endotoxines. Pour détruire les endotoxines contaminantes, faites cuire de la verrerie nettoyée qui retiendra les tampons dans une étuve à 180 °C pendant 4 h. 2. Préparation du tampon Préparer 250 mL des tampons de purification par affinité Ni énumérés dans le tableau 1. Conservez-les à 4 °C jusqu’à 6 mois. 3. Préparation de la réaction Peser 20 mg de 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DMPC) dans un tube à centrifuger de 1,5 mL sans endotoxines. Dissoudre dans 1 mL d’eau exempte d’endotoxines, sonder au moins quatre fois à 6 A pendant 1 min, avec 1 minute de pause entre les deux, jusqu’à ce qu’il soit clair. Retirer tout métal contaminant de la sonde par centrifugation à 13 000 × g pendant 2 min à 22 °C, puis transférer le lipide solubilisé dans un nouveau tube exempt d’endotoxines de 1,5 mL. Peser 1 mg de télodendrimère PEG5k-CA8 dans un tube sans endotoxines de 1,5 mL. Dissoudre dans de l’eau exempte d’endotoxines jusqu’à une concentration de 20 mg/mL. Vortex jusqu’à dissolution complète et diluer à 2 mg/mL. Dans un nouveau tube exempt d’endotoxines, combiner 210 μL de solution DMPC à 20 mg/mL avec 210 μL de solution de télodendrimère à 2 mg/mL. 4. Production sans cellules de MOMP-tNLP pour les formulations de vaccins sous-unitaires Préparer des MOMP-tNLP en utilisant des méthodes sans cellules modifiées à partir d’un protocole précédemment publié5.Deux heures avant de mettre en place la réaction acellulaire, ouvrez le kit d’expression procaryote des protéines acellulaires et décongelez l’un des tampons de reconstitution. Une fois décongelé, ajoutez un comprimé de cocktail d’inhibiteurs de protéase sans EDTA et laissez-le se dissoudre complètement. Suivez ce protocole à l’aide d’un kit conçu pour exécuter des réactions de 5 x 1 mL.REMARQUE : Une production de mise à l’échelle typique est de 3 x 1 mL.Pour chaque réaction de 1 mL, ajouter 525 μL de tampon de reconstitution dans le flacon de lysat d’E. coli et rouler doucement pour dissoudre. Ajouter 250 μL de tampon de reconstitution dans le flacon contenant des additifs réactionnels (p. ex. ATP, GTP) et rouler doucement pour dissoudre. Ajouter 8,1 mL de tampon de reconstitution dans le flacon d’alimentation réactionnelle, reboucher avec un bouchon en caoutchouc (prendre soin de ne pas toucher l’intérieur du bouchon en caoutchouc) et inverser/rouler doucement pour dissoudre. Ajouter 3 ml de tampon de reconstitution dans le flacon de mélange d’acides aminés, reboucher avec un bouchon en caoutchouc et inverser/rouler doucement pour dissoudre.REMARQUE: Veillez à ne pas toucher l’intérieur du bouchon en caoutchouc car cela pourrait entraîner une contamination. Ajouter 1,8 mL de tampon de reconstitution dans le flacon de méthionine, rouler doucement pour dissoudre, puis conserver sur de la glace jusqu’à utilisation. Préparer la solution réactionnelle.Dans le flacon de lysat d’E. coli , ajouter 225 μL de mélange réactionnel reconstitué, 270 μL de mélange d’acides aminés reconstitués sans méthionine et 30 μL de méthionine reconstituée. De plus, ajoutez 400 μL du mélange DMPC/télodendrimère, 15 μg de plasmide MOMP et 0,6 μg de plasmide Δ49ApoA1. Rouler/agiter doucement pour mélanger.REMARQUE: Assurez-vous que les deux plasmides sont construits à partir du même squelette plasmidique. Ne pas vortex. Prélever 20 μL de la solution totale et la mettre de côté dans un tube de 1,5 mL pour la réaction de contrôle exprimant la GFP (voir ci-dessous). Préparer la solution alimentaire. Dans le flacon de mélange d’aliments, ajouter 2,65 mL de mélange d’acides aminés reconstitués sans méthionine et 300 μL de méthionine reconstituée. Rouler/agiter doucement pour dissoudre.REMARQUE : À ce stade, le tampon de reconstitution inutilisé et la méthionine peuvent être retournés au congélateur pour entreposage. Transférer 1 mL de la solution réactionnelle dans la chambre de réaction interne fournie dans la trousse de réaction sans cellule et sceller une fois remplie. Transférer 10 mL de la solution d’alimentation dans la chambre extérieure de la cuve de réaction et du joint.REMARQUE: Ne remplissez pas trop les chambres! La présence de bulles d’air au sommet de la chambre de réaction interne et de la chambre d’alimentation interne affectera négativement la réaction. Toute solution réactionnelle restante peut être placée dans un tube de 1,5 mL et laissée mélanger le long du récipient principal. Ajouter 0,5 μL du plasmide témoin GFP (0,5 mg/mL) au mélange réactionnel de 20 μL précédemment aliquote.REMARQUE: De nombreux kits sont fournis avec un plasmide de contrôle à des fins de contrôle de la qualité. La plupart des plasmides exprimant la GFP avec un promoteur T7 et un site de liaison au ribosome E. coli (RBS) peuvent également être utilisés comme plasmide témoin. Placer la réaction dans un agitateur à 300 tr/min, 30 °C pendant 18 h maximum. Pour vérifier que la réaction a réussi, utilisez une source de lumière UV pour vérifier la fluorescence due à la synthèse de la GFP de contrôle (Figure 1A) après aussi peu que 15 minutes d’incubation.REMARQUE: Ces conditions, en particulier la température, peuvent devoir être optimisées pour l’expression d’autres protéines membranaires. 5. Purification MOMP-tNLP Utiliser la chromatographie d’affinité au nickel immobilisée pour purifier le complexe de nanoparticules MOMP-tNLP du mélange réactionnel acellulaire en utilisant le His-tag sur la protéine Δ49ApoA1.Transférer 1 mL d’une suspension à 50 % de résine de purification His-Tag dans une colonne de chromatographie jetable de 10 mL et l’équilibrer avec 3 mL de tampon de liaison. Laissez le tampon s’égoutter, bouchez la sortie et ajoutez 250 μL de tampon de liaison à la résine. Avant d’ajouter la réaction acellulaire à la colonne, économisez 20 μL pour une analyse ultérieure par SDS-PAGE. Mélanger la réaction acellulaire avec la résine équilibrée et l’incuber sur une bascule de laboratoire à 4 °C pendant 1 h. Décapsulez la colonne, lavez le bouchon avec 500 μL de tampon de liaison supplémentaire et ajoutez ce liquide au reste de la colonne. Recueillir le flux liquide de la colonne pour une analyse ultérieure par SDS-PAGE. Laver la colonne avec 1 mL de tampon de lavage contenant 20 mM d’imidazole six fois et recueillir les fractions. Veillez à ne pas laisser la résine sécher entre les lavages. Au deuxième lavage, agiter vigoureusement la résine en la pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette de 1 mL. Éluer les MOMP-tNLP dans six fractions de 300 μL du tampon Elution 1 (contenant 250 mM d’imidazole), suivi d’une élution finale avec 300 μL de tampon Elution 2 (contenant 500 mM d’imidazole). Lors de la deuxième élution, agiter vigoureusement la résine en la pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette de 1 mL. 6. Analyse par SDS-PAGE NOTE: Toutes les fractions d’élution doivent être analysées par SDS-PAGE pour dépister la quantité et la pureté de la protéine d’intérêt. Charge de 1 μL chacun du lysat total et de l’écoulement, puis de 5 μL pour tous les lavages et fractions d’élution recueillis.Mélanger les aliquotes du MOMP–tNLP élué, des lavages, de l’écoulement continu et du lysat total avec 4x tampon de chargement d’échantillons SDS-PAGE. Mélanger et dénaturer thermiquement les échantillons avec un agent réducteur d’échantillon 10x, sauf indication contraire. Analyser les fractions par électrophorèse sur gel en utilisant des gels Bis-Tris SDS-PAGE de 1,0 mm, 4 à 12 %, avec 1x tampon MES-SDS, ainsi qu’un étalon de poids moléculaire approprié. Faites couler les gels pendant 35 min à 200 V. Colorer les gels selon les instructions du fabricant.Retirez le gel de la cassette et placez-le dans 60 ml de coloration de gel. Cuire le gel au micro-ondes dans la tache de gel pendant 30 s et bercer doucement le récipient pendant 30 s pour répartir la chaleur uniformément. Micro-ondes le gel dans la tache à 80–85 °C pendant encore 30 s et placer le gel sur un agitateur orbital pour basculer pendant 5 min. Micro-ondes le gel une troisième fois pendant 30 s, puis revenir à l’agitateur orbital pour basculer pendant encore 23 minutes. Transférer le gel dans un récipient propre et laver dans 100 mL de solution de lavage (10 % de méthanol, 7 % d’acide acétique) pendant 30 min.REMARQUE: Il s’agit d’une étape critique car il est essentiel d’éviter de chauffer la solution de lavage. Ne pas le faire peut entraîner des taches d’arrière-plan et des irrégularités dans l’image finale du gel. Après le lavage, rincer le gel à l’eau ultrapure deux fois pendant 5 minutes chacun. Imagez les gels à l’aide d’un imageur de gel à 600 nm (Figure 2). Utilisez SDS-PAGE pour quantifier la quantité de protéines individuelles dans la solution de nanoparticules s’il existe une norme protéique à des fins de comparaison.NOTA: Dans cet exemple, les dilutions en série de MOMP exprimés par recombinaison sont résolues par SDS-PAGE et les densités des bandes sont quantifiées à l’aide du logiciel de l’instrument. Générez une courbe standard en utilisant les densités des bandes MOMP. Résolvez les échantillons MOMP-tNLP sur le même gel SDS-PAGE et calculez la composante MOMP des particules à l’aide de la courbe standard MOMP (Figure 3). 7. Western et dot blots et stockage Pour le transfert Western, résoudre les échantillons par SDS-PAGE et transférer les gels à l’aide d’un système commercial de transfert à sec avec des réglages standard selon le protocole du fabricant.Retirer les blots de la pile une fois le transfert terminé et incuber chaque transfert pendant une nuit à 4 °C dans un tampon de blocage approprié contenant 0,2% de Tween 20 et 0,5 mg / mL MAb40 ou 0,2 mg / mL d’anticorps anti-His-His dirigé contre le His-tag de la protéine Δ49ApoA1.REMARQUE : Les dilutions d’anticorps utilisées pour le buvard sont de 1:1 000 pour MAb40 et de 1:500–1 000 pour les anticorps MAbHIS. Laver chaque tache 3 fois pendant 5 minutes avec du PBS-T (1x PBS, 0,2% Tween 20, pH 7,4). Incuber les transferts pendant 1 h dans un tampon de blocage contenant un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore (p. ex. IRDye) à une dilution de 1:10 000. Relaver les taches 3 fois pendant 5 min avec PBS-T. Utilisez un imageur à fluorescence pour imager les taches après le lavage final. Pour les taches de points, transférer 3 μg de MOMP-tNLP purifié et tNLP vide à l’aide d’un appareil de transfert de points. Bloquer et développer les transferts en utilisant les mêmes méthodes décrites ci-dessus pour le transfert Western. 8. Évaluation des endotoxines Quantifier les niveaux d’endotoxines à l’aide d’un système de test d’endotoxines basé sur le test Limulus Amebocyte Lysat (LAL). Préparer un tampon d’échantillon 25 mM Tris 25 mM, pH 7,4, sans endotoxines en utilisant une solution de chlorhydrate de Tris 1 M et de l’eau exempte d’endotoxines.NOTA : En règle générale, les échantillons doivent être dilués à l’aide de ce tampon d’échantillonnage, et les dilutions ajustées pour trouver la plage appropriée pour les échantillons individuels. Ici, les échantillons MOMP-tNLP sont dilués 500 fois dans un tampon d’échantillon et 25 μL sont chargés dans chaque puits d’une cartouche de dispositif avec une sensibilité de 0,05 EU/mL. Les niveaux d’endotoxines de MOMP-tNLP et de tNLP vide utilisés dans les études sur la souris décrites ci-dessous se situent entre 0,4 et 12 protéines EU/μg selon l’échantillon. 9. Lyophilisation Lyophiliser et stocker les nanoparticules MOMP-tNLP pour une utilisation à long terme (jusqu’à des années) à -20 °C. Pour préparer les suspensions tNLP et MOMP-tNLP pour la lyophilisation, ajoutez du tréhalose comme protecteur pendant le processus de congélation et de lyophilisation.NOTE: Ce processus a été largement validé pour une variété de formulations tNLP 7,8. Diviser le volume actuel de la solution MOMP-tNLP par 9 pour obtenir le volume de tréhalose 1 M dans de l’eau désionisée stérile, exempte d’endotoxines, nécessaire pour atteindre une concentration finale de 0,1 M de tréhalose. Prenez note du volume final et aliquote dans des tubes en polypropylène de 15 mL ou 50 mL sans endotoxines, selon vos besoins. Congeler la solution mélangée sur de la glace sèche et la lyophiliser pendant la nuit à l’aide d’un lyophilisateur. Conservez les formulations séchées à -20 °C jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires. Reconstituer les TNLP lyophilisées à l’aide d’eau exempte d’endotoxines. Rouler doucement jusqu’à ce que le gâteau lyophilisé soit complètement dissous et réhydraté. Pour éliminer le tréhalose, dialyser la solution contre le PBS à l’aide d’une membrane de dialyse de coupure de 3,5 kDa. 10. Ajout d’adjuvant REMARQUE : Ces formulations vaccinales sous-unitaires à base de NLP et d’autres similaires peuvent facilement incorporer des adjuvants lipophiles tels que le CpG-ODN1826 et le FSL-1. Le CpG-ODN1826 est un oligonucléotide CpG de classe B modifié (5′-tccatgacgttcctgacgtt-3′) avec un squelette phosphorothioate complet présentant un groupement 5′ cholestérol (5′-chol-C6). La conjugaison de CpG-ODN1826 aux tNLP est médiée par les interactions hydrophobes entre la fraction cholestérol et la bicouche phospholipide de la TNP et a été démontrée et bien caractérisée, comme indiqué précédemment 9,10. Avant l’incorporation dans ces formulations, purifier le CpG modifié par chromatographie en phase inverse pour éliminer l’endotoxine contaminante ainsi que toutes les molécules de CpG non modifiées.Dès réception du fournisseur, réhydrater le matériau CpG lyophilisé dans de l’eau exempte d’endotoxines et le purifier sur une colonne PCLHP C4 RP préparative à l’aide d’un gradient de séparation constitué de 10 mM d’acétate de triéthylammonium (TEAA) (phase mobile A) et d’acétonitrile (phase mobile B).REMARQUE : Des détails supplémentaires sont disponibles dans le tableau 2. Pool et lyophiliser les fractions contenant du CpG modifié par le cholestérol. Pour assurer l’élimination complète du TEAA résiduel, reconstituer le CpG avec 15 mL d’eau exempte d’endotoxines et le relyophiliser trois fois. Après la lyophilisation finale, reconstituer le CpG dans de l’eau exempte d’endotoxines (concentration finale de CpG de >20 mg/mL), aliquote, et le conserver à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit nécessaire. Pour ajouter aux formulations, diluer le CpG à une concentration de 1 à 2,5 mg / mL.REMARQUE : Le FSL-1 est offert sous forme de poudre lyophilisée de qualité vaccinale. Celle-ci est reconstituée à l’aide d’eau stérile et exempte d’endotoxines à une concentration de 1 mg/mL. Le vaccin est administré par voie intramusculaire (i.m.), chaque dose contenant 10 μg de MOMP dans un volume total de 50 μL. Pour obtenir la dose de formulation souhaitée, dialyser les nanoparticules dans du PBS et les concentrer à l’aide d’un concentrateur centrifuge sous vide avant l’ajout d’adjuvant. Prenez soin lorsque vous faites cela d’éviter un séchage complet de l’échantillon – vérifiez le volume de l’échantillon toutes les 20 à 30 minutes pendant la centrifugation. Ajouter l’adjuvant dans des conditions stériles dans une enceinte de biosécurité. Pour évaluer la réussite de l’incorporation, analyser les formulations finales et leurs composants par chromatographie analytique taille-exclusion (SEC).NOTA : Pour ces préparations, une colonne SEC a été utilisée dans le tampon PBS (débit de 0,5 mL/m) et l’élution a été détectée à l’aide d’un détecteur à matrice de diodes UV-vis. L’incorporation a été évaluée en comparant l’absorption des particules adjuvantées à celle des particules sans adjuvant à 214 et 280 nm. Conservez le MOMP-tNLP avec adjuvant et videz la TNLP à 4 °C avant l’utilisation de l’animal pendant une période allant jusqu’à 14 jours. Pour évaluer pleinement la stabilité d’une nouvelle formulation de TNLP, analyser périodiquement les tNLP stockés par SEC.REMARQUE: La stabilité varie d’une formulation à l’autre. 11. Analyses sériques Obtenir des souris femelles âgées de 3 semaines (BALB/c, n = 6). Vacciner les souris par voie intramusculaire (i.m.) dans chaque membre postérieur avec 10 μg de MOMP sous forme d’adjuvant MOMP-tNLP avec 5 μg de CpG et 1 μg de FSL-1 (volume total par injection = 50 mL). Après la vaccination, observez les souris jusqu’à ce qu’elles soient capables de maintenir une position couchée sternale. Quatre semaines après la vaccination initiale (prime), vacciner les animaux une deuxième fois (boost) avec 10 μg de MOMP sous forme d’adjuvant MOMP-tNLP avec 5 μg de CpG et 1 μg de FSL-1 (volume total par injection = 50 mL). Le jour 56 après la vaccination initiale, prélever du sang pour évaluer les titres d’anticorps. Commencez par anesthésier les souris en injectant par injection une solution de xylazine (0,3 mg/20 g de poids corporel) et de kétamine (3,0 mg/20 g de poids corporel). Pincez les pattes avant et postérieures pour vous assurer qu’il n’y a pas de secousses. Appliquez de la vaseline autour des yeux pour prévenir la sécheresse oculaire pendant l’anesthésie. À l’aide d’un tube capillaire micro-hématocrite, percer le plexus rétro-orbitaire. Prélever 100 mL de sang dans un tube à microcentrifugeuse. Après la collecte de sang, observez les souris jusqu’à ce qu’elles se remettent de l’anesthésie et puissent maintenir une position couchée sternale. Laissez le sang coaguler à température ambiante pendant 30 minutes, puis tournez vers le bas à 2 000 × g pendant 10 minutes. Prélever le sérum et le congeler à -80 °C. À ce moment-là, défiez les animaux avec Chlamydia muridarum ou euthanasiez-les. Euthanasier les souris en injectant d’abord par injection intraveineuse une solution de xylazine (0,3 mg/20 g de poids corporel) et de kétamine (3,0 mg/20 g de poids corporel) suivie d’une luxation cervicale. Testez les anticorps sériques spécifiques de MOMP en utilisant les techniques de transfert Western décrites ci-dessus. Mélangez les sérums de souris de toutes les souris immunisées et utilisez le sérum combiné à la place d’un anticorps primaire à une dilution de 1:5 000.