Ce protocole décrit l’utilisation de kits commerciaux d’expression protéique acellulaire pour produire des protéines membranaires supportées dans des nanodisques qui peuvent être utilisées comme antigènes dans les vaccins sous-unitaires.
Les vaccins sous-unitaires offrent des avantages par rapport aux vaccins inactivés ou atténués plus traditionnels dérivés de cellules entières en termes d’innocuité, de stabilité et de fabrication standard. Pour obtenir un vaccin sous-unitaire à base de protéines efficace, l’antigène protéique doit souvent adopter une conformation de type natif. Ceci est particulièrement important pour les antigènes pathogènes de surface qui sont des protéines liées à la membrane. Des méthodes acellulaires ont été utilisées avec succès pour produire des protéines membranaires fonctionnelles correctement repliées grâce à la co-traduction de particules de nanolipoprotéines (PNL), communément appelées nanodisques.
Cette stratégie peut être utilisée pour produire des vaccins sous-unitaires constitués de protéines membranaires dans un environnement lié aux lipides. Cependant, la production de protéines acellulaires est souvent limitée à petite échelle (<1 mL). La quantité de protéines produites en petites séries est généralement suffisante pour les études biochimiques et biophysiques. Cependant, le processus sans cellules doit être mis à l’échelle, optimisé et soigneusement testé pour obtenir suffisamment de protéines pour les études vaccinales sur des modèles animaux. D’autres processus impliqués dans la production de vaccins, tels que la purification, l’ajout d’adjuvants et la lyophilisation, doivent être optimisés en parallèle. Cet article rend compte de l’élaboration d’un protocole à grande échelle pour exprimer, purifier et formuler un vaccin sous-unitaire protéique lié à la membrane.
Les réactions acellulaires à grande échelle nécessitent une optimisation des concentrations et des rapports plasmidiques lors de l’utilisation de vecteurs d’expression plasmidique multiples, de la sélection des lipides et de l’ajout d’adjuvants pour la production à haut niveau de particules de nanolipoprotéines formulées. La méthode est démontrée ici avec l’expression d’une protéine de membrane externe majeure (MOMP) chlamydiale mais peut être largement appliquée à d’autres antigènes de protéines membranaires. L’efficacité des antigènes peut être évaluée in vivo au moyen d’études d’immunisation pour mesurer la production d’anticorps, comme démontré ici.
Les lysats procaryotes ou eucaryotes pour l’expression cellulaire de protéines sont facilement disponibles en tant que produits commerciaux pour synthétiser des protéines d’intérêt (pour une revue complète, voir 1). Ces systèmes d’expression sont disponibles à différentes échelles et utilisent des lysats de divers organismes, y compris E. coli, les plants de tabac et les cultures de mammifères. Les lysats acellulaires offrent de multiples avantages par rapport aux approches traditionnelles de production de protéines recombinantes, notamment la facilité d’utilisation et la production robuste et rapide de protéines. Bien que ces approches soient principalement utilisées pour produire des protéines solubles, ce groupe a mis au point une approche pour leur utilisation pour exprimer les protéines membranaires.
Cette nouvelle approche apporte des modifications mineures aux systèmes d’expression acellulaires existants en incluant de l’ADN codant pour deux produits protéiques pour l’expression, une apolipoprotéine et la protéine membranaire d’intérêt. L’apolipoprotéine exprimée (dérivés de l’ApoA1 ou de l’ApoE4) interagit avec les lipides ajoutés au lysat acellulaire pour assembler spontanément (~20 nm) les PNL. Lorsqu’ils sont co-traduits avec une protéine membranaire d’intérêt, la protéine NLP et la protéine membranaire forment un complexe de nanoparticules solubles dans lequel la protéine membranaire est intégrée dans la bicouche lipidique NLP. Ainsi, la protéine membranaire est plus accessible pour les applications en aval, car elle est contenue dans des particules solubles et discrètes. Cette approche peut produire des complexes protéiques oligomères fonctionnels dans la bicouche2 NLP et peut produire le composant antigénique d’un vaccin sous-unitaire, qui est ensuite mélangé avec des adjuvants lipophiles pour former un vaccin à nanoparticules comportant un antigène colocalisé et un adjuvant adapté à l’évaluation in vivo .
Cette méthode actuelle est modifiée à partir d’un protocole3 précédemment publié. Les modifications clés sont axées sur la mise à l’échelle de la réaction acellulaire et la purification ultérieure du complexe protéique-NLP. Une autre modification comprend l’ajout d’un polymère amphiphile connu sous le nom de télodendrimère, qui est d’abord mélangé avec les lipides avant d’être ajouté à la réaction acellulaire. La co-traduction des plasmides en présence du télodendrimère et des lipides produit un NLP télodendrimère (tNLP). L’ajout du télodendrimère permet également de moduler la taille et la monodispersité des nanoparticules de tNLPrésultantes 4. Ce protocole est spécifiquement optimisé pour les études vaccinales à grande échelle afin de produire une protéine d’antigène sous-unitaire liée à la membrane, chlamydia MOMP 5,6. La méthode produit un MOMP recombinant associé à la TNLP pour former un complexe MOMP-tNLP hautement soluble qui conserve l’oligomérisation de MUT. Une production typique de 3 ml à l’échelle donne >1,5 mg de MOMP purifié. Le MOMP-tNLP produit sans cellules se prête à une addition rapide d’adjuvant pour les tests d’immunogénicité in vivo.
La chlamydia est l’infection sexuellement transmissible la plus courante qui touche les hommes et les femmes. Bien que la recherche sur les vaccins contre la chlamydia s’étende sur des décennies, un vaccin sûr et efficace pouvant être mis à l’échelle de la production de masse est resté insaisissable13. Le MOMP chlamydia est considéré comme le principal candidat en tant qu’antigène vaccinal protecteur; cependant, MOMP est très hydrophobe et sujet à un pliage incorrect14,15. D’autres études ont révélé que le MOMP existe dans des états oligomères essentiels à son immunogénicité11. Détaillé ici est une méthode de co-expression validée et sans cellules qui produit un MOMP oligomère formé dans une nanoparticule tNLP en tant que vaccin, avec des rendements d’environ 1,5 mg de MOMP purifié par 3 ml de lysat. Cette procédure entièrement collationnée peut être mise à l’échelle pour la production industrielle, ce qui augmente ses perspectives en tant qu’approche utile pour la génération de vaccins.
Nous avons déjà publié sur l’utilisation de l’expression acellulaire pour produire des protéines membranaires intégrées dans les PNL 3,16, ainsi que l’expression dans des disques stabilisés par les télodendrimères. Cependant, cette dernière technique a produit des particules membrane-protéine avec une plus grande hétérogénéité et une solubilité plus faible. 4 De plus, l’immunogénicité des particules MOMP-télodendrimères n’est pas claire par rapport aux particules MOMP-tNLP6.
Cette procédure peut être adaptée pour intensifier l’expression des protéines membranaires bactériennes qui sont des candidats prometteurs en tant qu’antigènes pour une utilisation dans les vaccins sous-unitaires. Non seulement cette procédure produit une protéine membranaire bactérienne solubilisée, mais la structure globale des nanoparticules est susceptible d’être modifiée à l’aide d’une variété d’adjuvants vaccinaux lipophiles, y compris, mais sans s’y limiter, le CpG conjugué à une fraction cholestérol ou FSL-1. L’expression d’autres antigènes candidats à partir de bactéries est possible, bien que des paramètres tels que la température d’expression, le choix des lipides et le type de système d’expression puissent devoir être explorés pour obtenir des rendements optimaux.
De plus, le choix et le rapport plasmidique sont essentiels dans ce processus. Les deux plasmides utilisés doivent être construits à partir de la même colonne vertébrale. Si les inserts ont approximativement la même longueur, les rapports peuvent être basés sur la masse du plasmide ajouté, comme décrit ici. Cependant, le ratio basé sur les taupes donnera des résultats plus reproductibles, en particulier lors de la mise à l’échelle des réactions. Les rapports qui fonctionnent bien dans les réactions à l’échelle du crible (< 0,5 mL) peuvent ne pas être applicables aux réactions plus importantes et peuvent nécessiter une optimisation supplémentaire. Les protéines non membranaires peuvent toujours être exprimées à l’aide de kits acellulaires, mais peuvent ne pas nécessiter la nanoparticule lipidique (co-expression) pour produire un produit soluble. De plus, bien que ce protocole décrive l’adjuvant avec CpG et FSL-1, ce système se prête à la formulation avec d’autres adjuvants lipophiles ou au mélange avec des adjuvants solubles selon les besoins.
Il est essentiel d’éviter la contamination lors de la mise en place de la réaction d’expression acellulaire car cela peut affecter les rendements. Tous les additifs à la réaction, y compris les plasmides eux-mêmes, doivent être très purs. De plus, les protéines exprimées ne doivent être en contact qu’avec des matériaux et des solutions exempts de contamination par les endotoxines. La contamination par les endotoxines dans les formulations candidates peut entraîner des résultats incohérents et fallacieux des tests immunologiques et peut être nocive en quantités suffisantes. Bien que cela ne soit pas décrit ici, une purification supplémentaire après chromatographie d’affinité au nickel peut être nécessaire si de nombreux contaminants sont observés lors d’étapes d’analyse ultérieures, telles que SDS-PAGE. Cela pourrait être accompli avec la SEC, bien que les conditions puissent nécessiter une optimisation formulation par formulation.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par la subvention R21 AI20925 et U19 AI144184 du Service de santé publique de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses. Ces travaux ont été réalisés sous les auspices du département de l’Énergie des États-Unis par le Lawrence Livermore National Laboratory dans le cadre du contrat DE-AC52-07NA27344 [LLNL-JRNL-822525, LLNL-VIDEO-832788].
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) as powder | Avanti Polar Lipids | 850345 | |
1.5 mL endotoxin-free centrifuge tubes | Eppendorf | 2600028 | |
1 M Trizma hydrochloride solution | Millipore Sigma | T2194 | |
Acetic acid, glacial, ACS reagent, ≥99.7% | Millipore Sigma | 695092 | |
Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
Buffer Dam for XCell SureLock | Life Technologies | EI0012 | |
C24 Incubator shaker | New Brunswick Scientific | ||
Cell-Free Expression System: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit | BiotechRabbit | BR1400201 | |
cOmplete His-Tag Purification Resin | Roche Molecular Diagnostics | 5893682001 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche Molecular Diagnostics | 4693132001 | |
CpG-ODN1826 | Biosearch Technologies | T9449 | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Millipore Sigma | 71509 | |
Dialysis tubes D-Tube Dialyzer Maxi | Millipore Sigma | 71508-3 | |
Disposable, polypropylene fritted columns 10 mL capacity | Bio-Rad | 7311550EDU | |
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (PBS) | Millipore Sigma | D8537 | |
Electrophoresis Power Supply | |||
Endosafe PTS cartridge | Thermo Fisher Scientific | NC9594798 | |
Endosafe-PTS Testing System | Charles River | ||
Gel wash solution: 10% methanol, 7% acetic acid | |||
HCl and NaOH solutions for pH adjustment | |||
HPLC with UV-vis diode array detector | Shimadzu | ||
HyClone HyPure culture-grade water | VWR | 82007-328 | |
iBlot 2 Dry Blotting System | Life Technologies | ||
iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF | Life Technologies | IB24001 | |
Image Studio V2.0 software | Li-COR Biiosciences | ||
Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
LI-COR Odyssey Fc imager | Li-COR Biiosciences | ||
Lyophilizer | Labconco | ||
Methanol (≥99.9%) | Millipore Sigma | 34860 | |
Microcentrifuge | |||
Microwave oven | |||
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | |
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP000202 | |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Life Technologies | NP0009 | |
Odyssey Blocking Buffer in TBS containing 0.2% Tween 20 | Li-COR Biosciences | 927-50000 | |
Orbital Shaker | |||
PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4) | |||
PEG5K-CA8 Telodendrimer (custom synthesis product) | |||
pIVEX2.4d vector | Roche Molecular Diagnostics | ||
Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
Primary antibody: MAb40 (monoclonal antibody to the variable domain 1 (VD1) of C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4 | |||
Primary antibody: MAbHIS, Penta-His antibody | Qiagen | 34660 | |
Probe sonicator | |||
Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
Qubit Protein Assay Kit | Life Technologies | Q33212 | |
Rainin Pipette tips: LTS 1000 µL | Rainin | 17002428 | |
Rainin Pipette tips: LTS 20 µL | Rainin | 17002429 | |
Rainin Pipette tips: LTS 200 µL | Rainin | 17002426 | |
Rainin Pipettes | Rainin | ||
Secondary antibody: IRDye 800CW goat (polyclonal) anti-mouse IgG (heavy and light) | Li-COR Biosciences | 926-32210 | |
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Life Technologies | LC5925 | |
Sodium chloride NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
Sodium phosphate monobasic NaH2PO4 | Millipore Sigma | S0751 | |
Superdex 200, 5/150 GL column | Cytiva | GE28-9909-45 | |
Synthetic diacylated lipoprotein-TLR2/6 FSL-1 | Invivogen | tlrl-fsl | |
SYPRO Ruby Protein Gel Stain | Life Technologies | S12001 | |
TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | |
UV light source | |||
Vacufuge Bench Top Centrifuge | Eppendorf | ||
Vortexer | |||
VWR 15 mL conicals (89039-666) | VWR | ||
VWR 50 mL conicals (89039-656) | VWR | ||
XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies ) | Life Technologies | EI0001 |