إنتاج متدرج خال من الخلايا وإضافة مساعدة إلى بروتين الغشاء الخارجي الرئيسي المؤتلف من الكلاميديا موريداروم لتطوير اللقاح
Summary
يصف هذا البروتوكول استخدام مجموعات تعبير البروتين التجارية الخالية من الخلايا لإنتاج بروتينات غشائية مدعومة في القرص النانوي يمكن استخدامها كمستضدات في لقاحات الوحدات الفرعية.
Abstract
توفر لقاحات الوحدات الفرعية مزايا على اللقاحات التقليدية المعطلة أو الموهنة المشتقة من الخلايا الكاملة في السلامة والاستقرار والتصنيع القياسي. لتحقيق لقاح فعال قائم على البروتين ، غالبا ما يحتاج مستضد البروتين إلى تبني شكل يشبه الأصلي. وهذا مهم بشكل خاص لمولدات الضد السطحية المسببة للأمراض التي هي بروتينات محاطة بغشاء. تم استخدام الطرق الخالية من الخلايا بنجاح لإنتاج بروتين غشاء وظيفي مطوي بشكل صحيح من خلال الترجمة المشتركة لجزيئات البروتين الدهني النانوي (NLPs) ، والمعروفة باسم الأقراص النانوية.
يمكن استخدام هذه الاستراتيجية لإنتاج لقاحات الوحدة الفرعية التي تتكون من بروتينات غشائية في بيئة مرتبطة بالدهون. ومع ذلك ، غالبا ما يقتصر إنتاج البروتين الخالي من الخلايا على نطاق صغير (<1 مل). عادة ما تكون كمية البروتين المنتجة في عمليات الإنتاج على نطاق صغير كافية للدراسات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية. ومع ذلك ، يجب توسيع نطاق العملية الخالية من الخلايا وتحسينها واختبارها بعناية للحصول على ما يكفي من البروتين لدراسات اللقاح في النماذج الحيوانية. يجب تحسين العمليات الأخرى التي ينطوي عليها إنتاج اللقاح ، مثل التنقية وإضافة المواد المساعدة والتجفيد ، بالتوازي. تشير هذه الورقة إلى تطوير بروتوكول موسع للتعبير عن لقاح الوحدة الفرعية للبروتين المرتبط بالغشاء وتنقيته وصياغته.
تتطلب التفاعلات الخالية من الخلايا الموسعة تحسين تركيزات ونسب البلازميد عند استخدام ناقلات تعبير البلازميد المتعددة ، واختيار الدهون ، وإضافة المواد المساعدة لإنتاج عالي المستوى لجزيئات البروتين الدهني النانوي المصاغة. يتم توضيح الطريقة هنا مع التعبير عن بروتين الغشاء الخارجي الرئيسي الكلاميديا (MOMP) ولكن يمكن تطبيقه على نطاق واسع على مستضدات البروتين الغشائي الأخرى. يمكن تقييم فعالية المستضد في الجسم الحي من خلال دراسات التحصين لقياس إنتاج الأجسام المضادة ، كما هو موضح هنا.
Introduction
تتوفر محللات بدائية النواة أو حقيقية النواة للتعبير الخالي من الخلايا للبروتينات بسهولة كمنتجات تجارية لتوليف البروتينات ذات الأهمية (للحصول على مراجعة كاملة ، انظر 1). تتوفر أنظمة التعبير هذه على مستويات مختلفة وتستخدم المحللات من الكائنات الحية المختلفة ، بما في ذلك الإشريكية القولونية ونباتات التبغ ومزارع الثدييات. تقدم المحللات الخالية من الخلايا فوائد متعددة مقارنة بأساليب إنتاج البروتين المؤتلف التقليدية ، بما في ذلك سهولة الاستخدام وإنتاج البروتين القوي والسريع. في حين أن هذه الأساليب تستخدم في المقام الأول لإنتاج البروتينات القابلة للذوبان ، فقد كانت هذه المجموعة رائدة في نهج لاستخدامها للتعبير عن البروتينات الغشائية.
يقوم هذا النهج الجديد بإجراء تعديلات طفيفة على أنظمة التعبير الخالية من الخلايا الحالية من خلال تضمين الحمض النووي الذي يشفر منتجين بروتينيين للتعبير ، والبروتين الشحمي والبروتين الغشائي محل الاهتمام. يتفاعل البروتين الشحمي المعبر عنه (مشتقات إما ApoA1 أو ApoE4) مع الدهون المضافة إلى المحللة الخالية من الخلايا لتجميع NLPs تلقائيا (~ 20 نانومتر). عند ترجمته مع بروتين غشاء مهم ، يشكل NLP والبروتين الغشائي مركب جسيمات نانوية قابلة للذوبان حيث يتم تضمين بروتين الغشاء داخل طبقة الدهون المزدوجة NLP. وبالتالي ، فإن البروتين الغشائي يمكن الوصول إليه بشكل أكبر للتطبيقات النهائية ، حيث يتم احتواؤه داخل جزيئات منفصلة قابلة للذوبان. يمكن أن ينتج هذا النهج معقدات بروتين قليل القسيمات وظيفية داخل الطبقة الثنائية من البرمجة اللغويةالعصبية 2 ويمكن أن ينتج مكون المستضد للقاح الوحدة الفرعية ، والذي يتم خلطه لاحقا مع المواد المساعدة المحبة للدهون لتشكيل لقاح للجسيمات النانوية يتميز بمستضد موضعي مشترك ومساعد مناسب للتقييم في الجسم الحي .
تم تعديل هذه الطريقة الحالية من بروتوكول3 تم نشره مسبقا. تركز التعديلات الرئيسية على توسيع نطاق التفاعل الخالي من الخلايا والتنقية اللاحقة لمركب البروتين – البرمجة اللغوية العصبية. يتضمن التعديل الآخر إضافة بوليمر برمائي يعرف باسم telodendrimer ، والذي يتم خلطه أولا مع الدهون قبل إضافته إلى التفاعل الخالي من الخلايا. الترجمة المشتركة للبلازميدات في وجود telodendrimer والدهون تنتج telodendrimer NLP (tNLP). تساعد إضافة telodendrimer أيضا على تعديل حجم وتشتت الجسيمات النانوية tNLP الناتجة4. تم تحسين هذا البروتوكول خصيصا لدراسات اللقاحات واسعة النطاق لإنتاج بروتين مستضد وحدة فرعية مرتبطة بالغشاء ، الكلاميديا MOMP 5,6. تنتج الطريقة MOMP المؤتلف المرتبط ب tNLP لتشكيل مركب MOMP-tNLP عالي الذوبان الذي يحتفظ بقلة MOMP. ينتج إنتاج نموذجي من 3 مل >1.5 مجم من MOMP المنقى. إن MOMP-tNLP المنتج الخالي من الخلايا قابل للإضافة المساعدة السريعة لاختبار المناعة في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
الكلاميديا هي العدوى المنقولة جنسيا الأكثر شيوعا والتي تؤثر على كل من الرجال والنساء. على الرغم من أن أبحاث اللقاح على الكلاميديا تمتد لعقود ، إلا أن اللقاح الآمن والفعال الذي يمكن توسيع نطاقه إلى الإنتاج الضخم ظل بعيد المنال13. يعتبر الكلاميديا MOMP المرشح الرئيسي كمستضد لقاح وقائي. ومع ذلك ، فإن MOMP شديد الكارهة للماء وعرضة للطي غير الصحيح14,15. كشفت دراسة أخرى أن MOMP موجود في حالات قليلة القسيمات الضرورية لمناعته11. بالتفصيل هنا هو طريقة التعبير المشترك التي تم التحقق من صحتها والخالية من الخلايا والتي تنتج MOMP قليلة القسيمات المتكونة داخل الجسيمات النانوية tNLP كلقاح ، مع غلة تبلغ حوالي 1.5 ملغ من MOMP المنقى لكل 3 مل من المحللات. ويمكن توسيع نطاق هذا الإجراء المقارن بالكامل ليشمل الإنتاج الصناعي، مما يزيد من آفاقه كنهج مفيد لتوليد اللقاحات.
لقد نشرنا سابقا عن استخدام التعبير الخالي من الخلايا لإنتاج بروتينات غشائية مضمنة في البرمجة اللغوية العصبية3،16 ، بالإضافة إلى التعبير في الأقراص المستقرة بالتيلوديندريمر . ومع ذلك ، أنتجت هذه التقنية الأخيرة جزيئات غشاء البروتين مع عدم تجانس أكبر وقابلية ذوبان أقل. 4 بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاستمناع لجسيمات MOMP-telodendrimer غير واضح مقارنة بجسيمات MOMP-tNLP6.
يمكن تكييف هذا الإجراء لتوسيع نطاق التعبير عن بروتينات الغشاء البكتيري المرشحة الواعدة كمستضدات للاستخدام في لقاحات الوحدات الفرعية. لا ينتج هذا الإجراء بروتين غشاء بكتيري قابل للذوبان فحسب ، بل إن بنية الجسيمات النانوية الشاملة قابلة لمزيد من التعديل باستخدام مجموعة متنوعة من المواد المساعدة للقاح المحبة للدهون بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، CpG المترافق مع جزء الكوليسترول أو FSL-1. يعد التعبير عن المستضدات المرشحة الأخرى من البكتيريا أمرا ممكنا ، على الرغم من أن المعلمات مثل درجة حرارة التعبير واختيار الدهون ونوع نظام التعبير قد تحتاج إلى استكشاف لتحقيق الغلة المثلى.
بالإضافة إلى ذلك ، يعد اختيار البلازميد ونسبته أمرا بالغ الأهمية في هذه العملية. يجب بناء كل من البلازميدات المستخدمة من نفس العمود الفقري. إذا كانت الإدخالات بنفس الطول تقريبا ، فيمكن أن تستند النسب إلى كتلة البلازميد المضافة ، كما هو موضح هنا. ومع ذلك ، فإن النسب على أساس الشامات سيعطي نتائج أكثر قابلية للتكرار ، خاصة عند قياس التفاعلات. قد لا تنطبق النسب التي تعمل بشكل جيد في تفاعلات مقياس الشاشة (< 0.5 مل) على التفاعلات الأكبر وقد تتطلب تحسينا إضافيا. لا يزال من الممكن التعبير عن البروتينات غير الغشائية باستخدام مجموعات خالية من الخلايا ولكنها قد لا تتطلب الجسيمات النانوية الدهنية (التعبير المشترك) لإنتاج منتج قابل للذوبان. بالإضافة إلى ذلك ، بينما يصف هذا البروتوكول المساعدة باستخدام CpG و FSL-1 ، فإن هذا النظام قابل للصياغة مع المواد المساعدة الأخرى المحبة للدهون أو الاختلاط مع المواد المساعدة القابلة للذوبان حسب الرغبة.
من الضروري تجنب التلوث عند إعداد تفاعل التعبير الخالي من الخلايا لأن ذلك يمكن أن يؤثر على الغلة. يجب أن تكون أي إضافات للتفاعل ، بما في ذلك البلازميدات نفسها ، نقية للغاية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تكون البروتينات المعبر عنها على اتصال فقط بالمواد والمحاليل الخالية من تلوث السموم الداخلية. يمكن أن يؤدي تلوث السموم الداخلية في التركيبات المرشحة إلى نتائج غير متسقة وزائفة للمقايسات المناعية ويمكن أن يكون ضارا بكميات كافية. على الرغم من عدم وصفها هنا ، فقد يكون من الضروري إجراء تنقية إضافية بعد كروماتوغرافيا تقارب النيكل إذا لوحظت العديد من الملوثات في خطوات التحليل اللاحقة مثل من خلال SDS-PAGE. ويمكن تحقيق ذلك مع لجنة الأوراق المالية والبورصات، على الرغم من أن الظروف قد تتطلب التحسين على أساس كل صياغة على حدة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منحة خدمة الصحة العامة R21 AI20925 و U19 AI144184 من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية. تم تنفيذ هذا العمل تحت رعاية وزارة الطاقة الأمريكية من قبل مختبر لورانس ليفرمور الوطني بموجب العقد DE-AC52-07NA27344 [LLNL-JRNL-822525 ، LLNL-VIDEO-832788].
Materials
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) as powder | Avanti Polar Lipids | 850345 | |
| 1.5 mL endotoxin-free centrifuge tubes | Eppendorf | 2600028 | |
| 1 M Trizma hydrochloride solution | Millipore Sigma | T2194 | |
| Acetic acid, glacial, ACS reagent, ≥99.7% | Millipore Sigma | 695092 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Buffer Dam for XCell SureLock | Life Technologies | EI0012 | |
| C24 Incubator shaker | New Brunswick Scientific | ||
| Cell-Free Expression System: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit | BiotechRabbit | BR1400201 | |
| cOmplete His-Tag Purification Resin | Roche Molecular Diagnostics | 5893682001 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche Molecular Diagnostics | 4693132001 | |
| CpG-ODN1826 | Biosearch Technologies | T9449 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Millipore Sigma | 71509 | |
| Dialysis tubes D-Tube Dialyzer Maxi | Millipore Sigma | 71508-3 | |
| Disposable, polypropylene fritted columns 10 mL capacity | Bio-Rad | 7311550EDU | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (PBS) | Millipore Sigma | D8537 | |
| Electrophoresis Power Supply | |||
| Endosafe PTS cartridge | Thermo Fisher Scientific | NC9594798 | |
| Endosafe-PTS Testing System | Charles River | ||
| Gel wash solution: 10% methanol, 7% acetic acid | |||
| HCl and NaOH solutions for pH adjustment | |||
| HPLC with UV-vis diode array detector | Shimadzu | ||
| HyClone HyPure culture-grade water | VWR | 82007-328 | |
| iBlot 2 Dry Blotting System | Life Technologies | ||
| iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF | Life Technologies | IB24001 | |
| Image Studio V2.0 software | Li-COR Biiosciences | ||
| Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| LI-COR Odyssey Fc imager | Li-COR Biiosciences | ||
| Lyophilizer | Labconco | ||
| Methanol (≥99.9%) | Millipore Sigma | 34860 | |
| Microcentrifuge | |||
| Microwave oven | |||
| NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP000202 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Life Technologies | NP0009 | |
| Odyssey Blocking Buffer in TBS containing 0.2% Tween 20 | Li-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Orbital Shaker | |||
| PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4) | |||
| PEG5K-CA8 Telodendrimer (custom synthesis product) | |||
| pIVEX2.4d vector | Roche Molecular Diagnostics | ||
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Primary antibody: MAb40 (monoclonal antibody to the variable domain 1 (VD1) of C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4 | |||
| Primary antibody: MAbHIS, Penta-His antibody | Qiagen | 34660 | |
| Probe sonicator | |||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
| Qubit Protein Assay Kit | Life Technologies | Q33212 | |
| Rainin Pipette tips: LTS 1000 µL | Rainin | 17002428 | |
| Rainin Pipette tips: LTS 20 µL | Rainin | 17002429 | |
| Rainin Pipette tips: LTS 200 µL | Rainin | 17002426 | |
| Rainin Pipettes | Rainin | ||
| Secondary antibody: IRDye 800CW goat (polyclonal) anti-mouse IgG (heavy and light) | Li-COR Biosciences | 926-32210 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Life Technologies | LC5925 | |
| Sodium chloride NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic NaH2PO4 | Millipore Sigma | S0751 | |
| Superdex 200, 5/150 GL column | Cytiva | GE28-9909-45 | |
| Synthetic diacylated lipoprotein-TLR2/6 FSL-1 | Invivogen | tlrl-fsl | |
| SYPRO Ruby Protein Gel Stain | Life Technologies | S12001 | |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | |
| UV light source | |||
| Vacufuge Bench Top Centrifuge | Eppendorf | ||
| Vortexer | |||
| VWR 15 mL conicals (89039-666) | VWR | ||
| VWR 50 mL conicals (89039-656) | VWR | ||
| XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies ) | Life Technologies | EI0001 |
References
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
- Coleman, M. A., et al. Expression and association of the Yersinia pestis translocon proteins, YopB and YopD, are facilitated by nanolipoprotein particles. PLoS One. 11 (3), 0150166 (2016).
- Cappuccio, J. A., et al. Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 7 (11), 2246-2253 (2008).
- He, W., et al. Controlling the diameter, monodispersity, and solubility of ApoA1 nanolipoprotein particles using telodendrimer chemistry. Protein Science. 22 (8), 1078-1086 (2013).
- He, W., et al. Cell-free production of a functional oligomeric form of a Chlamydia major outer-membrane protein (MOMP) for vaccine development. Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 15121-15132 (2017).
- Tifrea, D. F., et al. Induction of protection in mice against a Chlamydia muridarum respiratory challenge by a vaccine formulated with the major outer membrane protein in nanolipoprotein particles. Vaccines. 9 (7), 755 (2021).
- Cleveland, T. E., et al. Small-angle X-ray and neutron scattering demonstrates that cell-free expression produces properly formed disc-shaped nanolipoprotein particles. Protein Science. 27 (3), 780-789 (2018).
- Fischer, N. O., et al. Conjugation to nickel-chelating nanolipoprotein particles increases the potency and efficacy of subunit vaccines to prevent West Nile encephalitis. Bioconjugate Chemistry. 21 (6), 1018-1022 (2010).
- Fischer, N. O., et al. Colocalized delivery of adjuvant and antigen using nanolipoprotein particles enhances the immune response to recombinant antigens. Journal of the American Chemical Society. 135 (6), 2044-2047 (2013).
- Fischer, N. O., et al. Evaluation of nanolipoprotein particles (NLPs) as an in vivo delivery platform. PLoS One. 9 (3), 93342 (2014).
- Pal, S., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. Vaccination with the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein can elicit an immune response as protective as that resulting from inoculation with live bacteria. Infection and Immunity. 73 (12), 8153-8160 (2005).
- Sun, G., et al. Structural and functional analyses of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 189 (17), 6222-6235 (2007).
- Hafner, L. M., Wilson, D. P., Timms, P. Development status and future prospects for a vaccine against Chlamydia trachomatis infection. Vaccine. 32 (14), 1563-1571 (2014).
- Findlay, H. E., McClafferty, H., Ashley, R. H. Surface expression, single-channel analysis and membrane topology of recombinant Chlamydia trachomatis Major Outer Membrane Protein. BMC Microbiology. 5, 5 (2005).
- Sun, G., Pal, S., Weiland, J., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. Protection against an intranasal challenge by vaccines formulated with native and recombinant preparations of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein. Vaccine. 27 (36), 5020-5025 (2009).
- He, W., et al. Cell-free expression of functional receptor tyrosine kinases. Scientific Reports. 5 (1), 12896 (2015).
