Metabarcoding Analizi ile Şili'deki Zararlı Alg Çiçeklerini İzlemek için Standartlaştırılmış Bir Prosedür

1. Numune toplama ve ön işlem Hedef noktadan yaklaşık 3 L su örneği toplayın. Serbest yaşayan ve bağlı bakterileri ayırmak için tandem filtrasyon (1 μm ve 0,2 μm gözenek boyutunda membran) aracılığıyla 16S rRNA analizi için 1 L su örneğini filtreleyin. 18S-rRNA analizi (fitoplankton algılama) için 1 L’lik bir su örneğini daha 0,2 μm membranlı tek bir filtrasyonla filtreleyin.NOT: Su numunesinin filtrasyonu örneklemeden 12 saat içinde tamamlanmalıdır. Filtrelenmiş membranı steril cerrahi makasla ikiye bölün ve alüminyum folyo ile sarın. -20 °C’de 1 aya kadar saklayın veya bir sonraki adıma geçin. Açıklandığı gibi Chelex yöntemi ile DNA ayıklayın9. -20 °C’de 1 aya kadar saklayın. 2. Mikroskop analizi Su örneğinin 1 mL’lik kısmını pipetle 1 mL’lik bir ızgara kaydırağı üzerine aktarın. Örneği mikroskop altında gözlemleyin. Fitoplankton türlerinin adlarını ve miktarını kaydedin. 3. 16S rRNA ve 18S rRNA metabarkodlama analizi NOT: Bu işlem yedi bölümden oluşur: hazırlık, ilk PCR amplicon üretimi, birinci amplicon temizliği, ikinci PCR ile indeksleme, ikinci PCR amplicon doğrulama ve temizleme, DNA konsantrasyon ayarlama ve DNA denatürasyonu ve dizilimi. Tüm süreç deneyimli bir laboratuvar personeli tarafından en az 5 gün (40 saat) sürer. Ürün numaraları ve imalatları için Malzeme Tablosu’na bakın. Hazırlık Pipetleri ve laminar davlumbaz dolabı % 70 etanol ile temizleyin ve ardından 30 dakika boyunca UV maruziyeti sık sık. Kullanılacak malzemeleri sterilize edin. DNA örneklerini oda sıcaklığında çözün, 2 dakika boyunca 100 x g’da santrifüj ve her numunenin 100 μL’si 8 tüplü şeritlere aktarın. İlk PCR amplicon üretimiNOT: Laminar davlumbaz kabininde aşağıdaki işlemleri gerçekleştirin. Astar kirlenmesini önlemek için astarları her zaman 1 μM stoktan hedef konsantrasyona PCR sınıfı su ile seyreltin. Reaksiyonlar için steril 1,5 mL tüpte ilk PCR ana karışımını hazırlayın (Tablo 1, Tablo 2). Aliquot 22.5 μL ana karışımı 8 tüplü bir şeritte ve 2.5 μL DNA örneği ekleyin. Negatif kontrol için 2,5 μL PCR sınıfı su kullanın. İlk PCR döngüsünü çalıştırın (Tablo 3). 10 μL 1x nükleik asit jel lekesi içeren 100 mL%2 Agarose-TBE jel hazırlayın. Agarose jel üzerine 1,5 μL 1x DNA yükleme boyası ve 4 μL PCR ürününün bir karışımını yükleyin. Ayrıca, jel üzerine 100 bp DNA merdiveni yükleyin. 30 dakika boyunca 100 V’ta elektroforezi gerçekleştirin. UV ışık görüntü yakalama altında 500-600 bp aralığında bir bant olduğundan emin olun. Astar-dimer bant yuvarlak 80 bp.NOT: Deniz suyu numuneleri PCR inhibitörleri içerir. Eksik ampliconlar bazen 1:100 veya 1:1000 numunelerinin PCR sınıfı su ile seyreltilmesiyle çözülebilir. İlk PCR ürünlerini bir sonraki adıma kadar -20 °C’de saklayın.DİkKAT: Bir haftalık depolama alanını aşmayın. İlk PCR amplicon temizliğiNOT: Bu bölüm laminar davlumbaz kabininin dışında gerçekleştirilebilir. Astar-dimer ürünleri de dahil olmak üzere PCR reaksiyon kalıntılarını gidermek için manyetik boncuk DNA temizleme sistemini kullanın. Temizlenen her bir ilk PCR ürününün 20 μL’lik kısmını yeni bir 96 kuyu plakasına aktarın. Plakayı bir mikro mühür filmi ile kapatın. Bir sonraki adım ilerleyene kadar -20 °C’de saklayın.DİkKAT: Bir haftadan fazla depolama alanını aşmayın. İkinci PCR ile dizin oluşturmaNOT: Bu bölümde, saflaştırılmış ilk PCR ürünleri çeşitli indeks astar kombinasyonları ile güçlendirilecektir. Laminar davlumbaz kabinine yerleştirilen 8 tüp PCR şeridinde tüm İndeks 1 ve İndeks 2 astarlarını (Tablo 4)1 μM’ye kadar PCR sınıfı su ile seyreltin.NOT: Dizin astarları ilk PCR reaksiyon çıkıntı adaptörüne özgü olduğundan, bu bölümdeki adımlar laminar davlumbaz kabininin dışında gerçekleştirilebilir. Yatay bir satırda Konum Dizini 1 astarı Dizin 2 astar dikey bir satırda (Tablo 5). Yeni bir 96 kuyu plakasında, her kuyuya 12,5 μL sıcak başlatmaya hazır formülasyon ekleyin. Çok kanallı pipet kullanarak tablo 4’te her bir indeks astarının (1 μM) 2,5 μL’sini ekleyin. 7,5 μL saflaştırılmış ilk PCR ürünü ekleyin. 10 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hafifçe karıştırın. Plakayı bir mikro mühür filmi ile örtün. İkinci PCR döngüsünü çalıştırın (Tablo 3). Plakayı -20 °C’de tutun.DİkKAT: Bir haftalık depolama alanını aşmayın. İkinci PCR amplicon doğrulama ve temizleme Parça çözümleyicisi ve ilişkili reaktif kullanın. Vortex ve kullanmadan önce reaktif aşağı döndürün. Örnek tamponun ve DNA ekran bandının oda sıcaklığında 30 dakika boyunca aşındırmasına izin verin. Ardından, DNA ekran bandını bir parça analizörüne yerleştirin. Yeni 8 tüp şeritte 2 μL numune tamponu ve 3 μL ikinci PCR amplicon karıştırın. 8 tüp şeridini parça analizörüne yerleştirin. Başlatmak için Çalıştır’a basın.DİkKAT: Hava kabarcıklarının oluşumundan kaçınılmalıdır. İkinci PCR ampliconlarının hem 16S hem de 18S rRNA genleri için yaklaşık 613 bp (600 – 630 bp) olduğundan emin olun. Manyetik boncuk DNA temizleme sistemi kullanarak ikinci PCR ürünlerini saflaştırın. DNA konsantrasyonu ayarı Saflaştırılmış ikinci PCR ürünlerindeki DNA konsantrasyonunu nükleik asit niceleme spektrofotometresi kullanarak ölçün. nM’deki hedef gen konsantrasyonu hesaplayın, ortalama son kütüphane boyutunu hem 16S hem de 18S rRNA genleri için 613 bp olarak hesaplayın: Arıtılmış her ikinci PCR ürününü steril PCR suyu ile yeni bir 0,2 mL 96 kuyu plakasında 4 nM’ye seyreltin.NOT: Plaka burada -20 °C’de saklanabilir. Aksi takdirde, işlemlerin geri kalanı durdurulmadan yapılmalıdır. Her 4 nM ikinci PCR ürününün Aliquot 3 μL’si ve hepsini havuzlu bir kütüphane olarak yeni bir steril 1,5 mL tüpte karıştırın. Tüpü her zaman 4 °C’de veya buz banyosunda tutun. Nükleik asit niceleme spektrofotometresi kullanarak onay için havuza alınan kütüphanenin konsantrasyonunu ölçün. 4 nM’den yüksekse konsantrasyonu 4 nM’ye ayarlayın.NOT: Aşırı konsantre DNA, aşırı tahmin edilen okuma sayıları üretir ve analizi engeller. DNA denatürasyonu ve dizilimiNOT: Bu bölümde belirli reaktiflere sahip Illumina MiSeq sistemi haline gelinir. Malzeme Tablosu’ndakiürün numaralarına bakın.NOT: Kesinlikle zamanı takip edin. Kartuşlar dışındaki tüm reaktifleri sıralama gününde çözün. Sıralamadan bir gün önce, önceden doldurulmuş kullanıma hazır bir reaktif kartuşunu -20 °C’den çıkarın ve çözülme için 4 °C’de saklayın. 1,5 mL santrifüj tüpleri için uygun bir ısı bloğunu 96 °C’ye ayarlayın. Melezleme tamponunu buza yerleştirin. PCR sınıfı su ile yeni bir tüpte moleküler sınıf NaOH’u 1 N’den 0,2 N’ye seyreltin. Kullanıma hazır bir kontrol kitaplığını TE arabelleği (pH 8.0) ile yeni bir tüpte 10 nM stoktan 4 nM’ye (örneğin, 2 μL kontrol kütüphanesi + 3 μL TE arabelleği) seyreltin. 16 μL 4 nM havuzlu örnek kütüphaneyi 4 μL 4 nM kontrol kütüphanesi ile “1” etiketli yeni bir tüpte karıştırın. “1” tüpünde 10 μL numuneyi 10 μL 0,2 N NaOH ile “2” etiketli yeni bir tüpte karıştırın. Vortex tüp 2 için 5 s, kısa bir süre aşağı döndürün ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Tüp 2’ye 980 μL hibridizasyon tamponu ekleyin. “3” etiketli yeni bir tüpte, 260 μL’lik numuneyi tüp 2’den 390 μL hibridizasyon tamponu ile karıştırın. Tüpü ters çevirerek karıştırın. Tüp 3’i 96 °C’de 2 dakika kuluçkaya yatırın ve hemen maksimum 2 dakika boyunca buza yerleştirin. Kartuşu 4 °C buzdolabından çıkarın. Tablo 6’da olduğu gibi, örnek sayfayı karşılık gelen her dizin 1 ve dizin 2 bağdaştırıcısıyla sıralama için ayarlayın. Akış hücresini MiSeq v3 kitinden çıkarın. Akış hücresini steril moleküler sınıf PCR su ile hafifçe temizleyin.NOT: Akış hücresinin kılcal noktalarına su dökmeyin. Lifli olmayan kağıtla akış hücresinden suyu hafifçe silin. Tüp 3’ün (650 μL) tam hacmini kartuşa yükleyin. Cihaz çalışma yazılımında sıralamayı seçin ve yönergeleri izleyin. Akış hücre, kuruluş tamponu ve kartuş takın. Örnek sayfayı yükleyin. Tepkiyi başlatmak için Çalıştır’a basın.NOT: Bu sıralı çalışma 3-5 gün sürecektir. Veriler otomatik olarak Basespace platformuna yüklenecektir. Ham veriler bilgisayardaki iki klasörde depolanacaktır: fastq dosyalarını içeren analiz klasörü ve bcl dosyalarını ve jpeg resimlerini içeren Çıktı. 4.Verileri sıralamak için taksonomik atama FASTQ dosya işlemeNOT: R 24’ün DADA2 paketi23, FASTQ dosyalarını işlemek için önerilen veritabanlarından biridir. Kılavuz [https://github.com/mickeykawai/exec_dada2] adresinde mevcuttur. Bu kılavuz, DADA2 ardışık düzen öğreticisinin son sürümü [https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html] benimsenerek hazırlanmıştır. Kırpma, kalite filtreleme, benzersiz dizilerin dereplication ve sayımı, örnek çıkarım, contigs birleştirme ve kimerik dizileri kaldırma için ham FASTQ eşleştirilmiş uç dizilerini işleyin. Hem 16S rRNA hem de 18S rRNA gen parçaları için aşağıdaki DADA2 belirtilen parametrelerini kullanın; trimLefts=0, 0, truncLens=[Sıra kalitesini denetleyin ve uygun uzunluğa ayarlayın].NOT: Diğer parametreler için varsayılan değerler maxN=0, maxEE=2,2, trancQ=2’dir. Taksonomi atamasıNOT: DADA2 için taksonomi ataması için SILVA rRNA veritabanı önerilir [silva_nr_v132_train_set.fa.gz varsayılan olarak ayarlanır]. 16S rRNA gen parçası analizi için kloroplast ve mitokondriyal OPU’ları çıkarın. Singletonları 16S rRNA ve 18S rRNA analizinden çıkarın. En düşük sıralama derinliğine sahip numuneye göre tüm örnekleri sıralama derinliğine eşit olarak nadirleştirin. Okuma sayısını, atanan OTU’ları ve hangi düzeyde filtre uygulanmış okumaları ve hariç tutulan singleton sayısını kaydedin. İstatistiksel analiz Phyloseq25 ve vegan26’nınR paketlerini kullanarak mikrobiyal veriler üzerinde istatistiksel analiz yapın.