Questo protocollo introduce fasi di analisi metabarcodifica, mirate ai geni rRNA 16S e rRNA 18S, per monitorare le fioriture algali dannose e il microbioma associato nei campioni di acqua di mare. È un potente strumento basato su molecole, ma richiede diverse procedure, che sono spiegate visivamente qui passo dopo passo.
Il monitoraggio delle fioriture di alghe nocive (HAB) è stato implementato in tutto il mondo e il Cile, un paese famoso per la pesca e l’acquacoltura, ha utilizzato intensamente analisi microscopiche e tossiche per decenni per questo scopo. I metodi biologici molecolari, come il sequenziamento del DNA ad alto rendimento e gli approcci basati sull’assemblaggio batterico, stanno appena iniziando a essere introdotti nel monitoraggio HAB cileno e le procedure non sono ancora state standardizzate. Qui, le analisi di metabarcoding dell’rRNA 16S e dell’rRNA 18S per il monitoraggio degli HAB cileni vengono introdotte gradualmente. Secondo una recente ipotesi, l’associazione mutualistica algale-batterica svolge una relazione sinergica o antagonistica critica che rappresenta l’inizio, il mantenimento e la regressione della fioritura. Pertanto, il monitoraggio dell’HAB da prospettive algali-batteriche può fornire una comprensione più ampia dei meccanismi HAB e la base per l’allerta precoce. L’analisi metabarcoding è uno degli strumenti molecolari più adatti a questo scopo perché può rilevare massicce informazioni tassonomiche algali-batteriche in un campione. Le procedure visive di campionamento per l’analisi metabarcoding qui forniscono istruzioni specifiche, con l’obiettivo di ridurre gli errori e la raccolta di dati affidabili.
Molte specie di fitoplancton marino sono note per produrre tossine endogene e quando queste specie si accumulano in numero sufficiente, sono dannose per l’ambiente marino. Tali fioriture algali dannose (HAB) sono osservate oggi sulle coste della maggior parte dei continenti del mondo1. Il fitoplancton tossico si accumula per la prima volta nei tessuti bivalvi, portando a malattie e morte in livelli trofici più elevati di organismi, compresi gli esseri umani, dopo la digestione. Successivamente, questi eventi portano gravi implicazioni per l’economia locale, la socioeconomia e la salute pubblica2. Il danno all’economia globale causato dagli HAB è stimato in milioni o miliardi di dollari ogni anno3. Il Cile è uno dei tanti paesi che soffrono di frequenti HAB.
Il Cile è un paese di lunga terra, che si estende per oltre 4.300 km a nord e a sud. La terra occidentale allungata si affaccia sull’Oceano Pacifico, il che aumenta naturalmente le possibilità che il Cile sperimenti HAB. Soprattutto nel sud del Cile, ci sono molte acquacolture di salmone di fama mondiale, e ogni volta che si verifica un HAB nella regione, le tossine algali provocano la malattia di un massiccio salmone d’allevamento e muore4,5,6. In Cile, l’anno in cui l’HAB ha colpito più duramente l’economia è stato il 2016, con una perdita annua stimata di 800 milioni di dollariUSA 7,8. Le specie algali tossiche causative variano in base all’anno e alla posizione. Per il caso del 2016, un complesso di Alexandrium catanella e Pseudochattonella verruclosa ha causato un HAB diffuso in gran parte della costa cilena meridionale7,8. L’HAB più recente in Cile si è verificato con la specie algale causativa di Heterosigma Akashiwo nel marzo 2021 a Camanchaca, situata nel sud del Cile, dove l’area ha un grande allevamento di salmoni.
Il Cile conduce da molti anni il monitoraggio costiero utilizzando due metodi principali; osservare l’acqua di mare con microscopi per identificare regolarmente le specie di alghe tossiche e misurare i livelli di tossine nei molluschi mediante saggi biochimici9. La diagnosi precoce delle alghe tossiche e dei livelli di tossine nei molluschi non previene gli HAB; tuttavia, queste analisi possono innescare contromisure immediate e ridurre i danni alle comunità locali. Per rafforzare ulteriormente l’efficacia di questa strategia, un metodo analitico a base molecolare è stato recentemente aggiunto al nostro programma di monitoraggio HAB cileno convenzionale per rilevare alghe e comunità batteriche correlate nei campioni di acqua di mare. In particolare, è stato scelto un metodo di sequenziamento parallelo massiccio che utilizza il metabarcoding che si rivolge ai geni rRNA 16S e rRNA 18S. Sebbene questa tecnica richieda procedure complicate e costosi macchinari e reagenti, è una tecnologia avanzata in grado di rilevare migliaia di alghe e batteri / specie presenti in un campione di acqua di mare contemporaneamente.
Si ipotizza che le cause dell’HAB siano varie, come la temperatura e la stagione, ma è impossibile generalizzarle. Questo perché le specie e le frequenze HAB dipendono dalla regione e dalle condizioni spazio-temporali, coinvolgendo fenomeni naturali come l’unicità geografica, la miscelazione dei nutrienti in risalita e il deflusso degli elementi dalla terra a causa dell’errosione2,10,11,12. Inoltre, fattori artificiali come l’eutrofizzazione influenzano gli HAB locali12,13. A causa del complesso multifattore, non è facile fare una previsione HAB accurata. Negli ultimi anni, c’è un’opinione secondo cui specifiche popolazioni batteriche possono essere correlate allo sviluppo di HAB come uno dei fattori, e la ricerca a sostegno di questa ipotesi è stata sempre più evidente14,15,16,17,18. Le tecniche di biologia molecolare sono generalmente utilizzate per studiare l’assemblaggio batterico; tuttavia, tale metodo standardizzato non è stato ancora stabilito nel monitoraggio HAB cileno9. Per studiare l’associazione algale-batterica con gli HAB, è imperativo eseguire contemporaneamente analisi di metabarcoding per gli attuali programmi di monitoraggio costiero cileno. Pertanto, questo protocollo introduce visivamente il nostro programma di monitoraggio HAB cileno, concentrandosi su una procedura graduale per analizzare il rilevamento di alghe e specie di batteri nei campioni di acqua di mare utilizzando l’analisi metabarcoding.
Il protocollo completo che descrive il nostro programma di monitoraggio HAB cileno è disponibile in Yarimizu et al.9. Include le procedure di campionamento dell’acqua di mare, rilevamento di specie algali microscopiche, rilevamento di geni algali-batterici, analisi dei pigmenti, raccolta di dati meteorologici e saggi di proprietà fisiche e chimiche dell’acqua. Il protocollo graduale di analisi metabarcoding di rRNA 16S e rRNA 18S per il rilevamento di specie algali e batteriche è disponibile come prestampa19. Questo protocollo dimostra in particolare le fasi di analisi del metabarcoding poiché è la parte più complicata e il punto culminante del nostro programma di monitoraggio HAB. Questo protocollo include anche un’introduzione del programma e il rilevamento al microscopio di specie algali. Quando si analizzano le specie algali mediante metabarcoding, è fondamentale eseguire contemporaneamente la microscopia per verificare i risultati dei due metodi. Questo protocollo non include come utilizzare il software per l’assegnazione della tassonomia, ma la raccomandazione del database è brevemente indicata alla fine della sezione seguente.
Questo protocollo ha eseguito con successo l’analisi metabarcoding del gene rRNA 18S e 16S rRNA per identificare specie algali e batteriche in campioni di acqua di mare per il monitoraggio degli HAB cileni. Le alghe dominanti e alcune alghe minori rilevate da questo protocollo erano coerenti con quelle ottenute al microscopio, confermando l’affidabilità del protocollo. Il clou del protocollo è che l’analisi ha rilevato Alexandrium spp. e Pseudochattonella spp., le due specie più problematiche che causano HAB nel sud del Cile, dall’acqua di mare di Metri anche a bassa abbondanza. Soprattutto, Pseudochattonella spp. sono specie difficili da identificare al microscopio perché le cellule sono piccole e facilmente frantumabili sotto la luce o l’uso di fissativi27,28. Il metabarcoding può fornire informazioni sulle specie algali che sono scarsamente presenti nei campioni di acqua di mare che la microscopia non può identificare. Il protocollo ha anche rilevato oltre 30 specie batteriche. Sebbene il modo in cui questi batteri siano correlati alla crescita delle alghe sia sconosciuto a questo punto, la massiccia raccolta di dati sulle specie algali-batteriche nell’analisi delle serie temporali fornirà probabilmente scoperte così importanti. Pertanto, l’aggiunta dell’analisi metabarcoding ai programmi convenzionali di monitoraggio HAB cileni rafforzerà senza dubbio l’attuale efficienza di monitoraggio HAB. In effetti, questo protocollo visivo per l’analisi del metabarcoding può essere utile non solo per il monitoraggio algale-batterico dell’acqua cilena, ma anche per i programmi di monitoraggio della costa in altre aree colpite da HAB in tutto il mondo.
Sebbene questo protocollo abbia fornito i vantaggi sopra indicati, è necessario discutere gli svantaggi del metodo. Come si vede nel protocollo visivo, il metodo di metabarcoding è lungo e complesso, richiede macchinari e reagenti costosi. Il personale di laboratorio deve essere appositamente addestrato, altrimenti sprecherà materiale, manodopera e tempo. Inoltre, il rilevamento delle alghe mediante metabarcoding deve essere abbinato al microscopio per verificare che le stesse specie dominanti siano identificate dai due metodi ortogonali29. La microscopia è uno strumento non invasivo, per la maggior parte, per identificare le specie algali, il che significa che è più difficile commettere errori quando le specie algali hanno forme uniche e apparenti. Naturalmente, l’errore umano può verificarsi se le specie hanno forme molto simili tra loro. D’altra parte, poiché l’analisi della metabarcodifica richiede più passaggi, aumenta naturalmente gli errori. Potrebbe trattarsi di un campione confuso, aggiunta di reagente errata o mancante di alcune procedure. Pertanto, è fondamentale confrontare i risultati del metabarcoding con quelli ottenuti al microscopio. Infine, il protocollo è applicabile solo qualitativamente e i risultati devono essere calcolati per l’abbondanza relativa. Come Lamb et al. hanno affermato nel 2019, l’attuale metabarcoding come prestazioni quantitative è ancora limitato e sono necessarie ulteriori ricerche prima che il metabarcoding possa essere utilizzato con sicurezza per applicazioni quantitative30.
Questo protocollo è stato ottimizzato per 140 – 170 campioni per esecuzione dal manuale di preparazione della libreria di sequenziamento metagenomico 16S emesso da Illumina Inc. Il protocollo ottimizzato è stato testato molte volte e ulteriormente modificato per rilasciare questa versione finale. Pertanto, si consiglia vivamente di seguire con precisione ogni passaggio. La parte più critica del protocollo è che è necessaria una particolare attenzione per evitare la contaminazione del campione. Le pipette e la cappa a flusso laminare devono essere pulite con alcool al 70% e l’esposizione ai raggi UV in ogni momento e i materiali sterilizzabili devono essere autoclavati. I primer e i reagenti devono essere diluiti direttamente dallo stock ad ogni nuova serie, o il riutilizzo dei reagenti e l’esposizione a diverse diluizioni possono essere una causa di contaminazione del campione. Il protocollo specifica quando l’operazione può essere eseguita al di fuori della cappa a flusso laminare. Salvo diversa indicazione, i campioni devono essere trattati in una cappa a flusso laminare pulita. Quando si ha a che fare con più strisce a 8 tubi contemporaneamente, si consiglia di lavorare sulla prima striscia a 8 tubi e tapparla prima di passare alla successiva striscia a 8 tubi. Lasciare il coperchio aperto per lungo tempo può causare la contaminazione del campione poiché i geni dell’rRNA 16S e 18S sono altamente onnipresenti nell’ambiente circostante. Il tempo indicato, come il tempo di miscelazione e il tempo di incubazione, deve essere seguito come esattamente descritto perché la durata migliore per ogni fase è stata selezionata in base alle molteplici esecuzioni di test. Un tempo eccessivo o insufficiente può, ad esempio, ridurre la resa del campione. Il processo dovrebbe essere interrotto solo nella parte in cui il protocollo dice che può fermarsi. È fondamentale avere un controllo negativo in quanto conferma che i risultati positivi non sono falsi positivi artificiali. Infine, si consiglia vivamente di pianificare i giorni perché richiede almeno cinque giorni per elaborare tutti i passaggi e alcune parti non possono essere fermate fino al prossimo segnale di arresto.
La limitazione dell’assegnazione tassonomica per i dati sequenziati è brevemente notata qui. Le sequenze nucleotidiche recentemente scoperte per le specie batteriche e algali vengono aggiornate quotidianamente nella banca dati. Mentre le specie algali e batteriche ben studiate sono registrate in modo affidabile, ci sono anche molte sequenze per specie sconosciute aggiornate nella banca dati. Indica che la risoluzione delle sequenze nucleotidiche registrate non è sempre sufficiente per l’identificazione delle specie, ma solo per l’identificazione del genere. Pertanto, l’identificazione microscopica delle specie deve essere eseguita ortogonalmente. La creazione di una pipeline ad accesso aperto per questo lavoro ha un vantaggio significativo nel gestire un ampio set di dati sequenziati contemporaneamente e nell’indagare in modo efficiente quando si verifica un errore. Inoltre, l’output di DADA2 è in un file di testo o csv, il che semplifica ulteriori analisi statistiche. D’altra parte, è necessario un server di grandi dimensioni per eseguire assegnazioni tassonomiche, specialmente quando un set di dati è di grandi dimensioni. Per configurare la pipeline, sono necessari ingegneri per impostare la pipeline e i professionisti devono comprendere parametri, funzionamento, Linux e bioinformatica.
Oltre all’ambito come strumento di monitoraggio HAB, l’uso di questo protocollo può essere ampliato per scopi di ricerca investigativa. Ad esempio, ci sono dibattiti in corso tra il governo cileno e i pescatori locali insieme alle associazioni per la pace ambientale in merito all’aumento del numero di HAB31locali,32. Il governo sostiene che è dovuto a un fenomeno naturale come il riscaldamento globale e El Niño, mentre le parti successive sostengono che l’acquacoltura del salmone è la causa. Il salmone non è una specie indigena del Cile e non era nell’acqua cilena mezzo secolo fa. Il governo cileno a quel tempo mirava a far crescere l’economia e creare posti di lavoro per le aree povere sviluppando un’attività di salmone33. Con l’intervento dall’estero per profitto di capitale, il Cile ha avuto un grande successo nello sviluppo dell’acquacoltura a penna, e il numero di salmoni è aumentato notevolmente negli ultimi decenni31,32,33. Successivamente, una grande quantità di cibo per il salmone è stata gettata in mare, portando la popolazione locale a sospettare che l’acquacoltura del salmone sia la ragione dei frequenti HAB locali31,32. La verità è sconosciuta ora, ma deve essere compresa alla fine in modo che possano essere escogitate strategie per proteggere l’ambiente marino locale, l’economia e la salute umana dagli HAB. L’analisi molecolare sulla relazione algale-batterica locale può contribuire a un chiarimento in avanti per tale soggetto. Ad esempio, la tecnica può cercare le specie algali e batteriche che prima non erano presenti nell’area oceanica bersaglio ma che sono aumentate drasticamente negli ultimi anni, il che è in qualche modo simile allo studio fatto da Sakai et al. per la scoperta di una popolazione non registrata di salamandra Yamato (Hynobius vandenburghi) da GIS e eDNA analisi34. Pertanto, al di là dello strumento di monitoraggio HAB, questo protocollo di metabarcoding ha il potenziale utilizzo per altri potenziali clienti.
The authors have nothing to disclose.
Questo studio è stato supportato dalla sovvenzione (JPMJSA1705) per uno studio su Science and Technology Research Partnership for Sustainable Development-Monitoring Algae in Chile (SATREPS-MACH). Ringraziamo la dottoressa Sandra Rios (Universidad de Los Lagos) per averci permesso di utilizzare un filmato. Ringraziamo Neal Andrew Holland per la sua diligente correzione di bozze del manoscritto. Esprimiamo il nostro sincero apprezzamento ai membri del gruppo di laboratorio del CREAN-IFOP di Puerto Montt, in Cile, per averci consigliato sull’identificazione del fitoplancton.
1.5 mL single tube | ThermoFisher | Q32856 | sterile |
1.5 mL tubes | ThermoFisher | 2150N | sterile |
8-strip 0.2 mL PCR tubes and flat cap | ThermoFisher | AB0451 & 4323032 | sterile |
96-well 0.2 mL PCR plate | ThermoFisher | N8010560 | |
AccuRuler 100 bp DNA Ladder | MaestroGen | 02001-500 | |
Chelex 100 Chelating Resin | Bio-Rad | 1432832 | |
Chemical Duty Vacuum Pressure Pump | MilliporeSigma | WP6122050 | |
D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5602 | |
DNA loading dye (Blue/Orange Loading Dye 6X) | Promega | G1881 | |
Ethanol Molecular Biology Grade | E7023 | Merck KGaA | |
Filtration device | ThermoFisher | 09-740-36H, 09-740-23E | |
Fluorescent DNA concentration measurement kit (Qubit dsDNA HS Assay kit) | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | |
Fluorometer (Qubit4 Fluorometer) | ThermoFisher | Q33238 | |
Fragment analysis verification matrix (D1000 ScreenTape) | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
Fragment Analyzer (Agilent Tapestation 4150) | Agilent | G2992AA | |
GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41002 | |
Generic bench vortexer (Vortex Genie 2) | Scientific Industries | SI-0236 | |
Heat block | |||
High performance sequencing-grade DNA polymerase (KAPA HiFi Hotstart ReadyMix), 2X | Roche | KK2602 | |
HT1 Hybridization buffer | Illumina | 20015892 | |
Illumina Nextera XT v2 Index Kit set A, B, C and D | Illumina | FC-131-2001, -2002, -2003, -2004 | |
Laminar hood cabinet | Biobase Co. | Biobase PCR-800 PCR Cabinet | |
Loading tips (Specific for Agilent TapeStation systems) | Agilent Technologies | 5067-5598 | |
Magnetic beads DNA cleanup system (ProNex® Size-Selective Purification System) | Promega | NG2002 | |
Magnetic stand for 96 wells (Magnetic Stand-96) | ThermoFisher | AM10027 | |
Micro-seal film for 96-well plate | ThermoFisher | 4311971 | sterile |
MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3003 | includes pre-filled, ready-to-use reagent cartridges. |
MiSeq system | Illumina | SY-410-1003 | includes pre-installed software |
Molecular grade nuclease-free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-04 | |
Molecular grade sodium hydroxide (NaOH) 1M | Merck KGaA | 1091371000 | |
Multichannel pipettes | Not specified | Not specified | |
Multi-Purpose Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
Ow D2 Wide-Gel Electrophoresis System | ThermoFisher | D2 | |
Ow EC-105 Compact Power Supply | ThermoFisher | 105ECA-115 | |
Pellet Pestle— Cordless Motor | ThermoFisher | K749540-0000 | |
PhiX control Kit v3 | Illumina | FC-110-300 | ready-to-use control library for Illumina sequencing |
Pipette tips | Not specified | Not specified | sterile |
Pipettes | Not specified | Not specified | 2, 10, 20, 100, 1000 μL |
SterivexTM GP 0.22 μm filter unit | MilliporeSigma | SVGP01050 | |
Tabletop centrifuge | Eppendorf 5427R Centrifuge | Eppendorf AG | |
TBE buffer | ThermoFisher | B52 | |
TE buffer (pH 8.0) | ThermoFisher | AM9849 | |
Terr PCR Direct FFPE Kit | Takara Bio USA | 639284 | includes 2X Terra PCR Direct Buffer |
Terra PCR Direct Polymerase Mix, 1.25 U/μL | Takara Bio USA | 639271 | High performance Inhibitor-tolerant DNA polymerase |
ThermalCycler (MiniAMP Plus Thermal Cycler) | ThermoFisher | A37835 | |
TransIlluminator and image capture system | Analytik Jena, AG | GelDoc-ItTS2 Imager | |
Whatman 1.0 m pore-sized membrane | MilliporeSigma | WHA111110 |