הליך מתוקנן לניטור פריחות אצות מזיקות בצ'ילה על ידי ניתוח Metabarcoding

1. איסוף דוגמה ו טיפול מקדים לאסוף כ 3 L של דגימת מים מנקודת היעד. סנן 1 ליטר של דגימת מים לניתוח 16S rRNA באמצעות סינון דו-מושבי (1 מיקרומטר ו-0.2 מיקרומטר בגודל נקבובית) כדי להפריד חיידקים חופשיים ומחוברים. סנן עוד 1 ליטר של דגימת מים לניתוח 18S-rRNA (זיהוי פיטופלנקטון) באמצעות סינון יחיד עם קרום 0.2 מיקרומטר.הערה: סינון דגימת המים חייב להסתיים בתוך 12 שעות של דגימה. חותכים קרום מסונן לשניים עם מספריים כירורגיים סטריליים ועוטפים אותו בנייר אלומיניום. יש לאחסן ב- -20 °C (70 °F) למשך עד חודש אחד או להמשיך לשלב הבא. לחלץ DNA עם שיטת Chelex כמתואר9. יש לאחסן ב-20 °C (70 °F) למשך עד חודש אחד. 2. ניתוח מיקרוסקופ העבר 1 מ”ל של דגימת המים על ידי pipette על שקופית רשת 1 מ”ל. שים לב לדגימה מתחת למיקרוסקופ. תרשמו שמות וכמות של מיני פיטופלנקטון. 3. 16S rRNA וניתוח מטא-בר-רנ”א 18S הערה: תהליך זה מורכב משבעה חלקים: הכנה, דור אמפלייקון PCR ראשון, ניקוי אמפליסון ראשון, אינדקס על ידי PCR שני, אימות וניקוי אמפליסון PCR שני, התאמת ריכוז DNA, דנאטורציה DNA ורצף. התהליך כולו לוקח מינימום של 5 ימים (40 שעות) על ידי אנשי מעבדה מנוסים. עיין בטבלת החומרים לקבלת מספרי מוצרים וייצורים. הכנה פיפטות נקיות וארון מכסה המנוע למינאר עם 70% אתנול ואחריו חשיפה לקרינת UV במשך 30 דקות לעתים קרובות. לחטא חומרים לשימוש. להפשיר דגימות DNA בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה ב 100 x g במשך 2 דקות, ולהעביר 100 μL של כל דגימה supernatant לרצועות 8-tube. ייצור אמפלייקון PCR ראשוןהערה: בצע את ההליכים הבאים בארון מכסה המנוע למינאר. תמיד לדלל פריימרים מ 1 μM מלאי לריכוז היעד עם מים כיתה PCR כדי למנוע זיהום פריימר. הכן את תערובת המאסטר הראשונה של PCR בצינור סטרילי של 1.5 מ”ל לתגובות(טבלה 1, טבלה 2). Aliquot 22.5 μL של תערובת מאסטר ברצועת 8 צינור ולהוסיף 2.5 μL של דגימת DNA. השתמש 2.5 μL של מים כיתה PCR לשליטה שלילית. הפעל את מחזור ה- PCR הראשון (טבלה 3). הכן 100 מ”ל של 2% ג’ל אגרוז-TBE המכיל 10 μL של כתם ג’ל חומצה גרעין 1x. לטעון תערובת של 1.5 μL של 1x DNA טעינת צבע ו 4 μL של מוצר PCR על ג’ל אגרוז. כמו כן, לטעון סולם DNA 100 bp על הג’ל. בצע אלקטרופורזה ב 100 V במשך 30 דקות. ודא שיש רצועה בטווח של 500-600 bp תחת לכידת תמונת אור UV. הלהקה פריימר-dimer הוא סיבוב 80 bp.הערה: דגימות מים ימיות מכילות מעכבי PCR. אמפליקונים חסרים לפעמים ניתן לפתור על ידי דילול דגימות 1:100 או 1:1000 עם מים כיתה PCR. אחסן את מוצרי ה- PCR הראשונים ב- -20 °C (70 °F) עד לשלב הבא.אזהרה: אל תחרוג משבוע אחסון אחד. ניקוי אמפליקולון PCR ראשוןהערה: ניתן לבצע סעיף זה מחוץ לארון מכסה המנוע למינאר. השתמש במערכת ניקוי DNA של חרוזים מגנטיים כדי להסיר שאריות תגובת PCR, כולל מוצרים פריימר-dimer. העבר 20 μL של כל מוצר PCR הראשון ניקה לצלחת חדשה 96 באר. לאטום את הצלחת עם סרט מיקרו-חותם. יש לאחסן ב- -20 °C (70 °F) עד להמשך השלב הבא.שים לב: אין לחרוג מיותר משבוע אחסון אחד. יצירת אינדקס לפי PCR שניהערה: בסעיף זה, מוצרי PCR ראשונים מטוהרים יוגברו עם שילובי פריימר אינדקס שונים. לדלל את כל אינדקס 1 ומדד 2 פריימרים (טבלה 4) כדי 1 μM עם מים כיתה PCR ב 8 רצועות PCR צינור להציב בארון מכסה המנוע למינאר.הערה: השלבים מעתה ואילך בסעיף זה יכולים להתבצע מחוץ לארון מכסה המנוע למינאר, כמו פריימרים אינדקס ספציפיים למתאם הראשון תגובות PCR overhang. מקם פריימר אינדקס 1 בשורה אופקית אינדקס 2 פריימרים בשורה אנכית (טבלה 5). בצלחת חדשה של 96 באר, הוסיפו 12.5 מיקרו-אל של ניסוח מוכן להתחלה חמה לכל באר. הוסף 2.5 μL של כל פריימר אינדקס (1 μM) לכל טוב, כמו בטבלה 4 באמצעות pipette רב ערוצי. הוסף 7.5 μL של מוצר PCR הראשון המטוהר. מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה 10 פעמים. מכסים את הצלחת בסרט מיקרו-חותם. הפעל את מחזור ה- PCR השני (טבלה 3). שמור את הצלחת ב -20 מעלות צלזיוס.אזהרה: אל תחרוג משבוע אחסון אחד. אימות וניקוי אמפליסון PCR שני השתמש במנתח קטעים ובריגנט משויך. מערבולת ולסובב למטה ריאגנט לפני השימוש. אפשר למאגר הדגימה ולקלטת מסך ה- DNA להתמזג בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, מקם את קלטת מסך ה- DNA במנתח שברים. לערבב 2 μL של חוצץ מדגם ו 3 μL של אמפליסון PCR השני ברצועות צינור 8 חדש. הכנס את 8 רצועות הצינור לתוך מנתח הרסיסים. לחץ על הפעל כדי להתחיל.זהירות: יש להימנע מהיווצרות בועות אוויר. ודא כי אמפליקולים PCR השני הם כ 613 bp (600 – 630 bp) עבור גנים 16S ו 18S rRNA. טהרו את מוצרי ה-PCR השניים באמצעות מערכת ניקוי DNA של חרוזים מגנטיים. התאמת ריכוז DNA מדוד ריכוז DNA במוצרי PCR השני המטוהרים באמצעות ספקטרופוטומטר כימות חומצת גרעין. חשב ריכוז גן יעד ב- nM, תוך התחשבות בגודל הספרייה הסופי הממוצע כ- 613 bp עבור גנים של 16S ו- 18S rRNA: לדלל כל מוצר PCR שני מטוהר עם מי PCR סטריליים ל 4 ננומטריות בצלחת חדשה 0.2 מ”ל 96 היטב.הערה: ניתן לאחסן את הצלחת ב -20 מעלות צלזיוס כאן. אחרת, יש לבצע את שאר ההליכים ללא עצירה. Aliquot 3 μL של כל מוצר PCR 4 ננומטרי השני ולערבב את כל בצינור סטרילי חדש 1.5 מ”ל כספרייה מ ומאובגרת. שמור את הצינור ב 4 °C (75 °F) או על אמבט קרח בכל עת. מדוד את הריכוז של הספרייה המאוגדת לאישור באמצעות ספקטרופוטומטר כימות חומצת גרעין. התאם את הריכוז ל 4 ננומטר אם הוא גבוה מ 4 ננומטר.הערה: DNA מרוכז יתר על המידה מייצר מספרי קריאה מוערכים יתר על המידה, מה שמעכב ניתוחים. דנ”א דנטורציה ורצףהערה: סעיף זה משתמש במערכת Illumina MiSeq עם ריאגנטים ספציפיים. ראה מספרי מוצרים בטבלת חומרים.הערה: עקוב אחר הזמן בקפדנות. להפשיר את כל הריאגנטים מלבד מחסניות ביום הרצף. יום לפני הרצף, הסר מחסנית ריאגנט מוכנה לשימוש ממולאת מראש מ- -20 °C (70 °F) ואחסן ב- 4 °C (70 °F) להפשרה. הגדר בלוק חום מתאים צינורות צנטריפוגות 1.5 מ”ל ל 96 °C (70 °F). הנח את חיץ ההכלאה על קרח. לדלל מולקולרית כיתה NaOH מ 1 N ל 0.2 N בצינור חדש עם מים כיתה PCR. דלל ספריית בקרה מוכנה לשימוש עם מאגר TE (pH 8.0) ממלאי של 10 ננומטר ל- 4 ננומטר בצינור חדש (כלומר, 2 μL של ספריית בקרה + 3 μL של מאגר TE). לערבב 16 μL של 4 nM דוגמה מאוחסן עם 4 μL של 4 nM בקרה הספרייה בצינור חדש שכותרתו “1”. לערבב 10 μL של מדגם בצינור “1” עם 10 μL של 0.2 N NaOH בצינור חדש שכותרתו “2”. מערבולת את הצינור 2 עבור 5 s, להסתובב למטה לזמן קצר, ודגור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. הוסף 980 μL של חוצץ הכלאה לצינור 2. בצינור חדש שכותרתו “3”, לערבב 260 μL המדגם מצינור 2 עם 390 μL של חוצץ הכלאה. מערבבים על ידי היפוך הצינור. צינור דגירה 3 ב 96 °C (70 °F) במשך 2 דקות ומיד למקם אותו על קרח לכל היותר 2 דקות. הסר את המחסנית ממקרר 4 °C (4 °F). הגדר את גליון הדוגמה לרצף עם כל מתאמי אינדקס 1 ואינדקס 2 תואמים כמו בטבלה 6. הסר את מד הזרימה מערכת ה- MiSeq v3. נקה בעדינות את צ’ף הזרימה עם מי PCR סטריליים ברמה מולקולרית.הערה: אין לשפוך מים על הנקודות הנימיות של צן הזרימה. יש לנגב בעדינות מים משדה הזרימה בנייר לא סיבי. לטעון את מלוא הנפח של צינור 3 (650 μL) לתוך המחסנית. בתוכנת פעולת מכשיר, בחר רצף ובצע את ההוראות. הכנס את זרם, מאגר ההתאגדות והמחסנית. טען גיליון לדוגמה. לחץ על הפעל כדי להתחיל את התגובה.הערה: ריצת רצף זו תיתקל 3-5 ימים. הנתונים יועלו באופן אוטומטי לפלטפורמת Basespace. נתונים גולמיים יאוחסנו בשתי תיקיות במחשב: תיקיית ניתוח המכילה קבצי fastq ופלט המכיל קבצי bcl ותמונות jpeg. 4.הקצאה טקסונומית לנתונים רצפים עיבוד קבצים של FASTQהערה: חבילת DADA223 של R24 הוא אחד ממסדי הנתונים המומלצים לעיבוד קבצי FASTQ. ההנחיה זמינה ב- [https://github.com/mickeykawai/exec_dada2]. הנחיה זו הוכנה על ידי אימוץ הגירסה האחרונה של ערכת הלימוד של צינור DADA2 [https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html]. עבד רצפי FASTQ משויכים גולמיים לגיזום, סינון איכות, הסרת דרגה וספירה של רצפים ייחודיים, הסקת דגימה, מיזוג לקונטיגות והסרת רצפים כימריים. השתמש בעקבות הפרמטרים שצוינו ב- DADA2 עבור שברי גנים של 16S rRNA ו- 18S rRNA; trimLefts=0, 0, truncLens=[בדוק את איכות הרצף והגדר אותה לאורך המתאים].הערה: ערכי ברירת המחדל עבור הפרמטרים האחרים הם maxN = 0, maxEE = 2,2, trancQ = 2. הקצאת טקסונומיההערה: מסד הנתונים rRNA SILVA מומלץ עבור הקצאת טקסונומיה עבור DADA2 [silva_nr_v132_train_set.fa.gz מוגדר כברירת מחדל]. הסר כלורופלסט ו- OTUs מיטוכונדריאלי לניתוח שברי גנים 16S rRNA. הסר סינגלטון מניתוח rRNA של 16S ו- 18S rRNA. תגביר את כל הדגימות אפילו לעומק רצף בהתבסס על המדגם בעל עומק הריצוף הנמוך ביותר. הקלט את מספר הקריאות, ה- OTUs שהוקצה ובאיזו רמה, קריאות מסוננות ומספר הסינגלטון שלא נכללו. ניתוח סטטיסטי בצע ניתוח סטטיסטי על נתונים מיקרוביאליים באמצעות חבילות R של phyloseq25 וטבעוני26.