メタバーコーディング解析によるチリの有害藻類の花を監視するための標準化された手順

1. サンプル収集と前処理 ターゲットスポットから約3Lの水サンプルを採取します。 タンデム濾過(1 μmおよび0.2 μmの細孔サイズ膜)を通して16S rRNA分析のための水サンプルのフィルター1 Lは、自由に生きている細菌と付着した細菌を分離する。 18S-rRNA分析(植物プランクトン検出)用に、0.2 μm膜を用いた単一の濾過を通して、別の1Lの水サンプルをフィルター処理します。注:水サンプルのろ過は、サンプリングの12時間以内に完了する必要があります。 滅菌手術用はさみで濾過した膜を半分に切り、アルミホイルで包みます。-20°Cで1ヶ月まで保管するか、次のステップに進みます。 9. 記載されているとおりに、チェレックス法でDNAを抽出する。-20°Cで1ヶ月まで保管してください。 2. 顕微鏡分析 1 mL グリッドスライドに、水サンプル1 mLをピペットで移します。 顕微鏡で試料を観察します。 植物プランクトン種の名前と量を記録します。 3. 16S rRNAおよび18S rRNAメタバーコーディング分析 注:このプロセスは、調製、最初のPCRアンプリコン生成、第1アンプリコンのクリーンアップ、第2PCRによるインデックス化、第2PCRアンプリコン検証とクリーンアップ、DNA濃度調整、およびDNA変性およびシーケンシングの7つのセクションで構成されています。全体のプロセスは、経験豊富なラボ担当者が 5 日 (40 時間) 以上かかります。製品番号と製造については、 材料表 を参照してください。 準備 70%エタノールを用いたクリーンピペットとラミナーフードキャビネット、その後30分間のUV暴露を頻繁に行います。使用する材料を殺菌する。 DNAサンプルを室温で解凍し、遠心分離機を100 x g で2分間解凍し、各サンプル上清の100 μLを8管ストリップに移します。 初のPCRアンプリコン生成注: ラミナー フード キャビネットで次の手順を実行します。プライマー汚染を避けるために、PCR等水で1μMストックからターゲット濃度までプライマーを常に希釈してください。 反応のために滅菌1.5mLチューブに最初のPCRマスターミックスを準備する(表1、表2)。 8チューブストリップにマスターミックスのアリコート22.5 μLを、DNAサンプルの2.5 μLを加えます。負のコントロールにはPCR等水2.5μLを使用してください。 最初の PCR サイクルを実行します (表 3)。 10 μLの1x核酸ゲル染色を含む2%アガロース-TBEゲル100mLを調製します。 1.5 μLの1x DNAローディング色素と4 μLのPCR産物をアガロースゲルにセットします。また、ゲルに100bpのDNAラダーをロードする。 100Vで30分間電気泳動を行います。 UV光画像キャプチャの下に500-600 bpの範囲のバンドがあることを確認してください。プライマーダイマーバンドはラウンド80bpである。注: 海洋水サンプルには PCR 阻害剤が含まれています。不足しているアンプリコンは、PCR等の水でサンプル1:100または1:1000を希釈することによって解決されることがあります。 次のステップまで-20°Cで最初のPCR製品を保管してください。注意: 1週間を超えるストレージを使用しないでください。 最初の PCR アンプリコンのクリーンアップ注: このセクションは、ラミナーフードキャビネットの外側で実行できます。 磁気ビーズDNAクリーンアップシステムを使用して、プライマーダイマー製品を含むPCR反応残基を除去します。 洗浄した最初のPCR製品の20 μLを新しい96ウェルプレートに移します。マイクロシールフィルムでプレートを密封します。次のステップが進むまで-20°Cで保管してください。注意: 1 週間を超えるストレージは使用しないでください。 2 番目の PCR によるインデックス付け注: このセクションでは、精製された最初の PCR 製品は、さまざまなインデックスプライマーの組み合わせで増幅されます。 すべてのインデックス1とインデックス2プライマー(表4)を、ラミナーフードキャビネットに入れた8チューブPCRストリップにPCRグレードの水で1μMに希釈します。注: インデックスプライマーは最初の PCR 反応オーバーハング アダプタに固有であるため、このセクションの手順は、ラミナー フード キャビネットの外側で実行できます。 水平行のインデックス1プライマーを縦の行に位置付けインデックス2プライマー(表5)。。 新しい96ウェルプレートで、ホットスタート対応製剤を12.5 μLずつ各ウェルに追加します。 各インデックスプライマー(1 μM)の2.5 μLを、マルチチャンネルピペットを使用して 表4 に加えます。 精製した最初のPCR製品を7.5 μL加えます。 上下に10回ピペットを入れ、やさしく混ぜます。マイクロシールフィルムでプレートを覆います。 2 回目の PCR サイクルを実行します (表 3)。 プレートを-20°Cに保ちます。注意: 1週間を超えるストレージを使用しないでください。 2回目のPCRアンプリコン検証とクリーンアップ フラグメントアナライザと関連する試薬を使用します。ボルテックスおよびスピンダウン試薬を使用前に。 サンプルバッファーと DNA スクリーン テープを室温で 30 分間平衡させます。次に、DNAスクリーンテープをフラグメント分析装置に入れます。 新しい8つのチューブストリップにサンプルバッファーの2 μLと2番目のPCRアンプリコンの3 μLを混ぜます。8本のチューブストリップをフラグメントアナライザに挿入します。 [実行] を押して開始します。注意:気泡の形成は避けなければなりません。 2番目のPCRアンプリコンは、16Sおよび18S rRNA遺伝子の両方で約613 bp(600-630 bp)であることを確認してください。 磁気ビーズDNAクリーンアップシステムを使用して、2番目のPCR製品を精製します。 DNA濃度調整 核酸定量分光光度計を用いて精製された第2PCR産物中のDNA濃度を測定します。 nMの標的遺伝子濃度を計算し、16Sおよび18S rRNA遺伝子の両方に対して613 bpとして平均最終ライブラリサイズを考慮する: 新しい0.2 mL 96ウェルプレートで滅菌PCR水で精製した2番目のPCR製品を希釈します。メモ: プレートは-20°Cで保存できます。それ以外の場合は、残りの手順を停止せずに実行する必要があります。 アリコート3 μLの各4 nM秒PCR製品を、プールされたライブラリとして新しい無菌1.5 mLチューブにすべて混合します。チューブは4°Cまたは氷浴で常に保管してください。 核酸定量分光光度計を用いて確認するために、プールされたライブラリーの濃度を測定します。4 nMより高い場合は、濃度を4 nMに調整します。注:濃縮されたDNAは、推定値の読み取り数を生成し、分析を妨げます。 DNAの変性とシーケンシング注:このセクションでは、特定の試薬とイルミナMiSeqシステムを使用しています。 「部品表」の製品番号を参照してください。注意:厳密に時間に従ってください。シーケンスの日にカートリッジを除くすべての試薬を解凍します。 シーケンシングの前日に、事前に充填された既製の試薬カートリッジを-20°Cから取り出し、解凍のために4°Cで保管します。 1.5 mL 遠心管に適したヒートブロックを96°Cに設定します。 ハイブリダイゼーションバッファーを氷の上に置きます。 PCRグレードの水を用いた新しいチューブで、分子グレードのNaOHを1 Nから0.2 Nに希釈します。 TE バッファ(pH 8.0)を備えたすぐに使用できるコントロールライブラリを新しいチューブ(2 μLの制御ライブラリ + TE バッファの 3 μL)に 10 nM から 4 nM まで希釈します。 「1」とラベル付けされた新しいチューブに4 nMの制御ライブラリの4 μLと4 nMプールされたサンプルライブラリの16 μLを混ぜます。 「2」とラベル付けされた新しいチューブに、10 μLの0.2 N NaOHをチューブ”1″に10 μL混ぜます。 チューブ2を5sにボルテックスし、短時間スピンダウンし、室温で5分間インキュベートする。 チューブ2に980μLのハイブリダイゼーションバッファを加えます。 「3」とラベル付けされた新しいチューブで、チューブ2からのサンプルを390 μLのハイブリダイゼーションバッファと混ぜます。チューブを反転して混ぜます。 チューブ3を96°Cで2分間インキュベートし、すぐに氷の上に最大2分間置きます。 4 °Cの冷蔵庫からカートリッジを取り外します。 表 6のように、対応する各インデックス 1 アダプタとインデックス 2 アダプタを使用して、シーケンス用のサンプル シートを設定します。 MiSeq v3キットからフローセルを取り外します。滅菌分子グレードのPCR水でフローセルを静かに洗浄します。注:フローセルの毛細管の点に水を注がないでください。繊維質でない紙でフローセルから水を静かに拭き取ります。 チューブ3(650 μL)の全容をカートリッジに積み込みます。 計測器操作ソフトウェアで、シーケンスを選択し、指示に従います。フローセル、取込みバッファ、カートリッジを挿入します。サンプルシートをロードします。 実行 を押して、反応を開始します。注: このシーケンスの実行には 3 ~ 5 日かかります。データは自動的に Basespace プラットフォームにアップロードされます。生データは、コンピュータの2つのフォルダに保存されます: fastqファイルを含む分析フォルダとbclファイルとjpeg画像を含む出力。 4.優先順位データへの分類の割り当て ファストQ ファイル処理注: R24の DADA2 パッケージ23 FASTQ ファイルを処理する推奨データベースの 1 つです。ガイドラインは[https://github.com/mickeykawai/exec_dada2]で入手できます。このガイドラインは、最近のバージョンのDADA2パイプラインチュートリアル[https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html]を採用して作成されました。 加工プログクォンクのペアエンドシーケンスを加工して、トリミング、品質フィルタリング、非レプリケーション、ユニークシーケンスの逆行とカウント、サンプル推論、コンティグへのマージ、およびキメラシーケンスの除去を行います。 16S rRNA および 18S rRNA 遺伝子フラグメントの両方に対して、以下の DADA2 指定されたパラメーターを使用します。トリムレフト=0、0、truncLens=[シーケンスの品質を確認し、適切な長さに設定]。注: 他のパラメーターのデフォルト値は、maxN=0、maxEE=2、trancQ=2 です。 分類の割り当て注: DADA2 [silva_nr_v132_train_set.fa.gzの分類の割り当てには、デフォルトとして設定されている SILVA rRNA データベースが推奨されます。 16S rRNA遺伝子断片解析のために葉ロプラストとミトコンドリアOTUsを除去します。16S rRNAおよび18S rRNA分析からシングルトンを除去します。 最も低いシーケンス深度を持つサンプルに基づいて、すべてのサンプルをシーケンシング深さに均等にします。 読み取り数、OTUs、およびどのレベルで、フィルター処理された読み取り、および除外されたシングルトンの数を記録します。 統計分析 フィロース25 とビーガン26のRパッケージを使用して微生物データに対する統計解析を行う。