Un procedimiento estandarizado para monitorear las floraciones de algas nocivas en Chile mediante el análisis de metacódigo de barras

1. Recogida de muestras y pretratamiento Recolecte aproximadamente 3 L de muestra de agua del punto objetivo. Filtre 1 L de muestra de agua para el análisis de ARNr 16S a través de una filtración en tándem (membrana de tamaño de poro de 1 μm y 0,2 μm) para separar las bacterias de vida libre y las adheridas. Filtre otra muestra de 1 L de agua para el análisis de ARNr 18S (detección de fitoplancton) a través de una sola filtración con una membrana de 0,2 μm.NOTA: La filtración de la muestra de agua debe completarse dentro de las 12 h posteriores al muestreo. Cortar la membrana filtrada por la mitad con tijeras quirúrgicas estériles y envolverla con papel de aluminio. Conservar a -20 °C durante un máximo de 1 mes o continuar con el siguiente paso. Extraer ADN con el método Chelex como se describe9. Conservar a -20 °C durante un máximo de 1 mes. 2. Análisis de microscopio Transfiera 1 ml de la muestra de agua por una pipeta a un tobogán de rejilla de 1 ml. Observe la muestra bajo un microscopio. Registre los nombres y la cantidad de especies de fitoplancton. 3. Análisis de metacódigo de barras de ARNr 16S y ARNr 18S NOTA: Este proceso consta de siete secciones: preparación, primera generación de amplicón PCR, primera limpieza de amplicones, indexación por segunda PCR, segunda verificación y limpieza de amplicones PCR, ajuste de concentración de ADN y desnaturalización y secuenciación de ADN. Todo el proceso toma un mínimo de 5 días (40 h) por un personal de laboratorio experimentado. Consulte la Tabla de materiales para conocer los números de producto y los fabricantes. Preparación Limpie las pipetas y el gabinete de la campana laminar con 70% de etanol seguido de exposición a los rayos UV durante 30 minutos con frecuencia. Esterilizar los materiales a utilizar. Descongele las muestras de ADN a temperatura ambiente, centrífuga a 100 x g durante 2 min y transfiera 100 μL de cada sobrenadante de muestra a tiras de 8 tubos. Primera generación de amplicones PCRNOTA: Realice los siguientes procedimientos en un gabinete de campana laminar. Diluya siempre los cebadores de 1 μM a la concentración objetivo con agua de grado PCR para evitar la contaminación de la imprimación. Preparar la primera mezcla maestra de PCR en un tubo estéril de 1,5 ml para las reacciones (Tabla 1, Tabla 2). Alícuota 22,5 μL de la mezcla maestra en una tira de 8 tubos y añade 2,5 μL de muestra de ADN. Utilice 2,5 μL de agua de grado PCR para el control negativo. Ejecutar el primer ciclo de PCR (Tabla 3). Preparar 100 ml de gel de agarosa-TBE al 2% que contenga 10 μL de 1x tinción de gel de ácido nucleico. Cargue una mezcla de 1,5 μL de 1x colorante de carga de ADN y 4 μL de producto pcrista en el gel de agarosa. Además, cargue una escalera de ADN de 100 pb en el gel. Realizar electroforesis a 100 V durante 30 min. Asegúrese de que haya una banda en el rango de 500-600 pb bajo una captura de imagen con luz UV. La banda del dímero de imprimación es redonda de 80 pb.NOTA: Las muestras de agua marina contienen inhibidores de PCR. Los amplicones faltantes a veces se pueden resolver diluyendo muestras 1:100 o 1:1000 con agua de grado PCR. Guarde los primeros productos de PCR a -20 °C hasta el siguiente paso.PRECAUCIÓN: No exceda una semana de almacenamiento. Primera limpieza de amplicon PCRNOTA: Esta sección se puede realizar fuera de un gabinete de campana laminar. Utilice el sistema de limpieza de ADN de perlas magnéticas para eliminar los residuos de reacción de PCR, incluidos los productos de dímero de imprimación. Transfiera 20 μL de cada primer producto de PCR limpiado a una nueva placa de 96 pocillos. Selle la placa con una película de microsellado. Conservar a -20 °C hasta que se proceda al siguiente paso.PRECAUCIÓN: No exceda más de una semana de almacenamiento. Indexación por segunda PCRNOTA: En esta sección, los primeros productos de PCR purificados se amplificarán con varias combinaciones de imprimación de índice. Diluya todos los cebadores de Índice 1 e Índice 2(Tabla 4)a 1 μM con agua de grado PCR en tiras de PCR de 8 tubos colocadas en un gabinete de campana laminar.NOTA: Los pasos en adelante en esta sección se pueden realizar fuera de un gabinete de campana laminar, ya que los cebadores de índice son específicos del primer adaptador de voladizo de reacciones de PCR. Posición Índice 1 imprimación en una fila horizontal Índice 2 imprimaciones en una fila vertical (Tabla 5). En una nueva placa de 96 pocillos, agregue 12.5 μL de formulación lista para el arranque en caliente a cada pozo. Agregue 2.5 μL de cada imprimación de índice (1 μM) a cada pozo como en la Tabla 4 usando una pipeta multicanal. Añadir 7,5 μL del primer producto de PCR purificado. Mezclar suavemente mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Cubra la placa con una película de microsellado. Ejecutar el segundo ciclo de PCR (Tabla 3). Mantenga la placa a -20 °C.PRECAUCIÓN: No exceda una semana de almacenamiento. Segunda verificación y limpieza de amplicones PCR Utilice un analizador de fragmentos y un reactivo asociado. Reactivo de vórtice y spin down antes de su uso. Permita que el búfer de muestra y la cinta de detección de ADN se equilibren a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, coloque la cinta de pantalla de ADN en un analizador de fragmentos. Mezclar 2 μL de tampón de muestra y 3 μL de segundo amplicón PCR en nuevas tiras de 8 tubos. Inserte las 8 tiras de tubo en el analizador de fragmentos. Presione Ejecutar para comenzar.PRECAUCIÓN: Se debe evitar la formación de burbujas de aire. Asegúrese de que los segundos amplicones de PCR sean de aproximadamente 613 pb (600 – 630 pb) para los genes 16S y 18S rRNA. Purificar los productos de segunda PCR utilizando un sistema de limpieza de ADN de perlas magnéticas. Ajuste de la concentración de ADN Mida la concentración de ADN en los segundos productos de PCR purificados utilizando un espectrofotómetro de cuantificación de ácido nucleico. Calcule la concentración de genes objetivo en nM, teniendo en cuenta el tamaño promedio de la biblioteca final como 613 pb para los genes 16S y 18S rRNA: Diluya cada segundo producto de PCR purificado con agua estéril de PCR a 4 nM en una nueva placa de pozo de 0,2 ml 96.NOTA: La placa se puede almacenar a -20 °C aquí. De lo contrario, el resto de procedimientos deben realizarse sin detenerse. Alícuota 3 μL de cada segundo producto de PCR de 4 nM y mezcle todo en un nuevo tubo estéril de 1,5 ml como biblioteca agrupada. Mantenga el tubo a 4 °C o en baño de hielo en todo momento. Mida la concentración de la biblioteca agrupada para su confirmación utilizando un espectrofotómetro de cuantificación de ácidos nucleicos. Ajuste la concentración a 4 nM si es superior a 4 nM.NOTA: El ADN sobreconcentrado produce números de lectura sobreestimados, lo que dificulta el análisis. Desnaturalización y secuenciación del ADNNOTA: Esta sección utiliza el sistema Illumina MiSeq con reactivos específicos. Ver números de producto en Tabla de Materiales.NOTA: Siga estrictamente el tiempo. Descongele todos los reactivos excepto los cartuchos el día de la secuenciación. Un día antes de la secuenciación, retire un cartucho de reactivo listo para usar precargado de -20 °C y guárdelo a 4 °C para descongelarlo. Ajuste un bloque de calor adecuado para tubos de centrífuga de 1,5 ml a 96 °C. Coloque el tampón de hibridación sobre hielo. Diluir El NaOH de grado molecular de 1 N a 0,2 N en un tubo nuevo con agua de grado PCR. Diluya una biblioteca de control lista para usar con tampón TE (pH 8.0) de 10 nM de stock a 4 nM en un tubo nuevo (es decir, 2 μL de biblioteca de control + 3 μL de tampón TE). Mezcle 16 μL de la biblioteca de muestras agrupadas de 4 nM con 4 μL de la biblioteca de control de 4 nM en un nuevo tubo etiquetado como “1”. Mezclar 10 μL de muestra en el tubo “1” con 10 μL de 0,2 N NaOH en un tubo nuevo etiquetado como “2”. Vórtice el tubo 2 durante 5 s, gire brevemente e incube a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir 980 μL de tampón de hibridación al tubo 2. En un nuevo tubo etiquetado como “3”, mezcle 260 μL la muestra del tubo 2 con 390 μL de tampón de hibridación. Mezclar invirtiendo el tubo. Incubar el tubo 3 a 96 °C durante 2 min e inmediatamente colocarlo en hielo durante un máximo de 2 min. Retire el cartucho del refrigerador a 4 °C. Configure la hoja de muestra para la secuenciación con cada adaptador de índice 1 e índice 2 correspondiente como en la Tabla 6. Retire la celda de flujo del kit MiSeq v3. Limpie suavemente la célula de flujo con agua estéril de PCR de grado molecular.NOTA: No vierta agua sobre los puntos capilares de la célula de flujo. Limpie suavemente el agua de la célula de flujo con papel no fibroso. Cargue el volumen completo del tubo 3 (650 μL) en el cartucho. En el software de operación del instrumento, seleccione la secuenciación y siga las instrucciones. Inserte la celda de flujo, el búfer de incorporación y el cartucho. Cargar hoja de muestra. Presione Ejecutar para iniciar la reacción.NOTA: Esta ejecución de secuencia tardará de 3 a 5 días. Los datos se cargarán automáticamente en la plataforma Basespace. Los datos sin procesar se almacenarán en dos carpetas en la computadora: la carpeta de análisis que contiene archivos fastq y la salida que contiene archivos bcl e imágenes jpeg. 4.Asignación taxonómica a datos de secuenciación Procesamiento de archivos FASTQNOTA: DADA2 paquete23 de R24 es una de las bases de datos recomendadas para procesar archivos FASTQ. La guía está disponible en [https://github.com/mickeykawai/exec_dada2]. Esta guía se preparó adoptando la versión reciente del tutorial de canalización DADA2 [https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html]. Procese secuencias de extremo emparejado FASTQ sin procesar para recortar, filtrar de calidad, desreplicar y contar secuencias únicas, inferencia de muestras, fusionarse en contigs y eliminar secuencias quiméricas. Utilice los siguientes parámetros especificados por DADA2 para los fragmentos de genes de ARNr 16S y ARNr 18S; trimLefts=0, 0, truncLens=[Compruebe la calidad de la secuencia y configúrela en una longitud adecuada].NOTA: Los valores predeterminados para los otros parámetros son maxN=0, maxEE=2,2, trancQ=2. Asignación de taxonomíaNOTA: Se recomienda la base de datos SILVA rRNA para la asignación de taxonomía para DADA2 [silva_nr_v132_train_set.fa.gz se establece como predeterminado]. Elimine el cloroplasto y las OTU mitocondriales para el análisis de fragmentos del gen 16S rRNA. Elimine los singletons del análisis de ARNr 16S y ARNr 18S. Enrarifique todas las muestras a una profundidad de secuenciación uniforme basada en la muestra que tiene la profundidad de secuenciación más baja. Registre el número de lecturas, las OTU asignadas y en qué nivel, las lecturas filtradas y el número de singletons excluidos. Análisis estadístico Realizar análisis estadísticos sobre datos microbianos utilizando paquetes R de phyloseq25 y vegano26.