ダクト:3D肝臓解析のためのマイクロコンピュータ断層撮影に続く二重樹脂鋳造

この研究に記載されたプロトコルは承認され、ストックホルムノラ・ジュルフェルセクセティスカ・ナムント(ストックホルム動物研究倫理委員会)の動物福祉規則と規制に従っています。本研究で使用された動物は、混合C3H/NおよびC57bl6Jバックグラウンドで野生型またはホモ接合型Jag1H268Q変異マウスであった。男性と女性の両方が研究に含まれていました。動物は出生後15日目に、または3〜8ヶ月の間に成人として使用された。 1. 二重樹脂注入 準備樹脂溶液を準備します。二重系樹脂注入の場合、ステップ1.1.2-1.1.4に記載されているように黄色と緑の両方の樹脂を準備します。 1マウスにつき希釈樹脂の1mLアリコートを準備します。 イエローレジン:3:1希釈で透明希釈したイエローシリコーンゴム(高放射性pacity)を希釈し、注射用の黄色樹脂を調製します。 グリーン樹脂:青いシリコーンゴム(検出不可能な放射性パシティ)と1:1希釈で透明希釈剤を混合し、ブルー樹脂を調製します。グリーン樹脂を生成するには、希釈した青色樹脂と希釈黄色樹脂を1:1の比率で混合します。色が均質になるまで、グリーン樹脂を完全に渦に入れる。注:ブルー樹脂は、マイクロCTでは検出できない非常に低い放射性pacityを有するため、異なる放射性pa00で2つの樹脂を作成するために黄色の樹脂で希釈する必要があります。注意: 樹脂には、発がん性物質である鉛クロメートが含まれている場合があります。それは火の中で有毒ガスを生成します。取り扱い、有害廃棄物として樹脂を処分します。 ステップ 1.1.6-1.1.11 で説明されているように、チューブを使用して 2 つのインジェクション セット (射出セット #1 および射出セット #2) を準備します。注:成体マウス(>P30(出生後30日目)=P30-2年)の場合、一般的な胆管注入用注射セット#1(0.6mm外径のPE10チューブ)と注射セット#2(0.96mm外径のPE50チューブ)を使用して、ポータル静脈注入を行います。若い出生後マウス(P30まで)の場合は、胆管用とポータル静脈注射用の2つの#1注射セットを準備します(ポータル静脈が狭すぎてPE50チューブを収容するには注射セット#2はありません)。 ●射出セット#1を用意するには、PE10チューブの30cmを切り、できるだけ薄くなるまで引っ張ってチューブの片端を手で伸ばす(図1A、B、直径約0.15mm、伸ばされていないPE10チューブ径は0.6mm)。 伸びた PE10 チューブの先端を斜めに切り、斜めの先端を作成します(図 1B)。 PE10チューブの非伸ばされた端を30G針に接続します(図1A、インジェクションセット#1)。 インジェクションセット #2 を準備するには、PE50 チューブの 30 cm を切断し、それを引っ張って管の一方の端を手で引っ張り、ポータル静脈に収まるほど薄くなるまで引き上げます (図 1A、B、約 0.7 mm、伸ばさない PE50 チューブ径は 0.96 mm)。 伸びた PE50 チューブの先端を斜めに切り、斜めの先端を作成します(図 1B)。 PE50チューブの非伸ばされた端を23G針に接続します(図1A、射出セット#2)。注: 各インジェクション セットは、樹脂がシリンジとチューブで硬化するため、1 回の射出にのみ使用できます。マウスの一般的な胆管と門脈のサイズに基づいて、伸ばされ、ベベアされた先端のサイズを調整します。チューブの大きさやフィット感が不明な場合は、切開後、チューブが樹脂で満たされる前に、適切なダクトまたは容器にチューブを挿入します。チューブが広すぎて管/容器に収まらない場合は、さらに伸ばします。 イオフルラン吸入(最初の4%の誘導チャンバーで、鼻コーンを使用して〜2%)によって動物を麻酔します。 マウスが鼻コーンを通してイオブルランを呼吸している間、解剖パッドの換気ベンチにマウスを置きます。例えば、足の1つをつまむことによって、動物が研究所/IRB推奨の方法で意識不明であることを確認します。注意:イオブルランは吸入時に眠気やめまいを引き起こし、長期または繰り返し暴露を通じて心血管系および中枢神経系に損傷を引き起こす可能性があります。吸い込まないで下ろしてください。換気ベンチと換気の良い場所で物質を扱います。注:心臓灌流と互換性がある限り、別の麻酔方法を使用することができます。 動物が意識を失ったら、腹側に70%エタノールを吹き付けて毛皮からの干渉を防ぎます。 皮膚はさみを使用して、腹腔の中線から皮膚、筋膜、筋層を切断し、胸腔に切り抜いて内臓を露出させる。 胸骨を持ち上げ、両側の横隔膜と肋骨ケージを切断して心臓と肺を露出させる鉗子でxiphoidプロセスをつかむ。 リブケージの左右のリブをはさみで切り取って、リブケージを取り外します。これは樹脂の漏出をもたらすので、肝臓を損傷しないように特別な注意を払ってください。 ストレート鉗子を使用して、肝臓に向かって心臓を引っ張り、右心房を切り取ります。 蠕動性灌流ポンプに接続された蝶の針(23G)を左心室に挿入する。ハンクスバランス塩溶液(HBSS)とヘパリン(マウス体重1U/g)でマウスを経皮的に浸透させる。5 mL/分の灌流速度で3分間パーフューズします。注:マウスが正しく浸透している場合、内臓、特に肝臓が薄くなります。代わりに、肺が白くなっている場合、針は右心室に挿入され、再配置する必要があります。灌流後、マウスを剥離し、鼻コーンとイオブルランから除去することができる。 イオフルランポンプをオフにします。 樹脂注入 – 胆道系樹脂鋳造マウスを解剖顕微鏡に移動し、腹部を上に、実験者に向かって尾を動かし、実験者から離します。目的の解剖学的ランドマークは 図2Aに示されています。 腸を横に移動させることにより、下の大静脈(図2A)を見つけます。スプリングハサミを使用して、下の大静脈に小さな横切り切開を行い、肝血管圧の放出を可能にします(図2Bi)。 手順 1.2.4~ 1.2.6 で説明されているように、共通の胆管と門脈を公開します。 リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用して、腸と膵臓を右側(実験者)に移動します。 PBS湿った綿棒を使用して肝臓の腹側を心臓に向けて反転させ、内臓表面およびヒラル領域を露出させます。 膵臓を横切って腸管に入る共通の胆管を見つけ出します(図2Bii、黄色い点線で輪郭を描いた一般的な胆管、黒い矢印はオディの括約筋を指しています)。注:PBSに散水して、肝臓が手順全体を通して湿っていることを確認してください。 ストレート鉗子を使用して共通の胆管から周囲の組織(面積〜5mm)をクリアします。シルク縫合糸(サイズ4-0、0.17mm、長さ3~5cm)を共通の胆管(図2Bii)の下に配置し、共通の胆管(図2Biii)の周りにゆるいオーバーハンドの結び目を結びます。注:ヒラー領域とオディの括約筋の中間の結び目の領域を選択し、共通の胆管の周りに縫合糸が締め付けられた後、それがポータル静脈注入を妨げないように、ポータルの静脈からある程度の距離で。 春のはさみを共通の胆管に対して平らに持ち、オディの括約筋の隣に共通の胆管が膵臓と腸に入る場所で、共通の胆管に斜め切開を行います。(図2Biv)、黄色の点線は、黒い矢印で強調されたオディ領域の括約筋を囲む。注: これは重要なステップです。斜めのカットではなく、トランスバーサルカットを行い、切開を行います。胆管を切断しないでください。胆管全体を切断すると、チューブの挿入は非常に困難になります。 使用直前に、黄色樹脂の1mLを50μLの硬化剤と混合し(1mLシリンジを充填して空にして)、1mLルアーシリンジに樹脂-硬化剤混合物を充填します。 充填したシリンジをチューブ(セット#1)に接続します。チューブを完全に充填するためにプランジャーを押します。樹脂/硬化剤がチューブの先端から滴り落ちることを確認します。注: 最良の結果を得るには、シリンジとチューブの泡を避けて取り除きます。 鉗子を使用して、共通の胆管切開部の周りをまっすぐにし、一般的な胆管の開口部にチューブを挿入します(図2Bv)、ベベリング先端の最も長い端を胆管の後側に向かって下向きにします。この向きにより、樹脂が上向きのチューブ開口部をダクトに出すことができます(図2Bv)。 シルク糸の結び目を締めて、共通の胆管内のチューブを固定します(図2Bvi)。 一般的な胆管に樹脂を注入します。胆嚢と個々の肝臓葉を観察します。 PBS湿った綿棒で肝臓をマッサージし、樹脂を均等に広げます。樹脂で満たされた胆管の末端枝(野生型マウス)は、肝臓表面でかすかに見える。注:肝臓を埋めるために予想時間は30 -100 sです。 肝臓の表面に樹脂のドットが現れた場合(図2Ci、青い矢印)、または抵抗性が満たされたときに樹脂を注入停止します。注:樹脂硬化剤を添加した後、樹脂が硬化し始めるので、できるだけ速く作業してください。硬化剤の添加からの作業時間は約15分です。 一般的な胆管から引き出してチューブを取り外し、鉗子を使用してシルクノットを素早く締め、樹脂が漏れないようにします。絹の縫合糸の緩い端を切り取り、門脈注入を妨げないようにします。 樹脂と残りの樹脂を含むチューブを有害廃棄物に処分し、針を鋭利な廃棄物に入れる。 樹脂注入 – ポータル静脈樹脂鋳造 まっすぐな鉗子を使用して肝臓への入り口から約2cmの周囲の組織から門脈(面積〜5mm)を取り除く。絹の縫合糸(サイズ4-0、0.17 mm、3-5 cm)を門脈のクリアされた領域(図2Ci)の下に置き、ゆったりとしたオーバーハンド結び目を結びます(図2Cii)。 肝臓と結び目に遠位の門脈で縦切開を行います(図2Ciii)。 緑色樹脂1mLを50μLの硬化剤と混合し(1mLシリンジを充填して空にして)、1mLルアーシリンジに樹脂硬化剤混合物を充填します。 充填された注射器をチューブに接続します(>P30マウスの場合は#2、<P30マウスの場合は新しいセット#1)。チューブを完全に充填するためにプランジャーを押します。樹脂がチューブの先端から滴り落ちることを確認します。注: 最良の結果を得るには、シリンジとチューブの泡を避けて取り除きます。 鉗子を使用して、周囲の組織を実験者に向かって引っ張って門脈をまっすぐにし、容器の裏側に向かってベベリング先端の最も長い端を持つ管を挿入する(図2Ciii)。 絹糸を締めて、ポータルの静脈のチューブを固定します。 ポータルの静脈に樹脂を注入します。血管が樹脂で満杯になっらっているのを観察する。PBSウェット綿棒で肝臓をマッサージし、樹脂を均等に広げます(図2Civ)。 すべての血管が満たされている場合(門脈の端部が肝臓周辺で見える)、または抵抗が満たされたときに、樹脂の注入を停止します。注:硬化剤を添加した後、樹脂が硬化し始めるので、速く作業してください。硬化剤の添加による作業時間は、射出セット#1で約15分、射出セット#2で約25分です。 ポータルの静脈からチューブを引き出してチューブを取り外し、鉗子を使用してシルクノットを素早く締め、樹脂が漏れないようにします。 樹脂と残りの樹脂を含むチューブを有害廃棄物に処分し、針を鋭利な廃棄物に入れる。 肝臓解剖と固定周囲の組織と横隔膜から肝臓全体を切り取ることによって、肝臓全体を解剖します。 肝臓の変形を防ぐために、腹側を上に向け、側側を円錐管の壁に置いた空の50 mL円錐形のチューブに肝臓全体をそっと置きます。円錐形チューブを4°Cで水平に一晩保管し、樹脂が完全に硬化するようにします。注:肝臓に合う大きさの容器は、50 mLの円錐形チューブの代わりに使用することができます。平底容器を使用すると、肝臓が変形しない可能性が高くなります。 肝臓を個々の葉に分ける。マイクロCT解析(1.4.4-1.4.5)または品質管理(1.4.6-1.4.8)に使用されるローブを選択します。必要に応じて、個々のローブにそれを分離することなく、光クリアリングとmicroCTの両方のために肝臓全体を使用してください。注:胆道系と血管系の肝臓アーキテクチャは、各葉で異なっており、したがって、一致したローブ分析が必要です。光学的な清算はマイクロCTスキャンに干渉せず、後でマイクロCTでの品質管理に使用されるローブをスキャンすることができる。逆に、マイクロCTでスキャンされたサンプルは、後で光学的に比較のためにクリアすることができます。肝臓全体の分析は、このように可能です.野生型マウス(C3H/C57bl6遺伝的背景)では、適切な内側葉が最初に樹脂注射によって充填され、最も再現性の高いマイクロCT分析に適したローブとなる。左横葉は最大のローブであり、注射品質を事前にスクリーニングすることは容易である。品質管理とマイクロCTスキャンに使用されるローブ(または肝臓全体)の選択は、動物モデルと研究の質問に依存します。 換気フードで、4%ホルムアルデヒド溶液(チューブあたり10-20 mL)を調製します。マイクロCTに使用するローブを4°Cで一晩4%ホルムアルデヒドで固定し、その後PBS(1管あたり10-20 mL)で1回洗浄します。 別の容器にホルムアルデヒド廃棄物を収集します。肝臓葉をPBSで4°Cに保ち、短期保存期間は、エタノールを70%エタノールで長期保存します。セクション 2: マイクロコンピュータ断層撮影に進みます。注意:ホルムアルデヒドは、飲み込んだり、吸入したり、皮膚に接触したりすると急性毒性を引き起こします。ホルムアルデヒドは可燃性の液体と蒸気です。それは重度の皮膚の火傷や目の損傷を引き起こします。アレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性があります。吸入した場合(濃縮または粉末中)、致命的。呼吸刺激を引き起こす可能性があります。遺伝的欠陥を引き起こす疑いがある。癌を引き起こす可能性があります。臓器(目、中枢神経系)に損傷を与えます。予防的な声明 – 熱、熱い表面、火花、開炎、およびその他の点火源から遠ざけます。禁煙。保護手袋と防護服を着用してください。こぼれた場合は、汚染されたすべての衣類を直ちに脱ぐ。皮膚と接触した場合:汚染された領域を水ですすいでください。吸入した場合:新鮮な空気に人を削除し、快適であれば呼吸を監視します。すぐに毒センター/医師を呼び出します。目の場合:数分間水で目をすすいでください。存在し、可能であれば、コンタクトレンズを取り外します。 品質管理のために、残りのローブ(少なくとも1つ)を50%メタノール(脱イオン水と混合)で最低4時間固定し、室温で揺れ動き、続いて室温で100%メタノールを一晩揺らします。メタノール廃棄物を別の容器に回収する。注意:メタノールは、飲み込んだり、吸入したり、皮膚に接触したりすると急性毒性を引き起こします。メタノールは可燃性の液体と蒸気です。保護手袋と衣服を着用してください。取り扱い時の呼吸を避け、火や熱から遠ざけてください。使用後は肌を十分に洗ってください。こぼれた場合は、直ちに汚染された衣類を脱ぐ。水で皮膚をすすいすります。吸入した場合:新鮮な空気に人を取り除き、呼吸のために快適に保ちます。吸入、飲み込まれた、または暴露された場合は、毒センター/医師を呼び出します。 換気フードで、ベンジルアルコールとベンジルベンゾエート(BA:BB、1:2)(ローブあたり5-10 mL)溶液を調製します。 BABB溶液を含む15-または50-mLポリプロピレンチューブ(ローブの大きさに応じて)に肝臓のローブを入れる。透明になるまで室温で揺れ動かせます。このステップは、ローブの大きさに応じて2〜16時間かかります。注意:BABBソリューションは、プラスチックの特定のタイプを溶解します。ポリプロピレンチューブやガラス容器にサンプルを保管しても安全です。注意:ベンジルベンゾアートは、飲み込むと急性毒性を引き起こす可能性があります。それは長期的な効果を伴う水生生物に有毒である。予防的な注意事項:取り扱い後に皮膚を十分に洗います。飲み込んだり、皮膚に触れたり、吸入したりすると有害です。煙/蒸気を吸い込まないでください。取扱い後は手を十分に洗ってください。本製品を使用する際は、飲食・喫煙はご利用ください。飲み込んだ場合 – 体調が悪い場合は毒センター/医師を呼び出します換気された領域で使用してください。こぼれを集める。許可された廃棄物処理プラントに内容物/容器を処分する。 射出の品質を検査します。適切に注入された肝臓のみをmicroCTでスキャンする必要があります。. 2. マイクロコンピュータ断層撮影 サンプル準備 100mLの蒸留水と1gのアガロース粉末を混合して、1%のアガロースゲルを調製します。混合物を電子レンジに入れ、アガロース粉末が溶解するまで溶液を沸騰させます。 肝臓試料への熱的損傷を避けるために、1%アガロースゲルを〜40°Cに焼戻す。 目的のローブを15 mL円錐形チューブに入れ、1%アガロースゲルでチューブの総容積の約2/3に充填します。このステップはCT測定の間の望ましくないサンプルの動きを最小にする。 CT測定メモ: 次の手順は CT デバイスに依存しており、CT デバイスや製造元によって特定の設定と動作が異なる場合があります。このプロトコルでは、使用されるマイクロコンピュータ断層撮影スキャナは、ナノフォーカスX線管(180kV/15 W)とフラットパネルダイナミック41|100(4048 px x 4048 px、ピクセルサイズ100mm、ビニング2)を搭載していました。 サンプルを用いて15 mL円錐管をCT装置の回転ステージに取り付け、少なくとも1時間測定室に熱的に適応させます。 サンプルが熱的に調整されたら、視野(FOV)で中央に配置します。 ソースサンプルとサンプル検出器の距離(SSD、SDD)を最適化して、成人マウス肝臓サンプルの場合は12μm、<P30肝臓では6.5μm、FOV(事前指定ハードウェア用)の寸法に対応する24.3mm ×、13.2mm×13.2mmに対応します。 検出された信号の十分なレベルに達するために、CTデバイスメーカーの推奨に従って、取得パラメータ(すなわち、電圧と電流、露出、ビニング、平均を加速)を設定します。これらのパラメータは、CTデバイスに依存するだけでなく、サンプルに依存するものであり、各サンプルに対して最適化する必要があります。ハンケオバら9では、80kV加速電圧、160μA加速電流、400ms露光時間、2000画像の設定が行われました。 CT測定を開始します。専用の断層再構成ソフトウェアを使用して、CTデータを再構築します。 3. 分析とデータのセグメンテーション 注: 次の手順は、イメージ処理ソフトウェアに依存します。使用するソフトウェアによって、設定やアクションが異なる場合があります。 CT データを読み込む: ファイル>インポート>コマンドを選択します。さらに選択は、処理される CT データの特定の形式に依存します。 上部パネルの[ 表面決定] 関数を使用して、グローバルしきい値を使用してデータ内の樹脂をセグメント化します。ダイアログウィンドウで、赤い「等値」線の位置を樹脂で満たされた容器のみをセグメント化するように設定することで、ヒストグラム評価でしきい値を決定します(すなわち、提示された「プレビューパネル」の黄色い線に囲まれた)。 左側のパネルで、 ボリューム/CAD/メッシュから ROI を作成 するモジュールを選択して、樹脂充填容器の対象領域(ROI)を作成します。ダイアログウィンドウで、[ ソリッドから ROI を作成]オプションを使用して、処理されたボリュームの名前を選択して確認します。 この ROI のバックグラウンド領域におけるノイズ クラスタの誤ったセグメンテーションを排除します。右側のパネルでこのROIをマークし、右クリックしてモジュール スプリットROIを選択します。 ダイアログ ウィンドウで、すべてのノイズ パーティクルを除外する最小体積 [ボクセル] パラメータを設定します 。 例えば、空気泡や樹脂漏出の存在など、樹脂キャストROIにアーティファクトを含まない、滑らかで連続的で固体の運河マスクを作成します。 左側のパネルで スムージング モジュールを使用し、[ スムージング強度] パラメータを 1 または 2 に設定します(個々のデータによっては、値が大きいほどモデルの変形が発生する場合(特に微細な構造を扱う場合)を指定します。必要に応じて、このプロセスを 2 回実行します (図 3C)。 セグメント化された樹脂マスク内の個々の管状システムを識別し、分離します。 CT データの強度値が高い、より吸収性樹脂 (共通の胆管注入に使用される黄色の樹脂) を充填したシステムに対して別の ROI を作成します。ステップ 3.2 で説明されている手順に従います。(図 3Di)。 新しい ROI と樹脂マスク ROI をマークし、右クリックして [ROI を減算(S)]を 選択し、樹脂マスク ROI から新しい ROI を減算して残りの管状システムの新しい ROI を作成します(図 3Dii、iii)。 異なるソフトウェアでの後続処理のために、オペレータの好みに基づいて、両方の管状システムの結果のROIをさまざまな形式でエクスポートします。さらに、結果の ROI をボリューム・グラフィックス・ソフトウェアで処理し、最終的な視覚化をイメージまたはビデオの形式でエクスポートします。