DUCT: الصب الراتنج المزدوج تليها التصوير المقطعي المحوسبة الدقيقة لتحليل الكبد 3D
Summary
الراتنج المزدوج الصب التصوير المقطعي المصغر، أو DUCT، تمكن التصور والرقمنة، وتجزئة نظامين أنبوبي في وقت واحد لتسهيل تحليل 3D من بنية الجهاز. DUCT يجمع بين حقن الجسم الحي السابق من اثنين من راتنجات المشعة تليها المسح المقطعي المحوسبة الدقيقة وتجزئة البيانات الطبوغرافية.
Abstract
الكبد هو أكبر عضو داخلي في البشر والفئران ، وارتفاع السيارات الفلورسينس يمثل تحديا كبيرا لتقييم الهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد (3D) للجهاز على مستوى الجهاز كله. تتميز بنية الكبد بهياكل متفرعة متعددة ، والتي يمكن ملؤها بالراتنج ، بما في ذلك الأشجار الوعائية والبيليارية ، مما يؤسس لنمط نمطي للغاية في parenchyma الغنية بالخلايا الكبدية. يصف هذا البروتوكول خط أنابيب لإجراء التصوير المقطعي الدقيق للراتنج المزدوج، أو “DUCT”. DUCT ينطوي على حقن الوريد البوابة والقناة الصفراوية المشتركة مع اثنين من الراتنجات الاصطناعية المشعة المختلفة، تليها تثبيت الأنسجة. مراقبة الجودة عن طريق إزالة فص واحد، أو الكبد بأكمله، مع عامل المقاصة البصرية، يسمح للفحص المسبق للعينات حقن مناسب. في الجزء الثاني من خط أنابيب DUCT ، يمكن استخدام الفص أو الكبد بأكمله لمسح التصوير المقطعي المصغر (microCT) ، (شبه) التقسيم الآلي ، وتقديم ثلاثي الأبعاد للشبكات الوريدية والقبيلية للبوابة. ينتج عن MicroCT بيانات تنسيق ثلاثية الأبعاد للراتنجين تسمح بإجراء تحليل نوعي وكمي للنظم وعلاقتهما المكانية. يمكن تطبيق DUCT على كبد الفأر بعد الولادة والبالغين ويمكن توسيعه إلى شبكات أنبوبية أخرى ، على سبيل المثال ، شبكات الأوعية الدموية والخطوط الجوية في الرئتين.
Introduction
صب راتنج الجهاز هو تقنية يعود تاريخها إلى القرن السابع عشر1. تم إجراء أحد الأمثلة الأولى على صب الراتنج الحديث على الكبد البشري من تشريح الجثة. امتلأت القنوات الصفراوية داخل الدماغ بعامل تباين ممزوج بالجيلاتين، يليه التصوير بالأشعة المقطعية بالأشعة السينية 2. والهدف من تقنية DUCT هو تصور ورقمنة وتحليل شبكتين أنبوبيتين من الراتنج المصبوب ، جنبا إلى جنب ، في 3D.
ويستند DUCT على المعرفة القائمة واسعة من الصب راتنج الكبد نظام واحد3,4,5,6,7,8 ويمتد إلى التصور 3D في وقت واحد وتحليل نظامين9. قناة متقدمة الصب راتنج واحد لمضاعفة الصب الراتنج عن طريق خلط اثنين من راتنجات الراديوباك من تباين مختلف وحقن هذه الراتنجات في شبكتين مختلفتين، وتحديدا القناة الصفراوية المشتركة والوريد البوابة. يمكن تطبيق DUCT على الفئران الصغيرة بعد الولادة مع نتائج قابلة للاستنساخ في وقت مبكر من يوم ما بعد الولادة 15 (P15). بالمقارنة مع تقنيات التصوير المستندة إلى المجهر ، فإن الميزة الرئيسية هي أن DUCT أسرع وخالية من الأجسام المضادة ، ولا تتداخل الفلورة الذاتية لأنسجة الكبد مع التصوير. علاوة على ذلك ، توفر DUCT بيانات كمية تصف حالة التجويف والقطر الداخلي واتصال الشبكة والتشويش. التمييز بين وجود الخلايا تشكيل التجويف ومورفوجينيس بحكم الأمر الواقع في أنابيب أمر ضروري لتحليل الأعضاء التي الخلايا اللاصقة موجودة ولكن لا تشكل أنابيب، كما يمكن أن يكون الحال في متلازمة ألاجيل10. العيب الرئيسي من DUCT هو اختراق محدود من الراتنج، وهو لزج ولا يدخل أنابيب مع عيار صغير (<5 ميكرومتر). يمكن تطبيق DUCT على أي هيكل أنبوبي بعد تحديد نقطة دخول الحقن ، مثل الأنظمة الدموية الشريانية والنووية ، أو الشعب الهوائية ، أو القناة الصفراوية خارج الهيباتية ، أو الأوعية اللمفاوية. وبالتالي يمكن أن تسهل تحليل بنية الجهاز كله من الأنسجة الأخرى مثل الرئتين والبنكرياس.
يمكن معالجة الصور المجزأة MicroCT باستخدام برامج التصوير المتاحة تجاريا ، مثل ImageJ ، أو خطوط الأنابيب المكتوبة خصيصا (على سبيل المثال ، MATLAB). يمكن تحليل الكبد الذي يتم حقنه بالراتنج نوعيا لتوسيع الشبكة والاتصال بها أو كميا لحجم نظام واحد وطوله وتفريعاه وتوركتوسيتيه والتفاعل بين نظامين مثل المسافة بين نظامين أو تبعية نقطة الفرع (هل يتفرع النظام 1 بالقرب من النظام 2 المتفرع؟). خط أنابيب DUCT يشمل حقن الراتنج، ومسح microCT، وتجزئة بيانات CT، جنبا إلى جنب مع تحليل كمي مفصل للآليات المعمارية من نظامين أنبوبي، يمكن أن توفر معيارا لتحليل الكبد كله في النماذج الحيوانية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحدد عدة خطوات هامة نجاح DUCT، بدءا من إعداد العينة إلى معلمات جهاز CT. لتحقيق أفضل النتائج، يجب استخدام الراتنج المتناقض جيدا والمحقن جيدا والخالي من الفقاعات للسماح للمعالجة الرقمية المباشرة مع العتبة التلقائية للحصول على البيانات والصور والأفلام ثلاثية الأبعاد. مع التدريب واتباع هذا البروتوكول، 90٪ من الحقن ناجحة وتؤدي إلى بيانات قابلة للاستنساخ. من المهم استخدام الراتنج الأصفر الطازج لتحقيق أفضل تباين بين النظامين المحقونين. الراتنج الأصفر لديه تعتيم إشعاعي قوي جدا، في حين أن الراتنج الأزرق لديه تعتيم إشعاعي لا يمكن اكتشافه. يتم تحقيق أفضل النتائج خلال الأشهر الثلاثة الأولى بعد فتح زجاجة راتنج صفراء جديدة. مع مرور الوقت، والراتنج يعجل، وبعد تخزين أطول (>6 أشهر)، والراتنجات الأصفر والأخضر لم يعد يمكن تمييزها في الأشعة المقطعية. وتستلزم الصور ذات التباين الضعيف التتبع اليدوي الشامل والمستهلك للوقت وتجزئة النظامين. بعد ذلك ، لا غنى عن الأنابيب الممتدة جيدا لتناسب القناة الصفراوية الشائعة للفئران البالغة والقناة الصفراوية الشائعة وعروق البوابة للفئران بعد الولادة. يجب إنشاء نقطة الدخول للحقن بعناية. إذا تم قطع القناة الصفراوية الشائعة بشكل عرضي ، فمن المرجح أن تنفصل عن الأنسجة المحيطة ، مما يمنع الدخول الناجح للأنابيب. هذه الخطوة حساسة بشكل خاص للفئران بعد الولادة التي تتراجع فيها القناة الصفراوية الشائعة و “تجعيد الشعر” إذا انفصلت عن الأنسجة المحيطة بها ، مما يجعل إدخال الأنابيب صعبا للغاية. قد يتطلب دخول القناة الصفراوية الشائعة وحقنها بعض الممارسة. أثناء إعداد الأنابيب مع الراتنج وطوال الحقن ، وتجنب تشكيل فقاعة كما فقاعات خلق مساحة سلبية في الصور CT وتتطلب تصحيح يدوي تستغرق وقتا طويلا. من المهم تدليك الكبد بلطف عن طريق التدحرج على سطحه بمسحة قطنية مبللة أثناء وبعد إجراء الحقن لأن هذا يسهل حتى انتشار الراتنج. بعد الانتهاء من حقن وإزالة الأنابيب ، يجب تشديد عقدة خياطة الحرير بسرعة وبعناية ، لذلك لا يتدفق الراتنج من الكبد قبل أن يبوليمر تماما. من أجل التصوير الناجح بالأشعة المقطعية الدقيقة، يجب إصلاح العينة بشكل صحيح في مكانها مع الآغاروز وتكييفها حراريا للقضاء على القطع الأثرية للحركة في بيانات CT. وتكاد تكون إعدادات الاقتناء ذات أهمية رئيسية، وينبغي تحسينها إلى أقصى حد للوصول إلى دقة مكانية كافية لحل الهياكل الدقيقة.
يمكن إجراء تعديلات تقنية على إجراء الحقن لتحقيق الحقن في الفئران الأصغر سنا. حاليا، يتم تقييد الصب الراتنج من كبد الماوس الأصغر سنا من خلال توافر أنابيب رقيقة بما فيه الكفاية، مع PE10 كونها أصغر الأنابيب المتاحة تجاريا. Tanimizu وآخرون حقن بنجاح حبر الكربون في اليوم الجنيني 17 (E17) القناة الصفراوية المشتركة باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية11. ولذلك فإن الاختبار المستقبلي لما إذا كان يمكن توصيل الراتنج عن طريق الشعيرات الدموية الزجاجية سيكون ذا أهمية. تم تكييف DUCT كذلك لحقن الأنظمة الأنبوبية الأخرى مثل الشعب الهوائية ورئة الشريان الوعائي للرئتين9. ويمكن أيضا تعديل حقن الراتنج المزدوج لاستخدامه مع راتنجات أخرى متاحة تجاريا، أو يمكن استخدام هذا البروتوكول للحقن بحبر الكربون.
أحد العوامل الرئيسية المقيدة لخط أنابيب DUCT هو لزوجة الراتنج. DUCT يمكن أن تستخدم فقط لصب الراتنج من الهياكل أنبوبي فوق قطر 5 ميكرومتر. في مجموعة البيانات هذه، يمكن للراتنج اختراق أنابيب ذات قطر أصغر يبلغ 5 ميكرومتر9. هذا الحد من الحجم يحول دون تحليل القناة الدقيقة والشعيرات الدموية الصغيرة. ولمواصلة دفع خط أنابيب DUCT إلى سفن أصغر حجما، ينبغي اختبار راتنجات أخرى متاحة تجاريا، أو قد يؤدي تطوير عوامل جديدة منخفضة اللزوجة للرواية الراديوية إلى تحسين اختراق التجويف.
في Hankeova et al.9 ، تمت مقارنة DUCT بتقنيات أخرى شائعة الاستخدام ، حقن حبر الكربون المزدوج تليها إزالة الأنسجة والتصوير القياسي ، و iDISCO + مع تلطيخ الأوعية الدموية مع خلايا العضلات ألفا الملساء أكتين والقنوات الصفراوية مع cytokeratin 7 ، تليها التصوير ثلاثي الأبعاد9. تفوقت DUCT على الطريقتين الأخريين من حيث التحليل المزدوج (الذي كان تحديا ل iDISCO + بسبب ارتفاع نسبة التفلور الذاتي للكبد) والتصوير ثلاثي الأبعاد والتحديد الكمي (غير ممكن مع حقن حبر الكربون) والتجويف (توفر DUCT بيانات لبنية التجويف الداخلية وتشويش النظام). كما ذكر أعلاه، فإن القيد الرئيسي ل DUCT هو الحد الأدنى لحجم التجويف الذي يمكن حقنه وتحليله (حد 5 ميكرومتر)، وهي معلمة كان فيها أداء كل من حقن حبر الكربون وiDISCO+ أفضل. قناة متفوقة على نظام واحد الصب الراتنج3،5،6 لأنه يسمح تحليل كل نظام حقن على حدة، ويسهل أيضا التحقيق 3D مزدوجة لدراسة العلاقة المعمارية بين النظامين.
يمكن تطبيق DUCT لدراسة أي شبكتين أنبوبيتين في 3D. كدليل على المبدأ ، تم استخدام DUCT لتصور نظم الكبد الصفراوية والوريد البوابي وشرايين الشريان الرئوي والشعب الهوائية في lung9. تتطور القنوات الصفراوية داخل الرحم بجوار الوريد البوابي ، ويوفر وريد البوابة قالبا هيكليا ومركز إشارات ينظم نمو وتمايز الشجرة الصفراوية12. في هانكوفا وآخرون.9، استكشف DUCT التجديد الصفراوي في نموذج فأر لمرض الأطفال البشري متلازمة ألاجيل. كشفت DUCT عن آليات معمارية لم يتم الإبلاغ عنها من قبل أن النظام الصفراوي يستخدم لتحقيق حجم يشبه النوع البري9. استخدمت فئران متلازمة ألاجيل استراتيجيتين مختلفتين: (1) في المناطق الهلالية والوسطى من الكبد ، زاد النظام الصفراوي من تفريعه ، و (2) في محيط الكبد ، كانت القنوات الصفراوية التي تم إنشاؤها بواسطة دي نوفو ملتوية للغاية. هذان العاملان معا لتسفر عن حجم نظام الصفراوية شبه العادية، على الرغم من الهندسة المعمارية غير طبيعية. وعلاوة على ذلك، اكتشفت DUCT تفريع القناة الصفراوية غير الطبيعية التي حدثت بشكل مستقل عن تفريع الوريد البوابي والقنوات الصفراوية التي تشكل الجسور بين اثنين من الأوردة البوابة9. هذه الأنماط الظاهرية سيكون من المستحيل الكشف عنها في الصب الراتنج واحد ويمكن أن يساء تفسيرها في أقسام الهسولوجية 2D وانتشار القناة الصفراوية. وبالتالي توفر DUCT بيانات تصف البنية ثلاثية الأبعاد لشبكتين أنبوبيتين على مستوى الجهاز أو الفص بأكمله مع إمكانية التحليل الكمي النوعي والمتعمق. يمكن أن تكون DUCT معيارا جديدا لتطوير الكبد بعد الولادة وتحليلات تجديد الكبد في نماذج حيوانية مختلفة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر كاري هوبرت وستايسي هوبرت على خبرتهما ومساعدتهما فيما يتعلق بتكهن القناة الصفراوية وضيافتهما المختبرية. نشكر أيضا ناديا شولتز وشارلوت ل. ماتسون لمساعدتهما في قنية الصفراوية المشتركة.
نشكر وكالات المنح التالية على دعمها:
للعمل في مختبر ERA: معهد كارولينسكا (2-560/2015-280)، ستوكهولم لانس لاندستينغ (CIMED (2-538/2014-29))، راجنر سو 6- مؤسسة stiftelse (منحة البداية للمؤسسات السويدية)، والرابطة الأوروبية لدراسة الكبد (جائزة دانيال ألاغيل)، والمؤسسة السويدية للقلب والرئة (20170723)، وفيتينسكابسراديت (2019-01350).
للعمل في مختبر JK: نحن نعترف CzechNanoLab البنية التحتية للبحوث بدعم من MEYS CR (LM2018110). ج. ك. بفضل دعم منحة FSI-S-20-6353.
Materials
| 1.5 mL SafeSeal micro tubes | Sarstedt | 72.706 | |
| 23 G butterfly needle with tubing | BD bioscience | 367283 | |
| 25 G needle | BD bioscience | 305122 | |
| 30 G needle | BD bioscience | 305106 | |
| Agarose | Top-Bio | P045 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 108006 | |
| Benzyl benzoate | Sigma Aldrich | B6630 | |
| Corning 50 mL tubes | Sigma Aldrich | CLS430829-500EA | polypropylene |
| Cotton swabs | Medicarier | 60406 | |
| Dissection Microscope | Leica Camera AG | Leica M60 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.41 | |
| Falcon tube 15 mL | Verkon | 331.850.084.006 | |
| Forceps curved | Fine Science Tools | 11051-10 | Fine Graefe 10 cm curved |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 11050-10 | Fine Graefe 10 cm straight |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| GE Phoenix v|tome|x L 240 | Waygate Technologoies | micro computed tomography scanner | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
| Heparin | Leo Pharma | B01AB01 | 5000 IE/mL |
| Isolfurane | Baxter | FDG9623 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 11413413 | |
| MICROFIL | Flowtech | MV-122 | synthetic resin yellow |
| MICROFIL | Flowtech | MV-120 | synthetic resin blue |
| MICROFIL | Flowtech | MV-diluent | clear resin diluent |
| Pasteur pipette | Verkon | 130.690.424.503 | |
| Peristaltic pump | AgnThos | 010.6131.M20 | |
| phoenix datos|x 2.0 software | Baker Hughes | CT data reconstruction software | |
| Rocker | VWR | 444-0142 | |
| Silk suture | AgnThos | 14757 | Black silk, 4-0, sterile, 100 m |
| Skin scissor | Fine Science Tools | 14058-09 | Iris straight tip 9 cm |
| Spring scissor | Fine Science Tools | 15000-03 | Vannas micro, straight tip 2 mm |
| Syringe 1 mL Luer | BD bioscience | 303172 | |
| Tubing PE10 | BD bioscience | 427401 | |
| Tubing PE50 | BD bioscience | 427411 | |
| VG Studio MAX 3.3 software | Volume Graphics GmbH | CT data processing and analysis software |
References
- Narat, J. K., Loef, J. A., Narat, M. On the preparation of multicolored corrosion specimens. The Anatomical Record. 64, 155-160 (1936).
- Ludwig, J., et al. Anatomy of the human biliary system studied by quantitative computer-aided three-dimensional imaging techniques. Hepatology. 27, 893-899 (1998).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Quantitative assessment of the rat intrahepatic biliary system by three-dimensional reconstruction. American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Hepatic artery and portal vein remodeling in rat liver: Vascular response to selective cholangiocyte proliferation. American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).
- Sparks, E. E., et al. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).
- Cuervo, H., et al. Endothelial notch signaling is essential to prevent hepatic vascular malformations in mice. Hepatology. 64, 1302-1316 (2016).
- Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63, 550-565 (2016).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-Dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4272 (2012).
- Hankeova, S., et al. DUCT reveals architectural mechanisms contributing to bile duct recovery in a mouse model for Alagille syndrome. Elife. 1, 1-29 (2021).
- Andersson, E. R., et al. Mouse model of Alagille syndrome and mechanisms of Jagged1 missense mutations. Gastroenterology. 154, 1080-1095 (2018).
- Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64, 175-188 (2016).
- Ober, E. A., Lemaigre, F. P. Development of the liver: Insights into organ and tissue morphogenesis. Journal of Hepatology. 68, 1049-1062 (2018).
