DUCT: Double Resin Casting gevolgd door Micro-Computed Tomography voor 3D Leveranalyse

Het protocol dat in deze studie wordt beschreven, is goedgekeurd en volgt de dierenwelzijnsregels en -voorschriften van de Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd (Stockholm animal research ethics board). De dieren die in deze studie werden gebruikt, waren wilde of homozygote Jag1H268Q-mutante muizen met een gemengde C3H / N- en C57bl6J-achtergrond. Zowel mannen als vrouwen werden opgenomen in de studie. De dieren werden gebruikt op postnatale dag 15 of als volwassenen tussen 3 – 8 maanden. 1. Dubbele harsinjecties VoorbereidingBereid harsoplossing voor. Bereid voor harsinjecties met een dubbel systeem zowel gele als groene harsen zoals beschreven in de stappen 1.1.2-1.1.4. Bereid 1 ml aliquots verdunde hars per muis. Gele hars: Verdun geel siliconenrubber (hoge radiopaciteit) met het heldere verdunningsmiddel in een 3:1 verdunning om gele hars voor injectie te bereiden. Groene hars: Meng blauw siliconenrubber (niet-detecteerbare radiopaciteit) met het heldere verdunningsmiddel in een verdunning van 1:1 om blauwe hars te bereiden. Om groene hars te genereren, mengt u de verdunde blauwe hars met de verdunde gele hars in een verhouding van 1:1. Vortex de groene hars grondig tot de kleur homogeen is.OPMERKING: Blauwe hars heeft een zeer lage radiopaciteit die niet detecteerbaar is met microCT, waardoor verdunning met gele hars nodig is om twee harsen met verschillende radiopaciteiten te creëren.LET OP: Hars kan loodchromaat bevatten, wat kankerverwekkend is. Het produceert giftige gassen in een brand. Behandel de hars met zorg en gooi deze weg als gevaarlijk afval. Bereid twee injectiesets (injectieset #1 en injectieset #2) voor met slangen zoals beschreven in de stappen 1.1.6-1.1.11.OPMERKING: Gebruik voor volwassen muizen (>P30 (postnatale dag 30) = P30 – 2 jaar) injectieset #1 (PE10-slang met een buitendiameter van 0,6 mm) voor gemeenschappelijke galweginjectie en injectieset #2 (PE50-slang met een buitendiameter van 0,96 mm) voor poortaderinjectie. Bereid voor jonge postnatale muizen (tot P30) twee #1 injectiesets voor, één voor galweg en één voor poortaderinjectie (geen injectieset #2 omdat de poortader te smal is om PE50-slangen te herbergen). Om injectieset #1 voor te bereiden, snijdt u 30 cm PE10-buis en strekt u het ene uiteinde van de buis met de hand uit door eraan te trekken totdat deze zo dun mogelijk wordt (figuur 1A, B, ongeveer 0,15 mm diameter, niet-uitgerekte PE10-buis heeft een diameter van 0,6 mm). Snijd de punt van de uitgerekte PE10-buis diagonaal af om een afgeschuinde punt te creëren (figuur 1B). Sluit het niet-uitgerekte uiteinde van de PE10-slang aan op een naald van 30 G (figuur 1A, injectieset #1). Om injectieset #2 voor te bereiden, snijdt u 30 cm PE50-buis en strekt u het ene uiteinde van de buis met de hand uit door eraan te trekken totdat deze dun genoeg wordt om in de poortader te passen (figuur 1A, B, ongeveer 0,7 mm, niet-uitgerekte PE50-buis heeft een diameter van 0,96 mm). Snijd de punt van de uitgerekte PE50-buis diagonaal om een afgeschuinde punt te creëren (figuur 1B). Sluit het niet-uitgerekte uiteinde van de PE50-buis aan op een naald van 23 G (figuur 1A, injectieset #2).OPMERKING: Elke injectieset kan slechts voor één injectie worden gebruikt, omdat de hars in de spuit en slang zal uitharden. Pas de grootte van de uitgerekte en afgeschuinde punt aan op basis van de grootte van het gemeenschappelijke galkanaal en de poortader van de muis, afhankelijk van de leeftijd, het genotype en het fenotype. Wanneer u niet zeker bent van de grootte en pasvorm van de slang, plaatst u de slang in het juiste kanaal of vat na de incisie en voordat de slang wordt gevuld met hars. Als de slang te breed is om in het kanaal/vat te passen, rek deze dan verder uit. Verdoof het dier door isofluraaninhalatie (eerst 4% in de inductiekamer en ~ 2% met behulp van de neuskegel). Plaats de muis op een geventileerde bank op een dissectiepad terwijl de muis isofluraan door de neuskegel ademt. Controleer of het dier bewusteloos is door een door het instituut/IRB aanbevolen methode, bijvoorbeeld door in een van de poten te knijpen.LET OP: Isofluraan kan slaperigheid of duizeligheid veroorzaken bij inademing en kan schade aan het cardiovasculaire systeem en het centrale zenuwstelsel veroorzaken door langdurige of herhaalde blootstelling. Inhaleer het niet. Behandel de stof op een geventileerde bank en in goed geventileerde ruimtes.OPMERKING: Het is mogelijk om een andere verdovingsmethode te gebruiken, zolang deze compatibel is met hartperfusie. Zodra het dier bewusteloos is, spuit u de ventrale kant met 70% ethanol om interferentie van de vacht te voorkomen. Knip met behulp van een huidschaar de huid, fascia en spierlaag vanaf de middellijn van de buikholte en snijd door naar de thoracale holte om de inwendige organen bloot te leggen. Pak het xiphoid-proces met een tang om het borstbeen op te tillen en snijd het diafragma en de ribbenkast aan beide zijden om het hart en de longen bloot te leggen. Verwijder de ribbenkast door met een schaar door de ribben aan de linker- en rechterkant van de ribbenkast te snijden. Wees extra voorzichtig om de lever niet te beschadigen, omdat dit zal resulteren in lekkage van de hars. Trek met een rechte tang het hart naar de lever en snijd het rechteratrium weg. Steek een vlindernaald (23 G), verbonden met een peristaltische perfusiepomp, in de linker ventrikel. Perfuseer de muis transcardiaal met Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) en heparine (1 U/g lichaamsgewicht van de muis). Perfundeer gedurende 3 minuten met een perfusiesnelheid van 5 ml/min.OPMERKING: Als de muis correct wordt doordrenkt, zullen de inwendige organen bleek worden, vooral de lever. Als in plaats daarvan de longen wit worden, wordt de naald in de rechter ventrikel ingebracht en moet deze worden verplaatst. Na perfusie wordt de muis geëxsanguineerd en kan deze uit de neuskegel en isofluraan worden verwijderd. Schakel de isofluraanpomp uit. Harsinjectie – Galsysteem harsgietenBeweeg de muis naar de dissectiemicroscoop, buik omhoog, staart naar de experimentator en hoofd weg van de experimentator. De anatomische bezienswaardigheden zijn afgebeeld in figuur 2A. Lokaliseer de inferieure vena cava (figuur 2A) door de darm naar de zijkant te verplaatsen. Gebruik een voorjaarsschaar om een kleine transversale incisie te maken in de inferieure vena cava om de afgifte van de levervasculaire druk mogelijk te maken (figuur 2Bi). Stel de gemeenschappelijke galwegen en poortader bloot zoals beschreven in stappen 1.2.4- 1.2.6. Verplaats de darm en alvleesklier naar de rechterkant (van de experimentator) met behulp van een fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) -bevochtigd wattenstaafje. Draai de ventrale kant van de lever naar het hart met behulp van het pbs-bevochtigde wattenstaafje om het viscerale oppervlak en het hilarische gebied bloot te leggen. Lokaliseer het gemeenschappelijke galkanaal dat loopt van het hilarische gebied over de pancreas en in de darm bij de sluitspier van Oddi (Figuur 2Bii, gemeenschappelijk galkanaal omlijnd met de gele stippellijn, zwarte pijlpunten wijzen naar sluitspier van Oddi).OPMERKING: Zorg ervoor dat de lever vochtig is tijdens de procedure door het te besprenkelen met PBS. Maak omringend weefsel (gebied ~ 5 mm) vrij van het gemeenschappelijke galkanaal met behulp van een rechte tang. Plaats zijden hechtdraad (maat 4-0, 0,17 mm, 3 – 5 cm lang) onder het gemeenschappelijke galkanaal (figuur 2Bii) en bind een losse bovenhandse knoop rond de gemeenschappelijke galgang (figuur 2Biii).OPMERKING: Kies een gebied voor de knoop halverwege tussen het hilarische gebied en de sluitspier van Oddi en op enige afstand van de poortader, zodat nadat de hechting rond de gemeenschappelijke galweg is aangespannen, deze de poortaderinjectie niet zal verstoren. Houd de veerschaar plat tegen het gemeenschappelijke galkanaal om een schuine incisie te maken naar het gemeenschappelijke galkanaal op de plek waar het gemeenschappelijke galkanaal de pancreas en darm binnenkomt naast de sluitspier van Oddi. (Figuur 2Biv), gele stippellijn omlijnt de sluitspier van Oddi-gebied, benadrukt door zwarte pijlpunten).OPMERKING: Dit is een cruciale stap. Maak een schuine en geen transversale snede en maak een incisie; breek de galwegen niet af. Het doorsnijden van het gehele galkanaal maakt het inbrengen van de slang zeer uitdagend. Meng vlak voor gebruik 1 ml van de gele hars met 50 μL van het uithardingsmiddel (door de spuit van 1 ml te vullen en te legen) en vul een luerspuit van 1 ml met het mengsel hars – uithardingsmiddel. Sluit de gevulde spuit aan op de slang (set #1). Druk op de zuiger om de slang volledig te vullen. Zorg ervoor dat het mengsel van hars/uithardingsmiddel uit de punt van de slang druipt.OPMERKING: Vermijd en verwijder bubbels in de spuit en slang voor het beste resultaat. Maak met een tang het gebied rond de gemeenschappelijke galwegincisie recht en steek de slang in de opening in het gemeenschappelijke galkanaal (figuur 2Bv), met de langste rand van de afgeschuinde punt naar beneden naar de dorsale kant van het galkanaal. Deze oriëntatie zorgt ervoor dat hars de naar boven gerichte opening van de buis in het kanaal kan verlaten (figuur 2Bv). Draai de zijden draadknoop aan om de slang in het gemeenschappelijke galkanaal vast te zetten (figuur 2Bvi). Injecteer de hars in het gemeenschappelijke galkanaal. Observeer de galblaas en de individuele leverkwabben. Masseer de lever met een pbs-bevochtigd wattenstaafje om de hars gelijkmatig te verspreiden. De terminale takken van met hars gevulde galwegen (bij wildtype muizen) zijn vaag zichtbaar aan het leveroppervlak.OPMERKING: De verwachte tijd om de lever te vullen is 30 -100 s. Stop met het injecteren van de hars wanneer er stippen hars verschijnen aan het oppervlak van de lever (figuur 2Ci, blauwe pijlpunten) of wanneer weerstand wordt bereikt.OPMERKING: Werk zo snel mogelijk omdat de hars begint uit te harden na het toevoegen van het harsuithardingsmiddel. De werktijd na het toevoegen van het uithardingsmiddel is ongeveer 15 min. Verwijder de slang door deze uit het gemeenschappelijke galkanaal te trekken en draai de zijden knoop snel aan met een tang om te voorkomen dat de hars eruit lekt. Snijd de losse uiteinden van de zijde hechtdraad weg, zodat ze de poortaderinjectie niet verstoren. Gooi de buis met hars en de resterende hars weg in het gevaarlijke afval en de naald in het naaldafval. Harsinjectie – Portal aderharsgieten Verwijder de poortader (gebied ~ 5 mm) van het omliggende weefsel ongeveer 2 cm van de binnenkomst in de lever met behulp van een rechte tang. Plaats zijden hechtdraad (maat 4-0, 0,17 mm, 3 – 5 cm lang) onder het vrijgemaakte gebied van de poortader (figuur 2Ci) en bind een losse bovenhandse knoop (figuur 2Cii). Maak een longitudinale incisie in de poortader distal naar de lever en de knoop (figuur 2Ciii). Meng 1 ml van de groene hars met 50 μL van het uithardingsmiddel (door het vullen en legen van een spuit van 1 ml) en vul de luerspuit van 1 ml met het mengsel van het harsuithardingsmiddel. Sluit de gevulde spuit aan op de slang (set #2 voor >P30 muizen, nieuwe set #1 voor <P30 muizen). Druk op de zuiger om de slang volledig te vullen. Zorg ervoor dat de hars uit de punt van de slang druipt.OPMERKING: Vermijd en verwijder bubbels in de spuit en slang voor het beste resultaat. Maak met een tang de poortader recht door het omliggende weefsel naar de experimentator te trekken en breng de slang met de langste rand van de afgeschuinde punt naar de dorsale kant van het vat (figuur 2Ciii). Span de zijden draad aan om de slang in de poortader vast te zetten. Injecteer de hars in de poortader. Observeer hoe de bloedvaten zich vullen met hars. Masseer de lever met een pbs-bevochtigd wattenstaafje om de hars gelijkmatig te verspreiden (figuur 2Civ). Stop met het injecteren van de hars wanneer alle bloedvaten gevuld zijn (uiteinden van poortaders zijn zichtbaar aan de leverrand) of wanneer weerstand wordt bereikt.OPMERKING: Werk snel omdat de hars begint uit te harden na toevoeging van het uithardingsmiddel. De werktijd na het toevoegen van het uithardingsmiddel is ongeveer 15 minuten voor injectieset #1 en 25 min voor injectieset #2. Verwijder de slang door de slang uit de poortader te trekken en draai de zijdeknoop snel aan met een tang om te voorkomen dat de hars eruit lekt. Gooi de buis met hars en de resterende hars weg in het gevaarlijke afval en de naald in het naaldafval. Leverdissectie en fixatieOntleed de hele lever door deze weg te snijden van het omliggende weefsel en het middenrif. Plaats de hele lever voorzichtig in een lege conische buis van 50 ml met de ventrale kant naar boven gericht en de dorsale kant rustend op de wand van de conische buis om vervorming van de lever te voorkomen. Bewaar de conische buis een nacht horizontaal bij 4 °C zodat de hars volledig is uitgehard.OPMERKING: Elke container die groot genoeg is om in de lever te passen, kan worden gebruikt in plaats van 50 ml conische buis. Het gebruik van een container met platte bodem verhoogt de kans dat de lever niet wordt vervormd. Scheid de lever in individuele lobben. Maak een selectie van de lobben die zullen worden gebruikt voor microCT-analyse (1.4.4-1.4.5) of kwaliteitscontrole (1.4.6-1.4.8). Gebruik optioneel de hele lever voor zowel optische clearing als microCT zonder deze in individuele lobben te scheiden.OPMERKING: De leverarchitectuur van de galwegen en het vasculaire systeem is in elke kwab anders en daarom zijn gematchte kwabanalyses vereist. De optische clearing interfereert niet met microCT-scanning en de kwab (en) die voor kwaliteitscontrole worden gebruikt, kunnen vervolgens worden gescand met microCT. Omgekeerd kunnen monsters die met microCT zijn gescand, vervolgens optisch worden gewist voor vergelijking. De hele leveranalyse is dus mogelijk. Bij wild-type muizen (C3H/C57bl6 genetische achtergrond) wordt de rechter mediale kwab eerst gevuld door harsinjecties, waardoor dit een geschikte kwab is voor microCT-analyse, met de hoogste reproduceerbaarheid. De linker laterale kwab is de grootste kwab, waarbij het dus eenvoudig is om vooraf te screenen op injectiekwaliteit. De selectie van de kwab (of hele lever) die wordt gebruikt voor kwaliteitscontrole en microCT-scanning is afhankelijk van het diermodel en de onderzoeksvraag. Bereid in een geventileerde kap 4% formaldehyde-oplossing (10 -20 ml per buis). Bevestig de voor microCT gebruikte lobben een nacht met 4% formaldehyde bij 4 °C en was daarna eenmaal met PBS (10 -20 ml per buis). Verzamel formaldehydeafval in een aparte container. Houd de leverlobben in PBS op 4 °C voor korte opslag of 70% ethanol voor langdurige opslag. Ga verder met sectie 2: Micro-computertomografie.LET OP: Formaldehyde veroorzaakt acute toxiciteit bij inslikken, inademen of contact met de huid. Formaldehyde is een brandbare vloeistof en damp. Het veroorzaakt ernstige brandwonden op de huid en oogbeschadiging. Kan een allergische huidreactie veroorzaken. Fataal bij inademing (geconcentreerd of in poedervorm). Kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken. Verdacht van het veroorzaken van genetische defecten. Kan kanker veroorzaken. Veroorzaakt schade aan organen (ogen, centraal zenuwstelsel). Voorzorgsmaatregelen – uit de buurt houden van hitte, hete oppervlakken, vonken, open vuur en andere ontstekingsbronnen. Niet roken. Draag beschermende handschoenen en beschermende kleding. In geval van morsen, doe onmiddellijk alle kleding uit die besmet was. Bij contact met de huid: spoel het besmette gebied af met water. Bij inademing: verwijder de persoon naar frisse lucht en controleer de ademhaling indien comfortabel. Bel onmiddellijk een antigifcentrum / arts. Indien in de ogen: spoel de ogen enkele minuten met water. Verwijder indien aanwezig en mogelijk contactlenzen. Voor kwaliteitscontrole fixeert u de resterende lobben (ten minste één) met 50% methanol (gemengd met gedeïoniseerd water) gedurende minimaal 4 uur, schommelend bij kamertemperatuur, gevolgd door 100% methanol ‘s nachts schommelen bij kamertemperatuur. Verzamel methanolafval in een aparte container.LET OP: Methanol veroorzaakt acute toxiciteit bij inslikken, inademen of contact met de huid. Methanol is een brandbare vloeistof en damp. Draag beschermende handschoenen en kleding. Vermijd ademhalen bij het hanteren en blijf uit de buurt van vuur en hitte. Was de huid grondig na gebruik. In geval van morsen, doe onmiddellijk alle vervuilde kleding uit. Spoel de huid af met water. Indien ingeademd: Verwijder de persoon naar frisse lucht en blijf comfortabel ademen. Als u wordt ingeademd, ingeslikt of blootgesteld, belt u een gifcentrum / arts. Bereid in een geventileerde kap benzylalcohol en benzylbenzoaat (BA: BB, 1:2) (5 -10 ml per lob) oplossing. Plaats de leverkwab in een polypropyleenbuis van 15 of 50 ml (afhankelijk van de grootte van de kwab) met BABB-oplossing. Laat het op kamertemperatuur schommelen tot het transparant is. Deze stap kan tussen de 2-16 uur duren, afhankelijk van de grootte van de lob.OPMERKING: De BABB-oplossing lost bepaalde soorten plastic op. Het is veilig om de monsters op te slaan in polypropyleen buizen of glazen containers.LET OP: Benzylbenzoaat kan acute toxiciteit veroorzaken bij inslikken. Het is giftig voor het waterleven met langdurige effecten. Voorzorgsmaatregelen: was de huid grondig na het hanteren. Het is schadelijk bij inslikken, in contact met de huid of ingeademd. Vermijd het inademen van dampen/ dampen. Was de handen grondig na het hanteren. Niet eten, drinken of roken bij gebruik van dit product. Indien ingeslikt – bel een gifcentrum / arts als u zich niet goed voelt Gebruik in geventileerde ruimtes. Verzamel morsen. Gooi de inhoud/container naar een erkende afvalverwijderingsinstallatie. Controleer de kwaliteit van de injectie. Alleen goed geïnjecteerde lever moet worden gescand met microCT. 2. Micro-computertomografie Monstervoorbereiding Bereid 1% agarosegel door 100 ml gedestilleerd water en 1 g agarosepoeder te mengen. Plaats het mengsel in een magnetron en kook de oplossing totdat het agarosepoeder is opgelost. Temper de 1% agarose gel tot ~40 °C om thermische schade aan het levermonster te voorkomen. Plaats de betreffende lobben in een conische buis van 15 ml en vul deze met de 1% agarosegel tot ongeveer 2/3 van het totale volume van de buis. Deze stap minimaliseert ongewenste monsterbewegingen tijdens CT-metingen. CT-metingOPMERKING: De volgende stappen zijn afhankelijk van het CT-apparaat en specifieke instellingen en acties kunnen verschillen voor verschillende CT-apparaten en fabrikanten. In dit protocol was de gebruikte microcomputertomografiescanner uitgerust met een nanofocus röntgenbuis (180 kV/15 W) en flat-panel dynamische 41|100 (4048 px x 4048 px, pixelgrootte 100 mm met binning 2) voor de CT-metingen. Monteer de conische buis van 15 ml met het monster op de rotatietrap van een CT-apparaat en laat het zich gedurende ten minste 1 uur thermisch aanpassen aan de meetkamer. Wanneer het monster thermisch is aangepast, centreert u het in het gezichtsveld (FOV). Optimaliseer de afstanden tussen bronmonster en monsterdetector (SSD, SDD) om voldoende voxelresolutie te bereiken, bijvoorbeeld 12 μm voor een volwassen muizenlevermonster of 6,5 μm voor <P30-lever, overeenkomend met afmetingen van FOV (voor vooraf gespecificeerde hardware) 24,3 mm × respectievelijk 24,3 mm en 13,2 mm × 13,2 mm. Stel de acquisitieparameters in (d.w.z. versnellende spanning en stroom, blootstelling, binning, middeling) volgens de aanbevelingen van de fabrikant van het CT-apparaat om een voldoende niveau van gedetecteerd signaal te bereiken. Deze parameters zijn niet alleen CT-apparaatafhankelijk, maar ook monsterafhankelijk en moeten voor elk monster worden geoptimaliseerd. In Hankeova et al.9 waren de instellingen: 80 kV versnellingsspanning, 160 μA versnellende stroom, 400 ms belichtingstijd en 2000 beelden. Start een CT-meting. Gebruik een speciale tomografische reconstructiesoftware om de CT-gegevens te reconstrueren. 3. Analyse en datasegmentatie OPMERKING: De volgende stappen zijn afhankelijk van beeldverwerkingssoftware; specifieke instellingen en acties kunnen verschillen afhankelijk van de gebruikte software. De CT-gegevens laden: Selecteer Bestand > opdracht Importeren >. Een verdere selectie is afhankelijk van het specifieke formaat van de te verwerken CT-gegevens. Gebruik de functie Oppervlaktebepaling op het bovenpaneel om de hars in de gegevens te segmenteren met behulp van globale drempelwaarden. Bepaal in het dialoogvenster de drempelwaarde met histogramevaluatie door de positie van de rode lijn “Isowaarde” in te stellen om alleen de met hars gevulde vaten te segmenteren (d.w.z. de gele lijn in het gepresenteerde deelvenster “Voorbeeld”) (figuur 3A). Selecteer in het linkerdeelvenster de module ROI maken van volume/CAD/mesh om een interessegebied (ROI) van de met hars gevulde vaten te maken. Gebruik in het dialoogvenster de optie ROI(s) maken vanuit Solid, selecteer de naam van het verwerkte volume en bevestig. Elimineer foutieve segmentatie van ruisclusters in het achtergrondgebied van deze ROI. Markeer deze ROI in het rechterdeelvenster, klik er met de rechtermuisknop op en selecteer de module Split ROI. Stel in het dialoogvenster de parameter Minimum Volume [voxel] in om alle ruisdeeltjes uit te sluiten – deze waarde is experiment- en gegevensafhankelijk en moet worden geoptimaliseerd voor elk te analyseren monster (figuur 3B). Creëer gladde, continue en solide kanaalmaskers zonder artefacten in de roi van het harsgieten – bijvoorbeeld aanwezigheid van luchtbellen of harslekkage. Gebruik in het linkerdeelvenster de module Afvlakken, stel de parameter Afvlaksterkte in op 1 of 2 (afhankelijk van de individuele gegevens, wanneer hogere waarden kunnen leiden tot modelvervorming, vooral bij het omgaan met fijne structuren). Voer dit proces indien nodig twee keer uit (afbeelding 3C). Identificeer en scheid de afzonderlijke buisvormige systemen in het gesegmenteerde harsmasker. Creëer een afzonderlijke ROI voor het systeem gevuld met de meer absorberende hars (de gele hars die wordt gebruikt voor de gemeenschappelijke galweginjectie) met hogere intensiteitswaarden in de CT-gegevens. Volg de procedure die wordt beschreven in stap 3.2. (Figuur 3Di). Markeer de nieuwe ROI en de ROI van het harsmasker, klik met de rechtermuisknop en selecteer ROI(S) aftrekken en trek de nieuwe ROI af van de ROI van het harsmasker om een nieuwe ROI te creëren voor het resterende buisvormige systeem (Figuur 3Dii, iii). Exporteer de resulterende ROI’s voor beide buissystemen in verschillende formaten, op basis van de voorkeuren van de operator, voor verdere verwerking in verschillende software. Verwerk verder de resulterende ROI’s in een volumegrafische software om de uiteindelijke visualisatie in de vorm van een afbeelding of een video te exporteren.