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Medicine

DUCT: Doppelharzguss mit anschließender Mikro-Computertomographie zur 3D-Leberanalyse

Published: September 28, 2021
doi:
10.3791/62941
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1Karolinska Institutet, 2Central European Institute of Technology

Summary

Die Doppelharzguss-Mikrocomputertomographie (DUCT) ermöglicht die Visualisierung, Digitalisierung und Segmentierung von zwei röhrenförmigen Systemen gleichzeitig, um die 3D-Analyse der Organarchitektur zu erleichtern. DUCT kombiniert die Ex-vivo-Injektion von zwei röntgenopaken Harzen, gefolgt von Mikro-Computertomographie-Scanning und Segmentierung der tomographischen Daten.

Abstract

Die Leber ist das größte innere Organ bei Menschen und Mäusen, und eine hohe Autofluoreszenz stellt eine große Herausforderung für die Beurteilung der dreidimensionalen (3D) Architektur des Organs auf der Ebene des gesamten Organs dar. Die Leberarchitektur zeichnet sich durch mehrere verzweigte lumenisierte Strukturen aus, die mit Harz gefüllt werden können, einschließlich Gefäß- und Gallenbäumen, wodurch ein stark stereotypes Muster im ansonsten hepatozytenreichen Parenchym entsteht. Dieses Protokoll beschreibt die Pipeline für die Durchführung der Doppelharzguss-Mikrocomputertomographie oder “DUCT”. DUCT beinhaltet die Injektion der Pfortader und des gemeinsamen Gallengangs mit zwei verschiedenen röntgenopaken Kunstharzen, gefolgt von einer Gewebefixierung. Die Qualitätskontrolle durch Die Reinigung eines Lappens oder der gesamten Leber mit einem optischen Clearing-Mittel ermöglicht ein Vorab-Screening von entsprechend injizierten Proben. Im zweiten Teil der DUCT-Pipeline kann ein Lappen oder die gesamte Leber für Mikro-Computertomographie (microCT) -Scans, (halb-)automatisierte Segmentierung und 3D-Rendering der portalvenösen und biliären Netzwerke verwendet werden. MicroCT führt zu 3D-Koordinatendaten für die beiden Harze, die sowohl eine qualitative als auch eine quantitative Analyse der beiden Systeme und ihrer räumlichen Beziehung ermöglichen. DUCT kann auf postnatale und erwachsene Mausleber angewendet werden und kann weiter auf andere tubuläre Netzwerke ausgedehnt werden, beispielsweise auf vaskuläre Netzwerke und Atemwege in der Lunge.

Introduction

Organharzguss ist eine Technik, die bis ins 17. Jahrhundert zurückreicht1. Eines der ersten Beispiele für modernen Harzguss wurde an der menschlichen Leber aus einer Autopsie durchgeführt. Intrahepatische Gallengänge wurden mit einem mit Gelatine gemischten Kontrastmittel gefüllt, gefolgt von einer Bildgebung mit einem Röntgen-CT-Scan2. Ziel der DUCT-Technik ist es, zwei röhrenförmige harzgegossene Netzwerke im Tandem in 3D zu visualisieren, zu digitalisieren und zu analysieren.

DUCT basiert auf dem umfangreichen vorhandenen Wissen über den Einzelsystem-Leberharzguss3,4,5,6,7,8 und erstreckt sich auf die gleichzeitige 3D-Visualisierung und -Analyse zweier Systeme9. DUCT erweiterte den Einzelharzguss zum Doppelharzguss, indem zwei röntgenopake Harze unterschiedlichen Kontrasts gemischt und diese Harze in zwei verschiedene Netzwerke injiziert wurden, insbesondere in den gemeinsamen Gallengang und die Pfortader. DUCT kann bereits am postnatalen Tag 15 bei jungen postnatalen Mäusen mit reproduzierbaren Ergebnissen angewendet werden (P15). Im Vergleich zu mikroskopiebasierten Bildgebungsverfahren besteht der Hauptvorteil darin, dass DUCT schneller und antikörperfrei ist und die Autofluoreszenz des Lebergewebes die Bildgebung nicht beeinträchtigt. Darüber hinaus liefert DUCT quantitative Daten, die den Lumenisierungsstatus, den Innendurchmesser, die Netzwerkkonnektivität und die Perfusion beschreiben. Die Unterscheidung zwischen dem Vorhandensein lumenbildender Zellen und ihrer de facto Morphogenese zu Röhren ist für die Analyse von Organen, in denen duktuläre Zellen vorhanden sind, aber keine Röhren bilden, wie dies beim Alagille-Syndrom der Fall sein kann10, unerlässlich. Der Hauptnachteil von DUCT ist die begrenzte Durchdringung des Harzes, das viskos ist und nicht in Rohre mit einem kleinen Kaliber (<5 μm) eindringt. DUCT kann für jede tubuläre Struktur nach Bestimmung des Injektionseintrittspunkts angewendet werden, wie z. B. das arterielle und venöse Kreislaufsystem, die Atemwege, den extrahepatischen Gallengang oder die Lymphgefäße. Es könnte somit die Analyse der gesamten Organarchitektur anderer Gewebe wie Lunge und Bauchspeicheldrüse erleichtern.

MicroCT-segmentierte Bilder können mit handelsüblicher Bildgebungssoftware wie ImageJ oder benutzerdefinierten Pipelines (z. B. MATLAB) verarbeitet werden. Die harzingespritzte Leber kann qualitativ auf Netzwerkausdehnung und Konnektivität oder quantitativ auf Volumen, Länge, Verzweigung, Tortuosität eines einzelnen Systems und die Wechselwirkung zwischen zwei Systemen wie dem Abstand zwischen zwei Systemen oder der Zweigpunktabhängigkeit analysiert werden (verzweigt sich System 1 in der Nähe von System 2?). Die DUCT-Pipeline, die Harzinjektion, microCT-Scanning und CT-Datensegmentierung umfasst, kombiniert mit einer detaillierten quantitativen Analyse der architektonischen Mechanismen zweier röhrenförmiger Systeme, könnte einen Standard für die Analyse der gesamten Leber in Tiermodellen darstellen.

Protocol

Das in dieser Studie beschriebene Protokoll wurde genehmigt und folgt den Tierschutzregeln und -vorschriften des Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd (Stockholmer Ethikrat für Tierversuche). Die in dieser Studie verwendeten Tiere waren wildtypische oder homozygote Jag1H268Q-mutante Mäuse mit einem gemischten C3H/N- und C57bl6J-Hintergrund. Sowohl Männer als auch Frauen wurden in die Studie eingeschlossen. Die Tiere wurden am postnatalen Tag 15 oder als Erwachsene zwischen 3 – 8 Monaten verwendet. 1. Doppelte Harzinjektionen PräparatHarzlösung vorbereiten. Für Doppelsystemharzinjektionen bereiten Sie sowohl gelbe als auch grüne Harze vor, wie in den Schritten 1.1.2-1.1.4 beschrieben. Bereiten Sie 1 ml Aliquots verdünntes Harz pro Maus vor. Gelbes Harz: Verdünnen Sie gelben Silikonkautschuk (hohe Radiopaziität) mit dem klaren Verdünnungsmittel in einer 3: 1-Verdünnung, um gelbes Harz für die Injektion vorzubereiten. Grünes Harz: Mischen Sie blauen Silikonkautschuk (nicht nachweisbare Radiopacität) mit dem klaren Verdünnungsmittel in einer 1: 1-Verdünnung, um blaues Harz herzustellen. Um grünes Harz zu erzeugen, mischen Sie das verdünnte blaue Harz mit dem verdünnten gelben Harz im Verhältnis 1: 1. Wirbeln Sie das grüne Harz gründlich, bis die Farbe homogen ist.HINWEIS: Blaues Harz hat eine sehr geringe Radiopazition, die mit microCT nicht nachweisbar ist, was daher eine Verdünnung mit gelbem Harz erfordert, um zwei Harze mit unterschiedlichen Radioppacitäten zu erzeugen.VORSICHT: Harz kann Bleichromat enthalten, das ein Karzinogen ist. Es produziert giftige Gase in einem Feuer. Vorsichtig behandeln und das Harz als Sondermüll entsorgen. Bereiten Sie zwei Injektionssätze (Injektionssatz Nr. 1 und Injektionssatz Nr. 2) mit Schläuchen vor, wie in den Schritten 1.1.6-1.1.11 beschrieben.HINWEIS: Für erwachsene Mäuse (>P30 (postnataler Tag 30) = P30 – 2 Jahre) verwenden Sie das Injektionsset Nr. 1 (PE10-Schlauch mit 0,6 mm Außendurchmesser) für die gemeinsame Gallengangsinjektion und das Injektionsset Nr. 2 (PE50-Schlauch mit 0,96 mm Außendurchmesser) für die Pfortaderinjektion. Bereiten Sie für junge postnatale Mäuse (bis P30) zwei Injektionssets Nr. 1 vor, eines für den Gallengang und eines für die Injektion der Pfortader (kein Injektionsset Nr. 2, da die Pfortader zu schmal ist, um PE50-Schläuche aufzunehmen). Um das Injektionsset Nr. 1 vorzubereiten, schneiden Sie 30 cm PE10-Schlauch ab und dehnen Sie ein Ende des Schlauches von Hand, indem Sie ihn ziehen, bis er so dünn wie möglich wird (Abbildung 1A,B, ca. 0,15 mm Durchmesser, ungespannter PE10-Schlauch hat 0,6 mm Durchmesser). Schneiden Sie die Spitze des gestreckten PE10-Schlauchs diagonal ab, um eine abgeschrägte Spitze zu erzeugen (Abbildung 1B). Schließen Sie das nicht gedehnte Ende des PE10-Schlauchs an eine 30-G-Nadel an (Abbildung 1A, Injektionsset Nr. 1). Um das Injektionsset Nr. 2 vorzubereiten, schneiden Sie 30 cm PE50-Schlauch aus und dehnen Sie ein Ende des Schlauches von Hand, indem Sie es ziehen, bis es dünn genug wird, um in die Pfortader zu passen (Abbildung 1A, B, ca. 0,7 mm, ungestreckter PE50-Schlauch hat einen Durchmesser von 0,96 mm). Schneiden Sie die Spitze des gestreckten PE50-Schlauchs diagonal ab, um eine abgeschrägte Spitze zu erzeugen (Abbildung 1B). Verbinden Sie das nicht gedehnte Ende des PE50-Schlauchs mit einer 23 G-Nadel (Abbildung 1A, Injektionsset Nr. 2).HINWEIS: Jedes Injektionsset kann nur für eine Injektion verwendet werden, da das Harz in der Spritze und im Schlauch aushärtet. Passen Sie die Größe der gestreckten und abgeschrägten Spitze basierend auf der Größe des gemeinsamen Gallengangs und der Pfortader der Maus an, abhängig von Alter, Genotyp und Phänotyp. Wenn Sie sich über die Größe und Passform des Schlauches nicht sicher sind, führen Sie den Schlauch nach dem Schnitt und bevor der Schlauch mit Harz gefüllt wird, in den entsprechenden Kanal oder behälter ein. Wenn der Schlauch zu breit ist, um in den Kanal / das Gefäß zu passen, dehnen Sie ihn weiter. Betäuben Sie das Tier durch Isofluran-Inhalation (zuerst 4% in der Induktionskammer und ~ 2% mit dem Nasenzapfen). Legen Sie die Maus auf eine belüftete Bank auf einem Sezierpad, während die Maus Isofluran durch den Nasenkegel atmet. Überprüfen Sie, ob das Tier bewusstlos ist, indem Sie eine vom Institut/IRB empfohlene Methode anwenden, z. B. indem Sie eine der Pfoten kneifen.VORSICHT: Isofluran kann beim Einatmen Schläfrigkeit oder Schwindel verursachen und durch längere oder wiederholte Exposition das Herz-Kreislauf-System und das zentrale Nervensystem schädigen. Atmen Sie es nicht ein. Behandeln Sie die Substanz auf einer belüfteten Bank und in gut belüfteten Bereichen.HINWEIS: Es ist möglich, eine andere Anästhesiemethode zu verwenden, solange sie mit der Herzperfusion kompatibel ist. Sobald das Tier bewusstlos ist, besprühen Sie die ventrale Seite mit 70% Ethanol, um Störungen durch das Fell zu verhindern. Schneiden Sie mit einer Hautschere die Haut, faszien- und Muskelschicht beginnend an der Mittellinie der Bauchhöhle und schneiden Sie bis zur Brusthöhle durch, um die inneren Organe freizulegen. Greifen Sie den Xiphoid-Prozess mit einer Pinzette, um das Brustbein anzuheben, und schneiden Sie das Zwerchfell und den Brustkorb auf beiden Seiten ab, um Herz und Lunge freizulegen. Entfernen Sie den Brustkorb, indem Sie die Rippen auf der linken und rechten Seite des Brustkorbs mit einer Schere durchschneiden. Achten Sie besonders darauf, die Leber nicht zu schädigen, da dies zum Austreten des Harzes führt. Ziehen Sie das Herz mit einer geraden Pinzette in Richtung Leber und schneiden Sie den rechten Vorhof weg. Führen Sie eine Schmetterlingsnadel (23 G), die mit einer peristaltischen Perfusionspumpe verbunden ist, in den linken Ventrikel ein. Perfundieren Sie die Maus transkardiell mit Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) und Heparin (1 U/g Körpergewicht der Maus). 3 min mit einer Perfusionsrate von 5 ml/min perfundieren.HINWEIS: Wenn die Maus richtig durchblutet wird, werden die inneren Organe blass, insbesondere die Leber. Wenn stattdessen die Lunge weiß wird, wird die Nadel in den rechten Ventrikel eingeführt und sollte neu positioniert werden. Nach der Perfusion wird die Maus exsanguiniert und kann aus dem Nasenkegel und Isofluran entfernt werden. Schalten Sie die Isofluranpumpe aus. Harzeninjektion – GallensystemharzgussBewegen Sie die Maus zum Seziermikroskop, den Bauch nach oben, den Schwanz in Richtung des Experimentators und den Kopf weg vom Experimentator. Die anatomischen Orientierungspunkte von Interesse sind in Abbildung 2A dargestellt. Lokalisieren Sie die vena cava inferior (Abbildung 2A), indem Sie den Darm zur Seite bewegen. Verwenden Sie eine Federschere, um einen kleinen Transversalschnitt in die untere Hohlvene zu machen, um die Freisetzung des hepatischen Gefäßdrucks zu ermöglichen (Abbildung 2Bi). Exponieren Sie den gemeinsamen Gallengang und die Pfortader wie in den Schritten 1.2.4- 1.2.6 beschrieben. Bewegen Sie den Darm und die Bauchspeicheldrüse mit einem mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung (PBS) benetzten Wattestäbchen auf die rechte Seite (des Experimentators). Drehen Sie die ventrale Seite der Leber mit dem PBS-benetzten Wattestäbchen in Richtung Herz, um die viszerale Oberfläche und die Hilarregion freizulegen. Lokalisieren Sie den gemeinsamen Gallengang, der von der Hilarregion über die Bauchspeicheldrüse und in den Darm am Schließmuskel von Oddi verläuft (Abbildung 2Bii, gemeinsamer Gallengang, der mit der gelb gepunkteten Linie umrandet ist, schwarze Pfeilspitzen zeigen auf den Schließmuskel von Oddi).HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Leber während des gesamten Verfahrens feucht ist, indem Sie sie mit PBS bestreuen. Entfernen Sie das umgebende Gewebe (Fläche ~ 5 mm) mit einer geraden Pinzette vom gemeinsamen Gallengang. Seidennahtfaden (Größe 4-0, 0,17 mm, 3 – 5 cm lang) unter den gemeinsamen Gallengang legen (Abbildung 2Bii) und einen losen Überhandknoten um den gemeinsamen Gallengang binden (Abbildung 2Biii).HINWEIS: Wählen Sie einen Bereich für den Knoten auf halbem Weg zwischen der Hilarregion und dem Schließmuskel von Oddi und in einiger Entfernung von der Pfortader, so dass nach dem Anziehen der Naht um den gemeinsamen Gallengang die Injektion der Pfortader nicht beeinträchtigt wird. Halten Sie die Federschere flach gegen den gemeinsamen Gallengang, um einen schrägen Schnitt in den gemeinsamen Gallengang an der Stelle zu machen, an der der gemeinsame Gallengang neben dem Schließmuskel von Oddi in die Bauchspeicheldrüse und den Darm gelangt. (Abbildung 2Biv), gelb gepunktete Linie umreißt den Schließmuskel der Oddi-Region, hervorgehoben durch schwarze Pfeilspitzen).HINWEIS: Dies ist ein entscheidender Schritt. Machen Sie einen schrägen und keinen transversalen Schnitt und machen Sie einen Schnitt; Den Gallengang nicht durchtrennen. Das Durchschneiden des gesamten Gallengangs macht das Einführen des Schlauches sehr schwierig. Kurz vor Gebrauch 1 mL des gelben Harzes mit 50 μL des Härters mischen (durch Befüllen und Entleeren der 1 mL Spritze) und eine 1 mL Luer Spritze mit der Harz-Härter-Mischung füllen. Verbinden Sie die gefüllte Spritze mit dem Schlauch (Set #1). Drücken Sie den Kolben, um den Schlauch vollständig zu füllen. Stellen Sie sicher, dass das Harz/Härtemittel-Gemisch von der Spitze des Schlauches tropft.HINWEIS: Vermeiden und entfernen Sie Blasen in der Spritze und im Schlauch, um beste Ergebnisse zu erzielen. Begradigen Sie mit einer Pinzette den Bereich um den gemeinsamen Gallengangsschnitt und führen Sie den Schlauch in die Öffnung im gemeinsamen Gallengang ein (Abbildung 2Bv), wobei die längste Kante der abgeschrägten Spitze nach unten zur dorsalen Seite des Gallengangs führt. Diese Ausrichtung sorgt dafür, dass Harz aus der nach oben gerichteten Schlauchöffnung in den Kanal austreten kann (Abbildung 2Bv). Ziehen Sie den Seidenfadenknoten fest, um den Schlauch im gemeinsamen Gallengang zu befestigen (Abbildung 2Bvi). Injizieren Sie das Harz in den gemeinsamen Gallengang. Beobachten Sie die Gallenblase und die einzelnen Leberlappen. Massieren Sie die Leber mit einem PBS-benetzten Wattestäbchen, um das Harz gleichmäßig zu verteilen. Die Endäste der harzgefüllten Gallengänge (bei Wildtyp-Mäusen) sind an der Leberoberfläche schwach sichtbar.HINWEIS: Die erwartete Zeit zum Füllen der Leber beträgt 30 -100 s. Hören Sie auf, das Harz zu injizieren, wenn Harzpunkte an der Oberfläche der Leber erscheinen (Abbildung 2Ci, blaue Pfeilspitzen) oder wenn der Widerstand erreicht ist.HINWEIS: Arbeiten Sie so schnell wie möglich, da das Harz nach Zugabe des Harzhärters zu härten beginnt. Die Arbeitszeit ab Zugabe des Härters beträgt ca. 15 min. Entfernen Sie den Schlauch, indem Sie ihn aus dem gemeinsamen Gallengang ziehen und den Seidenknoten schnell mit einer Pinzette festziehen, um zu verhindern, dass das Harz austritt. Schneiden Sie die losen Enden der Seidennaht weg, damit sie die Injektion der Pfortader nicht stören. Entsorgen Sie den harzhaltigen Schlauch und das verbleibende Harz in den gefährlichen Abfall und die Nadel in den Scharfkörperabfall. Harzinjektion – Pfortaderharzguss Reinigen Sie die Pfortader (Fläche ~ 5 mm) von ihrem umgebenden Gewebe etwa 2 cm von ihrem Eintritt in die Leber mit einer geraden Pinzette. Seidennahtfaden (Größe 4-0, 0,17 mm, 3 – 5 cm lang) unter den geräumten Bereich der Pfortader legen (Abbildung 2Ci) und einen losen Überhandknoten binden (Abbildung 2Cii). Machen Sie einen Längsschnitt in der Pfortader distal zur Leber und zum Knoten (Abbildung 2Ciii). Mischen Sie 1 mL des grünen Harzes mit 50 μL des Härters (durch Auffüllen und Entleeren einer 1 mL Spritze) und füllen Sie die 1 mL Luer Spritze mit dem Harzhärtergemisch. Verbinden Sie die gefüllte Spritze mit dem Schlauch (Set #2 für >P30 Mäuse, neues Set #1 für <P30 Mäuse). Drücken Sie den Kolben, um den Schlauch vollständig zu füllen. Stellen Sie sicher, dass das Harz von der Spitze des Schlauches tropft.HINWEIS: Vermeiden und entfernen Sie Blasen in der Spritze und im Schlauch, um beste Ergebnisse zu erzielen. Richten Sie die Pfortader mit einer Pinzette aus, indem Sie das umgebende Gewebe in Richtung des Experimentators ziehen, und führen Sie den Schlauch mit der längsten Kante der abgeschrägten Spitze in Richtung der dorsalen Seite des Gefäßes ein (Abbildung 2Ciii). Ziehen Sie den Seidenfaden fest, um den Schlauch in der Pfortader zu sichern. Injizieren Sie das Harz in die Pfortader. Beobachten Sie, wie sich die Blutgefäße mit Harz füllen. Massieren Sie die Leber mit einem PBS-benetzten Wattestäbchen, um das Harz gleichmäßig zu verteilen (Abbildung 2Civ). Hören Sie auf, das Harz zu injizieren, wenn alle Blutgefäße gefüllt sind (enden der Pfortadern sind an der Leberperipherie sichtbar) oder wenn der Widerstand erreicht ist.HINWEIS: Arbeiten Sie schnell, da das Harz nach der Zugabe des Härters zu härten beginnt. Die Arbeitszeit nach Zugabe des Härters beträgt ca. 15 min für Injektionsset Nr. 1 und 25 min für Injektionsset Nr. 2. Entfernen Sie den Schlauch, indem Sie den Schlauch aus der Pfortader herausziehen und den Seidenknoten schnell mit einer Pinzette festziehen, um zu verhindern, dass das Harz austritt. Entsorgen Sie den harzhaltigen Schlauch und das verbleibende Harz in den gefährlichen Abfall und die Nadel in den Scharfkörperabfall. Leberdissektion und FixierungSezieren Sie die gesamte Leber, indem Sie sie vom umgebenden Gewebe und dem Zwerchfell abschneiden. Legen Sie die gesamte Leber vorsichtig in ein leeres konisches 50-ml-Röhrchen, wobei die ventrale Seite nach oben zeigt und die dorsale Seite auf der Wand des konischen Tubus ruht, um eine Verformung der Leber zu verhindern. Lagern Sie das konische Rohr horizontal über Nacht bei 4 °C, damit das Harz vollständig aushärtet.HINWEIS: Jeder Behälter, der groß genug ist, um in die Leber zu passen, kann anstelle von 50 ml konischem Rohr verwendet werden. Die Verwendung eines Behälters mit flachem Boden erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass die Leber nicht verformt ist. Trennen Sie die Leber in einzelne Lappen. Treffen Sie eine Auswahl der Lappen, die für die microCT-Analyse (1.4.4-1.4.5) oder die Qualitätskontrolle (1.4.6-1.4.8) verwendet werden. Verwenden Sie optional die gesamte Leber sowohl für die optische Reinigung als auch für die microCT, ohne sie in einzelne Lappen zu trennen.HINWEIS: Die Leberarchitektur des Gallen- und Gefäßsystems ist in jedem Lappen unterschiedlich, und daher sind abgestimmte Lappenanalysen erforderlich. Das optische Clearing stört das microCT-Scannen nicht, und die für die Qualitätskontrolle verwendeten Lappen können anschließend mit microCT gescannt werden. Umgekehrt können mit microCT gescannte Proben nachträglich optisch zum Vergleich freigegeben werden. Die gesamte Leberanalyse ist somit möglich. Bei Wildtyp-Mäusen (genetischer Hintergrund C3H/C57bl6) wird der rechte mediale Lappen zuerst durch Harzinjektionen gefüllt, was ihn zu einem geeigneten Lappen für die microCT-Analyse mit höchster Reproduzierbarkeit macht. Der linke Seitenlappen ist der größte Lappen, in dem es daher einfach ist, die Injektionsqualität vorzusieben. Die Auswahl des Lappens (oder der ganzen Leber), der für die Qualitätskontrolle und das MicroCT-Scannen verwendet wird, hängt vom Tiermodell und der Forschungsfrage ab. In einer belüfteten Haube 4% ige Formaldehydlösung (10 -20 ml pro Röhrchen) herstellen. Fixieren Sie die für microCT verwendeten Lappen mit 4% Formaldehyd über Nacht bei 4 °C und waschen Sie sie anschließend einmal mit PBS (10 -20 ml pro Tube). Sammeln Sie Formaldehydabfälle in einem separaten Behälter. Bewahren Sie die Leberlappen in PBS bei 4 °C für die kurzfristige Lagerung oder 70% Ethanol für die Langzeitlagerung auf. Fahren Sie mit Abschnitt 2: Mikro-Computertomographie fort.VORSICHT: Formaldehyd verursacht akute Toxizität, wenn es geschluckt, eingeatmet oder mit der Haut in Berührung kommt. Formaldehyd ist eine brennbare Flüssigkeit und Dampf. Es verursacht schwere Hautverbrennungen und Augenschäden. Kann eine allergische Hautreaktion verursachen. Tödlich beim Einatmen (konzentriert oder in Pulverform). Kann Atemwegsreizungen verursachen. Verdacht auf genetische Defekte. Kann Krebs verursachen. Verursacht Schäden an Organen (Augen, zentrales Nervensystem). Vorsichtshinweise – Von Hitze, heißen Oberflächen, Funken, offenen Flammen und anderen Zündquellen fernhalten. Rauchen verboten. Tragen Sie Schutzhandschuhe und Schutzkleidung. Im Falle eines Verschüttens sofort alle Kleidungsstücke ausziehen, die kontaminiert waren. Bei Kontakt mit der Haut: Spülen Sie den kontaminierten Bereich mit Wasser ab. Wenn eingeatmet: Entfernen Sie die Person an die frische Luft und überwachen Sie die Atmung, wenn Sie sich wohl fühlen. Rufen Sie sofort eine Giftnotrufzentrale / einen Arzt an. Wenn in den Augen: Spülen Sie die Augen mit Wasser für einige Minuten. Wenn vorhanden und möglich, entfernen Sie Kontaktlinsen. Zur Qualitätskontrolle fixieren Sie die verbleibenden Lappen (mindestens einen) mit 50% Methanol (gemischt mit deionisiertem Wasser) für mindestens 4 h, schaukeln bei Raumtemperatur, gefolgt von 100% Methanol über Nacht schaukeln bei Raumtemperatur. Sammeln Sie Methanolabfälle in einem separaten Behälter.VORSICHT: Methanol verursacht akute Toxizität, wenn es geschluckt, eingeatmet oder mit der Haut in Berührung kommt. Methanol ist eine brennbare Flüssigkeit und Dampf. Tragen Sie Schutzhandschuhe und -kleidung. Vermeiden Sie das Atmen bei der Handhabung und halten Sie sich von Feuer und Hitze fern. Waschen Sie die Haut gründlich nach der Anwendung. Im Falle eines Verschüttens sofort alle kontaminierten Kleidungsstücke ausziehen. Spülen Sie die Haut mit Wasser ab. Wenn eingeatmet: Entfernen Sie die Person an die frische Luft und halten Sie sich beim Atmen wohl. Wenn Sie eingeatmet, geschluckt oder exponiert werden, rufen Sie ein Giftzentrum / einen Arzt an. In einer belüfteten Haube Benzylalkohol und Benzylbenzoat (BA: BB, 1:2) (5 -10 ml pro Lappen) Lösung herstellen. Legen Sie den Leberlappen in ein 15- oder 50-ml-Polypropylenröhrchen (abhängig von der Größe des Lappens), das BABB-Lösung enthält. Lassen Sie es bei Raumtemperatur schaukeln, bis es transparent ist. Dieser Schritt kann je nach Größe des Lappens zwischen 2-16 h dauern.HINWEIS: Die BABB-Lösung löst bestimmte Arten von Kunststoff auf. Es ist sicher, die Proben in Polypropylenröhrchen oder Glasbehältern zu lagern.VORSICHT: Benzylbenzoat kann beim Verschlucken akute Toxizität verursachen. Es ist giftig für Wasserlebewesen mit lang anhaltender Wirkung. Vorsichtshinweise: Die Haut nach der Handhabung gründlich waschen. Es ist schädlich, wenn es geschluckt wird, mit der Haut in Berührung kommt oder eingeatmet wird. Vermeiden Sie das Einatmen von Rauch / Dämpfen. Waschen Sie sich nach der Handhabung gründlich die Hände. Essen, trinken oder rauchen Sie nicht, wenn Sie dieses Produkt verwenden. Bei Verschlucken – bei Unwohlsein eine Giftnotrufzentrale / einen Arzt aufsuchen In belüfteten Bereichen anwenden. Sammeln Sie verschüttetes Material. Entsorgen Sie den Inhalt/Behälter einer zugelassenen Abfallentsorgungsanlage. Überprüfen Sie die Qualität der Injektion. Nur gut injizierte Leber sollte mit microCT gescannt werden. 2. Mikro-Computertomographie Probenvorbereitung Bereiten Sie 1% Agarosegel vor, indem Sie 100 ml destilliertes Wasser und 1 g Agarosepulver mischen. Legen Sie die Mischung in eine Mikrowelle und kochen Sie die Lösung, bis sich das Agarosepulver auflöst. Temperieren Sie das 1% ige Agarosegel auf ~ 40 ° C, um eine thermische Schädigung der Leberprobe zu vermeiden. Legen Sie den oder die Lappen von Interesse in ein 15 ml konisches Röhrchen und füllen Sie es mit dem 1% igen Agarosegel auf etwa 2/3 des Gesamtvolumens des Röhrchens. Dieser Schritt minimiert unerwünschte Probenbewegungen während der CT-Messung. CT-MessungHINWEIS: Die folgenden Schritte sind CT-geräteabhängig, und spezifische Einstellungen und Aktionen können sich für verschiedene CT-Geräte und Hersteller unterscheiden. In diesem Protokoll wurde der verwendete Mikrocomputertomograph mit einer Nanofokus-Röntgenröhre (180 kV/15 W) und einem dynamischen Flachbildschirm 41|100 (4048 px x 4048 px, Pixelgröße 100 mm mit Binning 2) für die CT-Messungen ausgestattet. Montieren Sie das konische 15-ml-Rohr mit der Probe auf der Rotationsstufe eines CT-Geräts und lassen Sie es sich für mindestens 1 h thermisch an die Messkammer anpassen. Wenn die Probe thermisch angepasst ist, zentrieren Sie sie im Sichtfeld (FOV). Optimieren Sie die Entfernungen zwischen Quellprobe und Probendetektor (SSD, SDD), um eine ausreichende Voxelauflösung zu erreichen, z. B. 12 μm für eine adulte Murinenleberprobe oder 6,5 μm für <P30-Leber, entsprechend den Abmessungen des Sichtfelds (für zuvor spezifizierte Hardware) 24,3 mm × 24,3 mm bzw. 13,2 mm × 13,2 mm. Stellen Sie die Erfassungsparameter (z. B. Beschleunigung von Spannung und Strom, Exposition, Binning, Mittelwertbildung) gemäß den Empfehlungen des CT-Geräteherstellers ein, um ein ausreichendes Maß an erkanntem Signal zu erreichen. Diese Parameter sind nicht nur CT-geräteabhängig, sondern auch probenabhängig und sollten für jede Probe optimiert werden. In Hankeova et al.9 waren die Einstellungen: 80 kV Beschleunigungsspannung, 160 μA Beschleunigungsstrom, 400 ms Belichtungszeit und 2000 Bilder. Starten Sie eine CT-Messung. Verwenden Sie eine spezielle tomographische Rekonstruktionssoftware, um die CT-Daten zu rekonstruieren. 3. Analyse und Datensegmentierung HINWEIS: Die folgenden Schritte sind von der Bildverarbeitungssoftware abhängig. Spezifische Einstellungen und Aktionen können je nach verwendeter Software unterschiedlich sein. CT-Daten laden: Wählen Sie Datei > Befehl > importieren. Eine weitere Auswahl ist abhängig vom spezifischen Format der zu verarbeitenden CT-Daten. Verwenden Sie die Funktion Oberflächenbestimmung auf der oberseiten Seite, um das Harz in den Daten mithilfe der globalen Schwelle zu segmentieren. Bestimmen Sie im Dialogfenster den Schwellenwert mit Histogrammauswertung, indem Sie die Position der roten “Isovalue”-Linie so einstellen, dass nur die mit Harz gefüllten Behälter segmentiert werden (d.h. von der gelben Linie im dargestellten “Vorschaufenster” umschlossen) (Abbildung 3A). Wählen Sie im linken Bereich das Modul ROI aus Volumen/CAD/Mesh erstellen aus , um eine Region of Interest (ROI) der mit Harz gefüllten Behälter zu erstellen. Verwenden Sie im Dialogfenster die Option ROI(s) aus Solid erstellen, wählen Sie den Namen des verarbeiteten Volumes aus und bestätigen Sie. Eliminieren Sie fehlerhafte Segmentierungen von Rauschclustern im Hintergrundbereich dieses ROI. Markieren Sie diesen ROI im rechten Bereich, klicken Sie mit der rechten Maustaste darauf und wählen Sie das Modul Split ROI aus. Setzen Sie im Dialogfenster den Parameter Minimum Volume [voxel] so, dass alle Rauschpartikel ausgeschlossen werden – dieser Wert ist experiment- und datenabhängig und muss für jede zu analysierende Probe optimiert werden (Abbildung 3B). Erstellen Sie glatte, kontinuierliche und feste Kanalmasken ohne Artefakte im HARZguss-ROI – z. B. das Vorhandensein von Luftblasen oder Harzleckagen. Verwenden Sie im linken Bereich das Modul Glättung, setzen Sie den Parameter Glättungsfestigkeit auf 1 oder 2 (abhängig von den einzelnen Daten, wenn höhere Werte zu einer Modellverformung führen können, insbesondere bei feinen Strukturen). Führen Sie diesen Prozess bei Bedarf zweimal aus (Abbildung 3C). Identifizieren und trennen Sie die einzelnen röhrenförmigen Systeme in der segmentierten Harzmaske. Erstellen Sie einen separaten ROI für das System, das mit dem absorbierenderen Harz (dem gelben Harz, das für die übliche Gallenganginjektion verwendet wird) mit höheren Intensitätswerten in den CT-Daten gefüllt ist. Befolgen Sie das in Schritt 3.2 beschriebene Verfahren. (Abbildung 3Di). Markieren Sie den neuen ROI und den ROI der Harzmaske, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie ROI(S) subtrahieren und den neuen ROI vom ROI der Harzmaske subtrahieren, um einen neuen ROI für das verbleibende Rohrsystem zu erstellen (Abbildung 3Dii, iii). Exportieren Sie die resultierenden ROIs für beide Rohrsysteme in verschiedenen Formaten, basierend auf den Präferenzen des Bedieners, zur anschließenden Verarbeitung in unterschiedlicher Software. Verarbeiten Sie außerdem die resultierenden ROIs in einer Volumengrafiksoftware, um die endgültige Visualisierung in Form eines Bildes oder eines Videos zu exportieren.

Representative Results

Was ist zu tunEine erfolgreiche Doppelharzeninjektion wird erreicht, wenn sowohl die intrahepatischen Gallengänge als auch das Gefäßsystem der Pfortader gut gefüllt sind. Als Qualitätskontrollschritt ermöglicht die Reinigung eines Lappens (z. B. des linken lateralen Lappens) die Überprüfung einer erfolgreichen Injektion, gefolgt von der Bildgebung von Lappen von Interesse. Der optisch gereinigte Lappen kann später mit microCT gescannt werden; Somit ist es möglich, die gesamte Leber optisch zu reinigen. In gut injizierter Mausleber sollte das Gefäßsystem der Pfortader mit Harz gefüllt werden, bis die Leberperipherie und das Harz in Seitenästen sichtbar sein sollten (Abbildung 4), und diese Architektur wird in gescannten und segmentierten microCT-Daten getreu rekapituliert. Darüber hinaus sollten gut injizierte intrahepatische Gallengänge neben den Hauptästen der Pfortader sichtbar sein, die sich fast bis zur Peripherie erstrecken, und Harz sollte in den wichtigsten Seitenästen sichtbar sein. Wenn der Kontrolllappen den Qualitätskontrollschritt besteht, können die Lappen von Interesse (einschließlich des optisch abgefertigten) mit microCT gescannt werden. Das Ergebnis der segmentierten Daten aus einer gut injizierten Leber ist für eine P15-Maus (Abbildung 4A,B) und eine erwachsene Maus (Abbildung 4C,D) dargestellt. Was nicht zu tun istIntaktes Lebergewebe ist Voraussetzung für eine erfolgreiche Injektion. Seien Sie besonders vorsichtig, wenn Sie die Bauchhöhle und das Zwerchfell schneiden, um das Lebergewebe nicht versehentlich zu nicken. Wenn die Leber während dieses Eingriffs physisch geschädigt wird, tritt das Harz während der Injektion der Pfortader sehr wahrscheinlich aus (Abbildung 5A). Es ist nicht möglich, eine gute Injektion des Gefäßsystems zu erreichen, wenn die Leber körperlich geschädigt ist. Einer der häufigsten Fehler ist die Unterfüllung der Leber mit Harz, was zu Herausforderungen bei der Visualisierung oder Analyse führen kann. Eine der Ursachen für die Unterfüllung des Systems ist eine vorzeitige Harzhärtung in der Nadel oder der Schlauchspitze, bevor die Injektion abgeschlossen ist (Abbildung 5B, blaue Pfeilspitzen, Klammern zeigen große Blasen). Eine gute Praxis ist es, einen Injektionssatz pro Tier zu verwenden und schnell zu arbeiten, nachdem das Härter dem Harz zugesetzt wurde. Wenn das Harz während der Injektion aushärtet (was durch ein halbgefülltes System beobachtet werden kann, hier veranschaulicht mit einem halb gefüllten Portalvenengefäß), entfernen Sie den Schlauch, schneiden Sie die Spitze des Schlauches ab (immer diagonal, um eine abgeschrägte Spitze zu erzeugen) und drücken Sie den Kolben. Wenn das Harz wieder zu tropfen beginnt, setzen Sie den Schlauch vorsichtig wieder ein und sichern Sie ihn mit der Naht. Wenn das Harz in der Nadel ausgehärtet ist, ersetzen Sie den Schlauch vollständig, füllen Sie ihn mit Harz (vermeiden Sie Blasen), führen Sie den Schlauch vorsichtig wieder ein und befestigen Sie ihn mit der Naht. Es kann schwierig sein, den Schlauch zu ersetzen, insbesondere bei jungen postnatalen Mäusen <P30, da das Gewebe zerbrechlicher ist. Eine weitere Ursache für eine schlechte Harzfüllung des Gefäßsystems der Pfortader kann eine unzureichende transkardiale Perfusion sein (Abbildung 5C, blaue Pfeilspitzen bezeichnen Blut, das in terminalen Ästen sichtbar ist). Dies kann beobachtet werden, wenn die Spitzen der Gefäße mit Blut anstelle von Harz gefüllt sind. Um dies zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Pfortader (außerhalb der Leber) vor der Injektion kein Blut enthält. Die dritte Ursache für eine untergefüllte Leber ist, wenn der Schlauch zu tief in die Leber eingeführt wird und in einen Ast in Richtung eines der Lappen eintritt. Um dies zu verhindern, führen Sie den Schlauch mindestens 0,5 cm vom Eingang in die Leber ein. Umgekehrt werden eines oder beide Systeme mit Harz überfüllt (Abbildung 5D). Es ist notwendig, die Leber während der Injektion visuell zu überwachen. Das Gießen von Gallensystemen mit Harz ist eine größere Herausforderung als das Gießen von Pfortaderharz, da harzgefüllte Kanäle auf der Leberoberfläche nur schwach sichtbar sind und es schwierig ist zu beurteilen, wann das System fast voll ist und wann es gestoppt werden muss. Wenn kleine gelbe Harzpunkte auf der Leberoberfläche erscheinen (Abbildung 2Ci, blaue Pfeilspitze), ist dies ein Zeichen dafür, dass das Gallensystem vollständig gefüllt ist und das Harz aus den Kanälen austritt. Kleinere Harzleckagen können während der microCT-Datensegmentierung manuell korrigiert werden (Abbildung 5D, rechte Panels). Wenn der Injektionsdruck zu hoch ist, kann dies dazu führen, dass Gefäße oder Kanäle reißen (Abbildung 5E), wodurch die Behälter- oder Kanalarchitektur irreversibel beschädigt wird. Die Leber ist nicht für microCT-Scans oder -Analysen geeignet. Um eine Überfüllung des Harzes zu vermeiden, optimieren Sie in jedem Mausmodell das richtige Volumen und den richtigen Druck für die Injektion. Bei der Arbeit mit Mäusen, die mit einer toxischen Ernährung, genetischer Veränderung oder Leberschädigung, die das Gallen- oder Venensystem betrifft, oder Lebersteifigkeit konfrontiert wurden, müssen der Injektionsdruck und das Injektionsvolumen möglicherweise angepasst werden, da volumen- und druckverträglicher Druck sich von den Wildtypmäusen unterscheiden können. Dieses Protokoll beschreibt die manuelle Einspritzung der beiden Systeme, aber es ist möglich, die Spritze an eine Pumpe anzuschließen, um den Einspritzdruck zu standardisieren. Blasen sind ein weiteres sehr häufiges Injektionsartefakt, das zu einer spärlichen Füllung der röhrenförmigen Netzwerke führt (Abbildung 5F-H, blaue Pfeilspitzen). Um Blasenbildung zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Spritze und der Schlauch keine Blasen enthalten, vollständig mit Harz gefüllt sind und das Harz vor der Injektion von der Spitze des Schlauches tropft. Kleine Blasen, die als negative Bereiche auf den microCT-Daten erscheinen, können während der Nachbearbeitungsschritte manuell korrigiert werden, obwohl dies mühsam ist. Frisch ist das BesteDie Verwendung von frischem gelbem Harz ist ein entscheidender Faktor, der den Kontrast der beiden Harze und die microCT-Datensegmentierung erheblich beeinflusst. Wenn das frisch geöffnete Harz verwendet wird (Abbildung 6A), besteht ein deutlicher Kontrastunterschied zwischen den gelben harzeinjizgespritzten Gallengängen (hellweiß) und den grünen harzinjizgespritzten Pfortadern (hellgrau). Leber, die mit frischem Harz injiziert wird, kann leicht mit automatisierter globaler Schwelle verarbeitet werden. Bei längerer Lagerung fällt das Harz aus und der Kontrast nimmt ab. Nach 3 Monaten Lagerung kann der Kontrast noch ausreichen, um die Pfortader vom Gallengang zu unterscheiden (Abbildung 6B), aber die Ausfällung beeinflusst die Vermischung der beiden Harze, was als heterogene Opazität in der gefüllten Pfortader sichtbar ist (Abb. 6B, blaue Pfeilspitzen). Heterogener Kontrast wirkt sich negativ auf die automatisierte Schwelle aus und erfordert manuelle Korrekturen, was die Bearbeitungszeit erhöht. Ist das Harz älter als sechs Monate, hat sich der Kontrast bis zu einem Punkt abgebaut, an dem es nicht möglich ist, den gelb injizierten Gallengang allein anhand ihres Kontrastes von der grün injizierten Pfortader zu unterscheiden (Abbildung 6C). In diesem Fall müssen der Gallengang und die Pfortader manuell basierend auf ihrem Durchmesser und ihrer Position im Hilarbereich segmentiert und manuell durch die gesamten microCT-Daten verfolgt werden. Dieses Verfahren ist äußerst zeitaufwendig und wird am besten vermieden. Abbildung 1: Injektionsset für Harzguss. (A) Injektionsset Nr. 1 besteht aus einer 30 G Nadel und einem PE10-Schlauch, der ~30 cm lang ist. Das Injektionsset #2 besteht aus einer 23 G Nadel und einem PE50-Schlauch mit einer Länge von ~30 cm. (B) Die Spitze des Schlauches wird in einem Winkel gestreckt und geschnitten, um eine abgeschrägte Spitze zu erzeugen. Das Lineal in A und B ist ein Zentimeterlineal mit großen Schritten von 1 cm, Zwischenschritten von 5 mm und kleinen Schritten von 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Flussdiagramm des Doppelharzgusses. (A) Schematische Darstellung des mausinen venösen Kreislaufsystems und des Herzens mit hervorgehobenem rechten Vorhof, der vor der Durchblutung weggeschnitten werden sollte, und des linken Ventrikels, in den die Nadel zur Perfusion eingeführt werden sollte, um das Blut aus dem Kreislaufsystem zu waschen. Die untere Hohlvene sollte unter den Nieren durchtrennt werden, um den Gefäßdruck zu entlasten. (B) Flussdiagramm für die Injektion von Gallengangsharz. (i) Zoombild von (A) mit der Darstellung, wo der IVC durchtrennt werden soll. (ii) Bild, das den gemeinsamen Gallengang (gelbe gepunktete Linie) von der Leber-Hilar-Region bis zum Schließmuskel von Oddi (schwarze Pfeilspitzen) darstellt, mit Nahtfaden unter dem gereinigten gemeinsamen Gallengang. (iii) Geeignete Position für losen Überhandknoten um den gemeinsamen Gallengang. (iv) Die gelbe gepunktete Linie und die schwarzen Pfeilspitzen beschriften den Schließmuskel von Oddi und zeigen den schrägen Winkel für den Schnitt und wie die Öffnung nach dem schrägen Winkelschnitt aussehen soll. (v) Schematische Darstellung der Orientierung der PE10-Rohrfasenöffnung (nach oben) beim Einsetzen. vi) Aussehen des eingespritzten gelben Harzes; Harz sollte den lose gebundenen Knoten leicht passieren. IVC, untere Hohlvene; CBD, gemeinsamer Gallengang. (C) Flussdiagramm zur Injektion von Pfortaderharz. (i) Die grün gepunktete Linie markiert die Pfortader aus der Hilarregion. Die blauen Pfeilspitzen beschriften das überfüllte Gallensystem. (ii) Geeignete Stelle für losen Überhandknoten um die Pfortader. (iii) Schematische Darstellung der Fasenöffnung (nach oben) beim Einsetzen. iv) Aussehen der Leber bei Injektion von grünem Harz und gelbem Harz; Beachten Sie das harzgefüllte Blutgefäß in der Leberperipherie. PV, Pfortader. Abbildung 2A wurde mit Biorender.com erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Mikro-CT-Datenverarbeitung in Volumengrafiksoftware. (A) Oberflächenbestimmung, (i) überschätzter Isowert (aktuelle Vorschau der Auswahl ist in gelber Farbe dargestellt), (ii) unterschätzter Isowert, (iii) optimale Auswahl des Isowertes zur richtigen Oberflächenbestimmung von Pfortader und Gallengängen. (B) Aufteilung des interessierenden Bereichs (ROI), der durch Oberflächenbestimmung erstellt wird, (i) Setzen Sie den Wert im Dialogfenster so hoch, dass nur ein Segment (das größte) übrig bleibt, (ii) in gelben Rahmen werden die kleineren (ausgeschlossenen) Partikel angezeigt. (C) Oberflächenglättung der Daten, (i) Glättungsfunktion befindet sich im linken Bereich, (ii) Einstellung der Glättungsstärke auf 1 (max. 2) und Erstellung eines neuen geglätteten ROI, (iii) geglättete Daten. (D) Trennung einzelner röhrenförmiger Systeme, (i) in der Oberflächenbestimmungsfunktion den Isowert so einstellen, dass nur das Gallensystem in die Auswahl einbezogen wird (die aktuelle Vorschau der Auswahl wird in gelber Farbe angezeigt), (ii) den ROI beider Systeme und den ROI nur des Gallensystems markieren und den ROI des Gallensystems vom ROI beider Systeme subtrahieren, iii) Vena portal in grau dargestellt, das Gallensystem grün dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Gut injizierte Gallengangs- (BD) und Pfortader- (PV)-Systeme. (A) Optisch gereinigter rechter medialer Lappen (RML) der leber nach dem 15. Tag (P15), injiziert mit zwei Harzen in die beiden Systeme. Maßstabsbalken 1 mm. (B) 3D-Rendering von P15 RML gezeigt in (A) Darstellung der Pfortader-Vaskulatur in Weiß und des Gallensystems in Grün. Maßstabsleiste 1 mm. (C) Optisch gereinigtes RML von erwachsener Leber, injiziert mit zwei Harzen in die beiden Systeme. Maßstabsbalken 1 mm. (D) 3D-Rendering von RML für Erwachsene, dargestellt in (C) Darstellung des Gefäßsystems der Pfortader in Weiß und des Gallensystems in Grün. H = Hilar, P = Peripherie. Maßstabsleiste 1 mm. Die Paneele A, B, D werden mit Genehmigung von Hankeova et al.9 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Häufige Herausforderungen bei Doppeltharz-Leberinjektionen. (A) Das Bild zeigt eine Leber, die während der anfänglichen Öffnung der Bauchhöhle versehentlich eingenickt wurde und das Harz durch den Schnitt austritt (blaue Pfeilspitze). (B) Schlecht injiziertes Pfortadersystem aufgrund von Harzhärtung. Blaue Pfeilspitzen kennzeichnen leere Terminalzweige und rote Klammern kennzeichnen große Blasen. Schuppenbalken 1 mm. (C) Schlecht injiziertes Pfortadersystem aufgrund einer schlechten transkardialen Perfusion. Blaue Pfeilspitzen beschriften Blut, das in den Terminalzweigen sichtbar ist. Mensurstab 1 mm. (D) Überfülltes Gallensystem, das sich in isolierten Harzkugeln manifestiert. Die linken Felder zeigen die optisch gereinigte Leber und die rechten Felder zeigen das gerenderte 3D-microCT-Bild. Die blau gepunkteten Umrisse stellen Zoom-In-Bereiche dar. Die schwarzen Pfeilspitzen markieren einen Teil der Leber, der während der optischen Reinigung nach dem microCT-Scannen beschädigt wurde. Skalenbalken 1 mm. (E) Hoher Druck während der Harzinjektion kann zu einem Bruch der Pfortader führen (das Tier in diesem Panel trägt eine Jag1H268Q-Mutation), die durch blaue Pfeilspitzen gekennzeichnet ist. Mensurbalken 1 mm. (F) Blasen im Harz während der Pfortaderinjektion (blaue Pfeilspitzen) und (G) Gallensysteminjektion (blaue Pfeilspitze), Mensur 1 mm. (H) MicroCT-Scan von Blasen (blaue Pfeilspitze), schlecht gefüllten Terminalzweigen (rote Klammern) und Harzleckage (gelbe Pfeilspitze), Mensur 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6: Differentieller Harzkontrast. (A) Frisch geöffnetes gelbes Harz erzeugt einen ausreichenden Kontrast, um harzgespritzte Pfortader (grau) und Gallengänge (weiß) zu unterscheiden. (B) Eine dreimonatige Lagerung von gelbem Harz führt zu einer Ausfällung des Harzes, was zu einer heterogenen Opazität führt (grau-weiße Pfortader, blaue Pfeilspitze). (C) Eine längere Lagerung (>6 Monate) von gelbem Harz verringert den Kontrast zwischen der Pfortader (grau) und den Gallengängen (grau). Maßstabsleiste 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Mehrere kritische Schritte bestimmen den DUCT-Erfolg, von der Probenvorbereitung bis zu den Parametern des CT-Geräts. Um die besten Ergebnisse zu erzielen, sollte gut kontrastreiches, gut injiziertes und blasenfreies Harz verwendet werden, um eine einfache digitale Verarbeitung mit automatisierter Schwelle zu ermöglichen, um 3D-Daten, Bilder und Filme zu erhalten. Mit Training und nach diesem Protokoll sind 90% der Injektionen erfolgreich und führen zu reproduzierbaren Daten. Es ist wichtig, frisches gelbes Harz zu verwenden, um den besten Kontrast zwischen den beiden injizierten Systemen zu erzielen. Das gelbe Harz hat eine sehr starke Radiopacität, während das blaue Harz eine nicht nachweisbare Radiopace aufweist. Top-Ergebnisse werden innerhalb der ersten drei Monate nach dem Öffnen einer neuen gelben Harzflasche erzielt. Mit der Zeit fällt das Harz aus, und nach längerer Lagerung (>6 Monate) sind das gelbe und das grüne Harz in CT-Scans nicht mehr unterscheidbar. Bilder mit schlechtem Kontrast erfordern eine umfangreiche und zeitaufwändige manuelle Nachverfolgung und Segmentierung der beiden Systeme. Als nächstes sind gut gedehnte Schläuche unerlässlich, um in den gemeinsamen Gallengang erwachsener Mäuse und den gemeinsamen Gallengang und die Pfortader von postnatalen Mäusen zu passen. Der Einstiegspunkt für die Injektion muss mit Sorgfalt erstellt werden. Wenn der gemeinsame Gallengang transversal aufgeschnitten wird, löst er sich wahrscheinlich vom umgebenden Gewebe und verhindert ein erfolgreiches Eindringen des Schlauches. Dieser Schritt ist besonders heikel für postnatale Mäuse, bei denen sich der gemeinsame Gallengang zurückzieht und “zusammenrollt”, wenn er sich von seinem umgebenden Gewebe gelöst hat, was das Einführen des Schlauches extrem schwierig macht. Der gemeinsame Gallengangseintritt und die Injektion können etwas Übung erfordern. Vermeiden Sie bei der Vorbereitung des Schlauches mit Harz und während der gesamten Injektion die Bildung von Blasen, da Blasen negative Räume in den CT-Bildern schaffen und eine zeitaufwändige manuelle Korrektur erfordern. Es ist wichtig, die Leber sanft zu massieren, indem sie während und nach dem Injektionsverfahren mit einem benetzten Wattestäbchen über die Oberfläche rollt, da dies eine gleichmäßige Harzausbreitung erleichtert. Nach Abschluss der Injektion und Entfernung des Schlauches muss der Seidennahtknoten schnell und vorsichtig angezogen werden, damit das Harz nicht aus der Leber fließt, bevor es vollständig polymerisiert. Für eine erfolgreiche microCT-Bildgebung muss die Probe ordnungsgemäß mit Agarose fixiert und thermisch angepasst werden, um Bewegungsartefakte in den CT-Daten zu eliminieren. Von zentraler Bedeutung sind auch die Erfassungseinstellungen, die optimiert werden sollten, um eine ausreichende räumliche Auflösung zu erreichen, um feine Strukturen aufzulösen.

Technische Modifikationen am Injektionsverfahren können vorgenommen werden, um eine Injektion bei jüngeren Mäusen zu erreichen. Derzeit ist das Harzgießen jüngerer Mauslebern durch die Verfügbarkeit von ausreichend dünnen Schläuchen begrenzt, wobei PE10 der kleinste kommerziell erhältliche Schlauch ist. Tanimizu et al. injizierten erfolgreich Kohlenstofftinte in den gemeinsamen Gallengang des embryonalen Tages 17 (E17) unter Verwendung von Glaskapillaren11. Zukünftige Tests, ob Harz über Glaskapillaren abgegeben werden kann, wären daher von Interesse. DUCT wurde weiter angepasst, um andere röhrenförmige Systeme wie die Atemwege und das Gefäßsystem der Lungenarterie zu injizieren9. Die Doppelharzinjektion könnte auch modifiziert werden, um mit anderen kommerziell erhältlichen Harzen verwendet zu werden, oder dieses Protokoll könnte für Injektionen mit Kohlenstofftinte verwendet werden.

Einer der wichtigsten limitierenden Faktoren der DUCT-Pipeline ist die Harzviskosität. DUCT kann nur zum Harzguss von Rohrstrukturen oberhalb eines Durchmessers von 5 μm verwendet werden. In diesem Datensatz konnte das Harz Rohre mit dem kleinsten Durchmesser von 5 μm9 durchdringen. Diese Größenbeschränkung schließt die Analyse von feinen Ductules und kleinen Kapillaren aus. Um die DUCT-Pipeline weiter zu kleineren Gefäßen voranzutreiben, sollten andere kommerziell erhältliche Harze getestet werden, oder die Entwicklung neuer niedrigviskoser röntgenopaker Mittel kann die Lumendurchdringung verbessern.

In Hankeova et al.9 wurde DUCT mit zwei anderen häufig verwendeten Techniken verglichen, doppelten Kohlenstofftinteninjektionen, gefolgt von Gewebereinigung und Standardfotografie, und iDISCO+ mit Färbung der Blutgefäße mit Alpha-Glattmuskelzellaktin und Gallengängen mit Cytokeratin 7, gefolgt von 3D-Bildgebung9. DUCT übertraf die beiden anderen Methoden in Bezug auf die duale Analyse (die für iDISCO+ aufgrund der hohen Leberautofluoreszenz eine Herausforderung darstellte), die 3D-Bildgebung und quantifizierung (nicht möglich mit Kohlenstofftinteninjektion) und die Lumenisierung (DUCT liefert Daten für die interne Lumenarchitektur und die Systemperfusion). Wie oben erwähnt, ist die Haupteinschränkung von DUCT die minimale Lumengröße, die injiziert und analysiert werden kann (5 μm Grenze), ein Parameter, bei dem sowohl die Kohlenstofftinjektion als auch iDISCO+ besser abgeschnitten haben. DUCT ist dem Einzelsystem-Harzguss3,5,6 überlegen, da es die Analyse jedes injizierten Systems separat ermöglicht und auch eine duale 3D-Untersuchung ermöglicht, um die architektonische Beziehung zwischen den beiden Systemen zu untersuchen.

DUCT kann angewendet werden, um zwei beliebige röhrenförmige Netzwerke in 3D zu untersuchen. Als Prinzipnachweis wurde DUCT verwendet, um das Gallen- und Pfortadersystem der Leber sowie das Gefäßsystem der Lungenarterien und der Atemwege in der Lunge zu visualisieren9. Die intrahepatischen Gallengänge entwickeln sich neben der Pfortader, und die Pfortader bietet eine strukturelle Schablone und ein Signalzentrum, das das Wachstum und die Differenzierung des Gallenbaums reguliert12. In Hankeova et al.9 untersuchte DUCT die Gallenregeneration in einem Mausmodell für die humane Kinderkrankheit Alagille-Syndrom. DUCT enthüllte bisher nicht berichtete architektonische Mechanismen, die das Gallensystem verwendete, um ein wildtypähnliches Volumen zu erreichen9. Die Alagille-Syndrom-Mäuse verwendeten zwei verschiedene Strategien: (1) in den hilaren und zentralen Regionen der Leber vergrößerte das Gallensystem seine Verzweigung und (2) in der Leberperipherie waren die de novo-erzeugten Gallengänge sehr gewunden. Diese beiden Faktoren kombinierten sich, um trotz der abnormalen Architektur ein nahezu normales Gallensystemvolumen zu erhalten. Darüber hinaus erkannte DUCT eine abnormale Verzweigung des Gallengangs, die unabhängig von der Verzweigung der Pfortader und den Gallengängen auftrat, die Verbindungsbrücken zwischen zwei Pfortadern bildeten9. Diese Phänotypen wären im Einzelharzguss unmöglich nachzuweisen und könnten in histologischen 2D-Abschnitten als Gallengangsproliferation fehlinterpretiert werden. DUCT liefert somit Daten, die die 3D-Architektur zweier röhrenförmiger Netzwerke auf der gesamten Organ- oder Lappenebene beschreiben, mit der Möglichkeit einer qualitativen und eingehenden quantitativen Analyse. DUCT könnte ein neuer Standard für postnatale Leberentwicklungs- und Leberregenerationsanalysen in verschiedenen Tiermodellen sein.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Kari Huppert und Stacey Huppert für ihre Expertise und Hilfe bei der Gallengangskanülierung und ihre Laborgastfreundschaft. Wir danken auch Nadja Schultz und Charlotte L. Mattsson für ihre Hilfe bei der gemeinsamen Gallengangskanüle.

Wir danken den folgenden Bewilligungsagenturen für ihre Unterstützung:

Für Arbeiten im ERA Lab: Karolinska Institutet (2-560/2015-280), Stockholms Läns Landsting (CIMED (2-538/2014-29)), Ragnar Söderbergs stiftelse (Swedish Foundations’ Starting Grant), European Association for the Study of the Liver (Daniel Alagille Award), Swedish Heart-Lung Foundation (20170723) und Vetenskapsrådet (2019-01350).

Für die Arbeit im JK Lab: Wir erkennen die von MEYS CR (LM2018110) unterstützte Forschungsinfrastruktur des CzechNanoLab an. J.K. dank der Unterstützung des Zuschusses FSI-S-20-6353.

Materials

1.5 mL SafeSeal micro tubes Sarstedt 72.706
23 G butterfly needle with tubing BD bioscience 367283
25 G needle BD bioscience 305122
30 G needle BD bioscience 305106
Agarose Top-Bio P045
Benzyl alcohol Sigma Aldrich 108006
Benzyl benzoate Sigma Aldrich B6630
Corning 50 mL tubes Sigma Aldrich CLS430829-500EA polypropylene
Cotton swabs Medicarier 60406
Dissection Microscope Leica Camera AG Leica M60
Dulbecco's phosphate-buffered saline ThermoFisher Scientific 14190144
Ethanol 70% VWR 83801.41
Falcon tube 15 mL Verkon 331.850.084.006
Forceps curved Fine Science Tools 11051-10 Fine Graefe 10 cm curved
Forceps straight Fine Science Tools 11050-10 Fine Graefe 10 cm straight
Formaldehyde solution Sigma Aldrich F8775
GE Phoenix v|tome|x L 240 Waygate Technologoies micro computed tomography scanner
Hanks' Balanced Salt Solution ThermoFisher Scientific 14025092
Heparin Leo Pharma B01AB01 5000 IE/mL
Isolfurane Baxter FDG9623
Methanol ThermoFisher Scientific 11413413
MICROFIL Flowtech MV-122 synthetic resin yellow
MICROFIL Flowtech MV-120 synthetic resin blue
MICROFIL Flowtech MV-diluent clear resin diluent
Pasteur pipette Verkon 130.690.424.503
Peristaltic pump AgnThos 010.6131.M20
phoenix datos|x 2.0 software Baker Hughes CT data reconstruction software
Rocker VWR 444-0142
Silk suture AgnThos 14757 Black silk, 4-0, sterile, 100 m
Skin scissor Fine Science Tools 14058-09 Iris straight tip 9 cm
Spring scissor Fine Science Tools 15000-03 Vannas micro, straight tip 2 mm
Syringe 1 mL Luer BD bioscience 303172
Tubing PE10 BD bioscience 427401
Tubing PE50 BD bioscience 427411
VG Studio MAX 3.3 software Volume Graphics GmbH CT data processing and analysis software
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References

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3D Liver AnalysisDUCTDouble Resin CastingMicro-computed TomographyLiver Vascular SystemBiliary SystemLiver DiseaseLiver RegenerationBile DuctCommon Bile DuctResin InjectionLiver AnatomyLiver Visualization

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Hankeova, S., Salplachta, J., Van Hul, N., Kavkova, M., Iqbal, A., Zikmund, T., Kaiser, J., Andersson, E. R. DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis. J. Vis. Exp. (175), e62941, doi:10.3791/62941 (2021).
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