Un dispositivo de trasplante simple y efectivo para embriones de pez cebra

1. Montaje y uso del dispositivo de trasplante Montaje del dispositivo de trasplante. Conecte la jeringa hermética al gas Luer de punta 25 μL y un soporte de micropipeta con ajuste de bloqueo Luer para montar el dispositivo de trasplante (Figura 1A).NOTA: Humedecer la punta de Luer con una película delgada de agua puede ayudar a mejorar la conexión al mantener las partes unidas a través de la adhesión y cohesión del agua. Monte el dispositivo directamente en un micromanipulador manual (Figura 1B). El dispositivo se puede controlar solo con la mano dominante, liberando la otra mano para tareas adicionales. Preparación de la aguja de trasplante. Produzca una aguja de trasplante tirando de una pipeta capilar de vidrio (sin filamento) con un extractor de micropipetas. Rompa la punta de la aguja lo más suavemente posible, ya que los bordes afilados aumentan la posibilidad de rascarse la yema durante el trasplante, lo cual es fatal para el embrión.NOTA: La punta se puede romper fácilmente con una hoja de afeitar de borde recto debajo de un estereomicroscopio. Sin embargo, el uso de una microtorcha permite generar una apertura precisa del tamaño deseado. Para la generación de fuentes ectópicas, es apropiado un diámetro exterior de aproximadamente 50-60 μm. Para las extirpaciones y el trasplante de la línea germinal, el diámetro exterior de la aguja debe medir aproximadamente 80-90 μm para aumentar el número de células trasplantadas. Inserte la aguja lista para usar en el dispositivo de trasplante (Figura 1A). Uso del dispositivo de trasplante.Coloque el micromanipulador con el dispositivo de trasplante junto a un estereomicroscopio (Figura 1B). Retire el émbolo y baje la aguja de trasplante en el plato de trasplante lleno de solución de Ringer (ver paso 2.2.1) en un ángulo de 45° hasta que se sumerja la punta de la aguja (Figura 1B). El agua se precipitará por la aguja debido a la acción capilar. Inserte el émbolo aproximadamente hasta la mitad para eliminar las soluciones de Ringer, dejando solo un pequeño volumen de agua en la parte delgada y cónica de la aguja (Figura 1C).NOTA: Esta es la posición neutral, y el nivel del agua debe ser estable allí por un tiempo (>20 min). Si el nivel del agua es inestable, el aire tiene fugas; vuelva a conectar el accesorio de bloqueo Luer o reemplace la jeringa. Cuando use una aguja de trasplante por primera vez, cubra su interior extrayendo yema de un embrión sacrificado y luego expulsando el material de yema por completo. El recubrimiento ayudará a reducir la adherencia de las células al vidrio durante los procedimientos posteriores. Coloque suavemente el embrión donante con la ayuda de la aguja y luego coloque la abertura de la aguja ortogonal a la superficie del embrión (Figura 1D).NOTA: La posición será diferente para diferentes ensayos. Para la generación de fuentes de moléculas de señalización ectópica y las extirpaciones celulares, esta será la parte superior del polo animal (Figura 1E); para el trasplante de línea germinal, este será el margen (Figura 1D, F). Tire lenta y cuidadosamente del émbolo para atraer las células hacia la aguja.NOTA: Si las células se absorben demasiado rápido, pueden dañarse. Si se hace correctamente, las células deben salir como una columna cilíndrica. Evite tomar yema en la aguja, ya que la yema trasplantada es tóxica para el embrión huésped. Detenga la succión empujando suavemente el émbolo hacia abajo ligeramente una vez que se haya atraído el número deseado de células. Retire la aguja del embrión sacudiendo la aguja hacia un lado en un movimiento corto y rápido. Deje un poco de solución de Ringer a cada lado de la columna celular y restrinja las celdas al extremo cónico de la aguja (Figura 1C, D).NOTA: El líquido frente a la columna celular ayudará a separar las células de los embriones huésped al depositar la columna celular. Limpie cualquier resto de yema o restos celulares moviendo lentamente el émbolo hacia arriba y hacia abajo, mientras la aguja permanece sumergida, para lavar las células con la solución de Ringer. Si se hace correctamente, las células no dañadas permanecerán adheridas juntas en una columna mientras se lavan los escombros.NOTA: Se debe tener mucho cuidado durante este paso, ya que el nivel del agua aumentará más allá del extremo cónico de la aguja. Esto causará una afluencia repentina de agua, que se puede utilizar para lavar las células. Sin embargo, una vez que el nivel del agua ha pasado el extremo cónico, el control fino con el émbolo se reducirá, y el émbolo debe moverse más lenta y cuidadosamente. Mueva la placa de trasplante con la mano no dominante para colocar la aguja ortogonal en la superficie (ya sea polo o margen animal) del embrión huésped (Figura 1D-F).. Aplique suavemente una ligera presión y luego dé un movimiento rápido y agudo para perforar la capa envolvente del embrión huésped. Tenga cuidado de no rascarse la yema con la aguja.NOTA: Aplicar una ligera presión sobre el embrión apretándolo cuidadosamente contra las paredes del pozo aumenta la tensión superficial del embrión y, por lo tanto, facilita la perforación de la capa envolvente. Una vez que la aguja esté dentro, empuje suavemente el émbolo para extruir la columna de células en el embrión mientras retrae lentamente la aguja al mismo tiempo (Figura 1D-F). Limpieza de la aguja de trasplante. Enjuague la aguja moviendo el émbolo hacia arriba y hacia abajo mientras la aguja se sumerge en agua desionizada.NOTA: Si la aguja permanece sucia, enjuáguela con una solución de hidróxido de sodio de 10 M antes de enjuagarla nuevamente con agua. Guarde la aguja en una caja apropiada para su uso posterior. 2. Generación de fuentes ectópicas de moléculas de señalización secretadas en embriones de pez cebra Preparación de los embriones huésped y donante. Recolecta embriones recién puestos apareando peces cebra. Decorionar embriones de pez cebra en etapa de 1 célula incubando hasta 100 embriones en 0.5 mg / ml de solución de pronasa durante aproximadamente 15 min en una pequeña placa de Petri de vidrio (una descripción detallada de este procedimiento ha sido publicada por Rogers, K. W. et al.14).NOTA: Alternativamente, los embriones también pueden ser descoronados en la etapa alta justo antes del trasplante (paso 2.2), pero esto requiere que los embriones de donante inyectados y los embriones de huésped no inyectados se descorionen por separado. Sumergir los embriones en medio embrionario en un vaso de precipitados de 200 ml.NOTA: Los embriones en estadio de blástula y gastrula descorados son muy delicados. Su yema expuesta se adherirá a las superficies plásticas y se romperá al contacto con el aire. Por lo tanto, deben permanecer completamente sumergidos en el medio embrionario, transferidos con una pipeta de vidrio y mantenidos en placas de plástico recubiertas de agarosa (1% en el medio embrionario) o placas de Petri de vidrio. Vacíe cuidadosamente la mayor parte del medio embrionario y llene lentamente el vaso de precipitados con medio embrionario fresco. La agitación leve causada de esta manera facilitará la eliminación de los coriones debilitados. Repita este paso 2-3 veces. Transfiera los embriones descoronados usando una pipeta Pasteur de vidrio a una placa de inyección recubierta de agarosa.NOTA: Inflamar la punta de la pipeta Pasteur de vidrio exponiéndola a una llama de quemador Bunsen puede derretir y suavizar el borde, ayudando a prevenir daños a los embriones. Inyectar el ARNm que codifica la proteína marcada fluorescentemente en un subconjunto de embriones (una descripción detallada de este procedimiento ha sido publicada por Rogers, K. W. et al.14). Inyecte el ARNm en la célula, no en la yema, para una expresión casi homogénea. Los embriones inyectados servirán como donantes, mientras que los embriones no inyectados servirán como huéspedes.NOTA: La cantidad y el tipo de ARNm inyectado dependerán de la molécula de señalización que se esté estudiando y generalmente oscila entre 20 y 200 pg2,4,5,6 (pero puede ser tan alto como 1000 pg en ciertos casos4). Transfiera los embriones inyectados a un plato de seis pocillos recubierto de agarosa lleno de medio embrionario. Incubar a 28 °C hasta que los embriones alcancen la etapa temprana. Trasplante de células para generar fuentes ectópicas. Llene un plato de trasplante (con pozos triangulares individuales en forma de cuña, consulte la Tabla de materiales) con la solución de Ringer (116 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES; almacene el tampón HEPES a 4 °C).NOTA: El calcio en la solución de Ringer promueve la adhesión celular y ayuda al embrión a sanar del procedimiento de trasplante. Transfiera los embriones a la placa de trasplante. Coloque los embriones huésped y donante en columnas alternas, en cada caso con el polo animal orientado hacia la aguja de trasplante. Realizar el trasplante tal y como se describe en la sección 1.3. Para el trasplante de fuente ectópica, tome las células de origen de la parte superior del polo animal y depositelas en la misma ubicación en el embrión huésped (Figura 1E).NOTA: Lavar las células con la solución de Ringer como se detalla en el paso 1.3.8 es importante para la generación de fuentes ectópicas para asegurarse de que las moléculas de señalización ya secretadas no se transfieran al huésped. No trasplante demasiadas células para asegurarse de que la fuente no se disperse. Una columna de aproximadamente 80 μm de diámetro y 100 μm de longitud es apropiada para muchas aplicaciones. Permita que el embrión huésped permanezca en la solución de Ringer durante 30 minutos a 1 h para recuperarse. Examinar si las células se trasplantaron con éxito utilizando un estereomicroscopio de fluorescencia (Figura 2). Después de la recuperación, transfiera los embriones a una placa de seis pocillos recubierta de agarosa llena de medio embrionario y cúbralos a 28 ° C. 3. Generación de embriones de tamaño reducido mediante extirpación celular Preparación de embriones para la extirpación. Recolecte embriones recién puestos de pez cebra del genotipo deseado. Incubar los embriones a 28 °C hasta que alcancen la etapa alta. Decoorar los embriones como se describe en los pasos 2.1.2-2.1.5 cuando los embriones alcanzan la etapa alta.NOTA: En este ejemplo, la extirpación celular se realiza en la etapa de esfera. En consecuencia, los embriones se descoronan aproximadamente 30 min a 1 h antes. Opcional: Etiquetado de la capa sincitial de yema (YSL).NOTA: Si lo desea, inyecte dextrans fluorescente en el YSL antes de extirpar las células. Esta técnica permite determinar si el YSL permanece intacto después de la extracción celular, lo cual es importante para la embriogénesis normal15. Alternativamente, los ARNm o proteínas sintetizados in vitro también se pueden inyectar en el YSL. Use una pipeta Pasteur para transferir los embriones decoronados a un plato de inyección recubierto de agarosa lleno de agua embrionaria. Oriente los embriones lateralmente, con el margen del blastodermo apuntando hacia la aguja de inyección (Figura 3A). Inyectar 0,5 nL de 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran en el YSL, con el objetivo de obtener una región entre las células blastodérmicas y la yema a una profundidad de aproximadamente un tercio del diámetro del embrión. Inyecte todos los embriones dentro de una fila.NOTA: Dado que la aguja de inyección no necesita perforar a través del corion, una abertura pequeña (~ 4 μm) y afilada es ventajosa. Gire los embriones en 180° para que el lado opuesto del margen del blastodermo apunte hacia la aguja de inyección (Figura 3A). Inyectar otros 0,5 nL de 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran en el YSL como se describe en el paso 3.2.3, produciendo un volumen total de inyección de 1 nL por embrión.NOTA: La inyección desde dos lados permite una distribución más uniforme del dextrano fluorescente dentro del YSL. Examine el resultado de la inyección bajo un estereomicroscopio de fluorescencia. Si se hace correctamente, la señal fluorescente se restringirá al YSL (Figura 3B) y no será visible en el espacio intercelular del blastodermo. Extirpación de células Llene un plato de trasplante con la solución de Ringer (ver paso 2.2.1). Transfiera los embriones al plato de trasplante. Orientar los embriones con el polo animal hacia la aguja de trasplante (Figura 3C). Retire cuidadosamente las células de la región del polo animal como se describe en los pasos 1.3.5-1.3.7, reduciendo así el blastodermo al tamaño deseado. Deseche las células extraídas expulsándolas de la aguja de trasplante. Una vez que se complete el procedimiento, permita que los embriones permanezcan en la solución de Ringer durante 30 minutos a 1 h para recuperarse. OPCIONAL: Examinar la integridad del YSL bajo un estereomicroscopio de fluorescencia (Figura 3D). Transfiera los embriones a una placa recubierta de agarosa llena de medio embrionario y incube a 28 °C. 4. Creación de mutantes materno-cigóticos mediante trasplante de línea germinal Preparación de embriones huésped y donante. Recolecta embriones recién puestos de peces cebra mutantes y de tipo salvaje. Los embriones de pez cebra con un fondo mutante servirán como donantes, mientras que los embriones de pez cebra con un fondo de tipo salvaje servirán como huéspedes.NOTA: El trasplante de línea germinal requiere un alto número de embriones iniciales (~ 50 para donantes, ~ 500 para huéspedes) para garantizar un buen número de trasplantes exitosos de línea germinal que sobrevivan hasta la edad adulta. Transfiera los embriones a una placa de inyección recubierta de agarosa con medio embrionario utilizando una pipeta Pasteur.NOTA: Las inyecciones se realizan antes de la decorionación para aumentar el rendimiento. Las agujas para inyección a través del corion deben ser romas y tener una abertura más grande (~ 10 μm) para evitar la obstrucción. Inyectar los embriones donantes con 1 nL de 100 ng/μL mRNA codificando GFP con un nos1 3’UTR. Inyecte el ARNm en la yema para aumentar el rendimiento.NOTA: El nos1 3’UTR estabilizará el ARNm en las células germinales primordiales, haciendo que las células germinales sean fuertemente fluorescentes cuando se toman imágenes 1 día después de la fertilización10. Inyectar a los embriones huéspedes 1 nL de morfolino de 0,33 mM (3 μg/μL ) sin salida (dnd ). Inyecte el morfolino en la yema para aumentar el rendimiento.NOTA: El dnd morfolino bloquea la formación de células germinales primordiales, lo que asegura que la línea germinal del embrión huésped se poblará exclusivamente con células del donante después del trasplante10. Transfiera los embriones inyectados a placas de Petri de plástico con medio embrionario. Incubar a 28 °C hasta que los embriones alcancen la etapa alta. Decoorar los embriones como se describe en los pasos 2.1.2-2.1.5 cuando los embriones alcanzan la etapa alta. Trasplante de células germinales Llene un plato de trasplante con la solución de Ringer (ver paso 2.2.1). Transfiera los embriones de la esfera descoronada a la etapa de cúpula en el plato de trasplante. Coloque los embriones huésped y los embriones donantes en columnas alternas para trasplantar las células de un embrión donante a seis embriones huésped diferentes. Esto aumenta la probabilidad de que las células germinales de un embrión huésped determinado se trasplanten con éxito. Orientar los embriones con el margen hacia la aguja de trasplante y realizar el trasplante como se describe en la sección 1.3. Para los trasplantes de línea germinal (Figura 1D, F), tome las células de origen del margen (donde se encuentran las células germinales primordiales) y depositarlas en la misma ubicación en el embrión huésped.NOTA: El trasplante de una columna grande (aproximadamente 80 μm de diámetro y 600 μm de longitud) aumentará la probabilidad de obtener un trasplante exitoso de la línea germinal. Permita que el embrión permanezca en la solución de Ringer durante 30 minutos a 1 h para recuperarse una vez que se complete el trasplante.NOTA: Si no se espera que todos los embriones de donantes sean mutantes homocigotos, por ejemplo, si son el resultado de un cruce heterocigoto, deben genotiparse después del trasplante para determinar el genotipo de la futura línea germinal trasplantada del huésped. En este caso, asegúrese de que las posiciones de los embriones del huésped y del donante no se mezclen durante la manipulación. Use un estereomicroscopio de fluorescencia para examinar si las células se trasplantaron con éxito (Figura 4A, B). Transfiera los embriones a una placa recubierta de agarosa de 24 pocillos. Agrupe todos los embriones huésped que recibieron células del mismo donante en el mismo pozo y etiquételos en consecuencia. Incubarlos hasta el día siguiente a 28 °C. Si es necesario, transfiera los embriones de la donante a tiras de PCR marcadas para el genotipado. Detección de trasplantes exitosos de la línea germinal Examinar los embriones huéspedes para trasplantes exitosos de la línea germinal bajo un estereomicroscopio de fluorescencia aproximadamente 30 h después de la fertilización (hpf). Las células germinales se encuentran en el surco por encima de la extensión de la yema (Figura 4C).NOTA: Los experimentos típicos con el dispositivo y la estrategia presentados aquí tendrán una tasa de éxito de ~ 60% -80% para obtener al menos un embrión huésped que lleve células germinales trasplantadas por embrión donante. Un informe anterior describió una eficiencia de ~ 10. Si procede, descarte los embriones que recibieron células de embriones de donantes con un genotipo incorrecto. Cultivar larvas con células germinales trasplantadas con éxito a la edad adulta de acuerdo con las condiciones de cría estándar y siguiendo las pautas institucionales.