Hücrelerin ekstirpasyonu ve nakli gibi embriyolojik manipülasyonlar erken gelişimi incelemek için önemli araçlardır. Bu protokol, zebra balığı embriyolarında bu manipülasyonları gerçekleştirmek için basit ve etkili bir transplantasyon cihazını tanımlar.
Hücrelerin çıkarılması ve embriyoların içinde veya arasında hücrelerin nakledilmeleri gibi klasik embriyolojik manipülasyonlar, karmaşık gelişimsel süreçleri incelemek için güçlü tekniklerdir. Zebra balığı embriyoları bu manipülasyonlar için idealdir, çünkü kolayca erişilebilir, nispeten büyük ve şeffaftırlar. Bununla birlikte, hücre kaldırma ve transplantasyon için daha önce geliştirilen cihazların kullanımı hantal veya satın alınması pahalıdır. Buna karşılık, burada sunulan transplantasyon cihazı ekonomik, montajı kolay ve kullanımı kolaydır. Bu protokolde ilk olarak transplantasyon cihazının elleçlemesinin yanı sıra ticari ve yaygın olarak bulunan parçalardan montajını da tanıtıyoruz. Daha sonra kullanımı için üç uygulama sunuyoruz: lokalize kaynaklardan sinyal dağılımını incelemek için ektopik klonların üretimi, boyut azaltılmış embriyolar üretmek için hücrelerin ekstürpasyonu ve maternal-zigotik mutantlar üretmek için germline nakli. Son olarak, aracın Japon pirinç balığı medaka gibi diğer türlerde embriyolojik manipülasyonlar için de kullanılabileceğini gösteriyoruz.
Mangold ve Spemann’ın embriyonik eksen oluşumunu öğreten bir organizatörün varlığını gösteren klasik deneylerinden1, embriyolar arasındaki hücrelerin nakli embriyonik gelişimi incelemek için yerleşik bir teknik haline gelmiştir2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Transplantasyon için yaygın olarak kullanılan bir kurulum, esnek borular aracılığıyla bir mikropipette tutucuya bağlı mikrometre tahrik kontrollü gaz geçirmez şırınga ve mineral yağ ile dolu bir rezervuardan oluşur12,13. Bu kurulumda, şırınnanın pistonu bir vidadan taşınır. Bu şekilde oluşan basınç mikropipte aktarılır ve hücreleri bir embriyodan çıkarmak ve diğerine yatırmak için kullanılır. Bununla birlikte, hidrolik olarak çalıştırılan bu cihaz birçok parçadan oluşur ve sıfırdan montajı zahmetlidir. Benzer cihazlar, genellikle Manuel Mikroinjektörler olarak satılan eksiksiz bir çalışma seti olarak da satın alınabilir ve bu ticari sürümler genellikle 1500 US$’dan daha pahalıdır. Hem ev yapımı hem de ticari versiyonda, embriyo manipülasyonu için mikropipette, yağ dolu borular aracılığıyla basınç üreten cihazdan (gaz geçirmez şırınga) ayrılır. Mikropipette manipülasyonu ve pistonun hareketi, bu nedenle, verimi ve faydayı azaltarak farklı ellerle ayrı ayrı çalıştırılmalıdır. Ayrıca, tüplerin kabarcık oluşumunu önlerken dikkatlice yağ ile doldurulması gerektiğinden, cihazlar transplantasyona hazırlanmak için hantaldır. Burada, hücre çıkarma ve transplantasyon için ucuz, montajı kolay ve kullanımı kolay alternatif bir pnömatik olarak çalıştırılır cihazı tarif ediyoruz.
Burada sunulan cihaz, bir mikropipette tutucu ile donatılmış 25 μL gaz geçirmez şırıngadan oluşur ve toplam 80 US $ ‘dan daha düşük maliyetlidir. Cihaz, mikropipette tutucu luer kilit bağlantı elemanı ile şırıngaya yerleştirilerek kolayca monte edilir (Şekil 1A). Cihaz daha sonra doğrudan bir mikromanipülatöre monte edilir ve kullanıcının hem konumunu hem de emmeyi doğrudan mikromanipülatörde tek bir elle kontrol etmesini sağlar. Bu, diğer eli donör ve konak embriyoları içeren transplantasyon çanağını stabilize etmek ve hareket ettirmek için rahat bir şekilde serbest bırakır. Cihaz hava ile doğrudan emiş ile çalışır ve mineral yağ ile doldurulması gerekmez. Su ile cam iğnenin duvarları arasındaki çekici kuvvetler nedeniyle, şırınganın pistonunda bulunan büyük bir hareket, su seviyesi cam iğnenin konik ucunda olduğu sürece, iğne içindeki su seviyesinde daha küçük bir harekete çevrilir. Bu, aspire edilmiş hücrelerin sayısı ve yerleştirmelerinin konumu üzerinde hassas kontrol sağlar.
Bu cihazın yararını göstermek için zebra balığı (Danio rerio) embriyolarında üç uygulama sunuyoruz. İlk olarak, gradyan oluşumunu incelemek için kullanılabilecek salgılanan sinyal moleküllerinin lokalize kaynaklarının nasıl üretileceğini gösteriyoruz2,4,6. Burada donör embriyolara floresan etiketli bir sinyal molekülüne mRNA kodlaması enjekte edilir. Floresan etiketli donör hücreler daha sonra bir sinyal gradyanı oluşumunun görüntülenebildiği ve analiz edilebildiği vahşi tip konak embriyolara nakledilür. İkinci olarak, cihazın boyut küçültülmüş embriyolar oluşturmak için ekstirpasyonla hücreleri çıkarmak için nasıl kullanılabileceğini açıklıyoruz5,13. Son olarak, ilkel bir mikrop hücresi muhabiri taşıyan hücreleri, mikrop hattının ablated edildiği konak embriyolara naklederek anne-zigotik mutantların nasıl sağlam bir şekilde üretilmeyeceğimizi gösteriyoruz6,10. Gelecekte, burada açıklanan transplantasyon cihazı, hücrelerin çıkarılmasını veya naklini gerektiren diğer embriyolojik manipülasyonlara kolayca uyarlanabilir.
Bir transplantasyon deneyinin başarısı, deneycinin ince motor becerilerine dayanır. Prosedürleri başarıyla yürütmek için pratik yapmak gerekir. Bununla birlikte, burada sunulan enstrümanın piyasadaki diğerlerine kıyasla öğrenilmeleri ve kullanılması nispeten kolaydır ve genel olarak sadece birkaç günlük uygulamaya ihtiyaç vardır.
Transplantasyon prosedürünün başarısı çeşitli önlemler alınarak arttırılabilir. Bir adım, mikromanipülatörün kaliteli ve sorunsuz çalışma yeteneğine sahip olduğundan emin olmaktır. Stereomikroskopa daha yüksek büyütmeye sahip bir oküler eklemek, iğnenin embriyoya göre hassas bir şekilde yerleştirilmesine yardımcı olabilir. Sağlıklı embriyolar elde etmek için iyi üreyen zebra balığı veya medaka kullanmak ve elleçleme sırasında (özellikle azil adımı sırasında ve sonrasında) embriyolara zarar vermemeye özen etmek de başarı oranını artıracaktır.
Gecikmiş toksisite ile ilgili sorunların giderilmesi daha zor olabilir. Bir embriyo birkaç saat sonra ölürse – ancak transplantasyonu hemen takip etmiyorsa – yumurta sarısı iğneden zarar görmüş olabilir (örneğin, embriyoya çok derinlemesine girerek) veya belki de hücreler çok zorla dışarı atılmış olabilir. Gecikmiş toksisite ve embriyonik ölüm de donör hücrelerle birlikte enjekte edilen yumurta sarısı veya hücre kalıntılarından da sonuçlanabilir; başka bir neden, Ringer’ın çözeltisindeki HEPES tamponu bozulabilir. Bu sorunlar, hücrelerin yıkanmasıyla (bkz. adım 1.3.8) veya sırasıyla yeni bir tampon grubu kullanılarak aşılabilir. Ayrıca, germline transplantasyon deneylerinde deforme olmuş konak embriyolar aşırı yüksek morfinino konsantrasyonlarından kaynaklanabilir. Konağın vahşi tip mikrop hattını tamamen alevlendirmek için yeterli morfotin kullanmak çok önemlidir, böylece bu hücrelerin yavrulara katkıda bulunmalarını önlemek – ancak aynı zamanda aşırı yüksek morfotin konsantrasyonlarından kaçınılması gerekir. Bu nedenle, enjekte edilen tüm konak embriyolarda (tipik bir deneyde birkaç yüz) tutarlı morfosin miktarları germline transplantasyonlarının başarısının anahtarıdır. Bu, morfolino enjeksiyon karışımını, tüm embriyoların aynı enjeksiyon hacmini aldığından emin olmak için floresan stereomikroskop altında izlenebilen kolayca görülebilen bir izleyici boyası14 ile destekleyerek yardımcı olabilir.
Bu protokolde açıklanan prosedürler sadece blastula evre zebra balığı veya medaka embriyolarındaki hücrelerin manipülasyonlarını içerir, ancak gelecekte, transplantasyon iğnesinin çapını ve şeklini değiştirerek cihazı farklı aşamalara ve türlere uyarlamak muhtemel olacaktır.
The authors have nothing to disclose.
Bu proje Max Planck Society tarafından desteklendi ve Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı (637840 sayılı hibe anlaşması (QUANTPATTERN) ve 863952 (ACE-OF-SPACE) hibe anlaşması) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi’nden (ERC) fon aldı.
1.0 mm glass capillary, ends cut without filament | To make the transplantation needle | ||
200 mL glass beaker | For embryo dechorionation | ||
24-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
6-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
Agarose | To coat plastic dishes | ||
Dnd1 morpholino | Gene Tools | Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT |
|
Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source | To assess YSL injections and germ-line transplantations | ||
Glass micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | To make the transplantation needle |
Glass pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge |
Incubator at 28 °C | For incubating zebrafish embryos | ||
Luer tip 25 μL Hamilton syringe, 1700 series | Hamilton | Ref: 80201 | Part of the transplantation device |
Manual micromanipulator with 3 axes of movement | Narishige | M-152 | For controlling the transplantation device |
Manual pipetting pump | Bio-Tek | Cat. # 641 | For use with the glass pipettes to transfer embryos |
Metal dissecting probe | For moving and rotating zebrafish embryos | ||
Microforge | Narishige | MF2 | To make the transplantation needle |
Microinjection apparatus | For injection of mRNA and morpholino into embryos | ||
Microinjection molds, triangular grooves | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare microinjection plates with agarose |
Microinjection-molds, single wells | Adaptive Science Tools | PT-1 | To prepare transplantation plates with agarose |
Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary | World Precision Instruments | MPH6S10 | Part of the transplantation device |
mMessage mMachine Sp6 transcription kit |
Life Technologies | AM1340M | To generate capped mRNA for injection into embryos |
Plasmid with GFP-nos1 3'UTR | Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3'UTR of nos1 | ||
Plastic petri dish 100 mm | To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes | ||
Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos |
Ringer’s solution | For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration | ||
Stereomicroscope | For injection and transplantation |