Embryologische Manipulationen wie Exstirpation und Transplantation von Zellen sind wichtige Werkzeuge, um die frühe Entwicklung zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches und effektives Transplantationsgerät, um diese Manipulationen in Zebrafischembryonen durchzuführen.
Klassische embryologische Manipulationen, wie das Entfernen von Zellen und das Transplantieren von Zellen innerhalb oder zwischen Embryonen, sind mächtige Techniken, um komplexe Entwicklungsprozesse zu untersuchen. Zebrafischembryonen eignen sich ideal für diese Manipulationen, da sie leicht zugänglich, relativ groß und transparent sind. Zuvor entwickelte Geräte zur Zellentfernung und -transplantation sind jedoch umständlich in der Anwendung oder teuer in der Anschaffung. Im Gegensatz dazu ist das hier vorgestellte Transplantationsgerät wirtschaftlich, einfach zu montieren und einfach zu bedienen. In diesem Protokoll stellen wir zunächst die Handhabung des Transplantationsgeräts sowie dessen Montage aus handelsüblichen und weit verbreiteten Teilen vor. Wir stellen dann drei Anwendungen für seine Verwendung vor: die Erzeugung von ektopischen Klonen zur Untersuchung der Signalausbreitung aus lokalisierten Quellen, die Extirpation von Zellen zur Herstellung größenreduzierter Embryonen und die Keimbahntransplantation zur Erzeugung mütterlich-zygotischer Mutanten. Schließlich zeigen wir, dass das Werkzeug auch für embryologische Manipulationen bei anderen Arten wie dem japanischen Reisfisch Medaka verwendet werden kann.
Aus den klassischen Experimenten von Mangold und Spemann, die die Existenz eines Organizers demonstrierten, der die Bildung einer embryonalen Achse anordnet1, ist die Transplantation von Zellen zwischen Embryonen zu einer etablierten Technik zur Untersuchung der Embryonalentwicklung geworden2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Ein häufig verwendeter Aufbau für die Transplantation besteht aus einer mikrometergesteuerten, antriebsgesteuerten gasdichten Spritze, die über einen flexiblen Schlauch mit einem Mikropipettenhalter verbunden ist, und einem mit Mineralöl gefüllten Reservoir12,13. Bei diesem Setup wird der Kolben der Spritze durch eine Schraube bewegt. Der so erzeugte Druck wird auf die Mikropipette übertragen und verwendet, um Zellen aus einem Embryo herauszuziehen und in einen anderen zu deponieren. Dieses hydraulisch betriebene Gerät besteht jedoch aus vielen Teilen und ist mühsam von Grund auf neu zu montieren. Ähnliche Geräte können auch als komplettes Arbeitsset erworben werden, das normalerweise als manuelle Mikroinjektoren verkauft wird, und diese kommerziellen Versionen kosten in der Regel mehr als 1500 US $. Sowohl in der hausgemachten als auch in der kommerziellen Version wird die Mikropipette für die Embryomanipulation durch ölgefüllte Schläuche von der druckerzeugenden Vorrichtung (der gasdichten Spritze) getrennt. Die Manipulation der Mikropipette und die Bewegung des Kolbens müssen daher separat mit verschiedenen Händen betrieben werden, was den Durchsatz und den Nutzen verringert. Darüber hinaus sind die Geräte umständlich für die Vorbereitung auf die Transplantation, da der Schlauch sorgfältig mit Öl gefüllt werden muss, während die Bildung von Blasen vermieden wird. Hier beschreiben wir ein alternatives pneumatisch betriebenes Gerät zur Zellentnahme und -transplantation, das kostengünstig, einfach zu montieren und einfach zu bedienen ist.
Das hier vorgestellte Gerät besteht aus einer 25 μL gasdichten Spritze, die mit einem Mikropipettenhalter ausgestattet ist und insgesamt weniger als 80 US$ kostet. Das Gerät kann einfach montiert werden, indem der Mikropipettenhalter über die Luer-Verriegelung in die Spritze eingeführt wird (Abbildung 1A). Das Gerät wird dann direkt auf einem Mikromanipulator montiert, so dass der Benutzer sowohl seine Position als auch die Absaugung mit einer Hand direkt am Mikromanipulator steuern kann. Dies lässt die andere Hand bequem frei, um die Transplantationsschale mit Spender- und Wirtsembryonen zu stabilisieren und zu bewegen. Das Gerät arbeitet durch direkte Absaugung mit Luft und muss nicht mit Mineralöl gefüllt werden. Aufgrund der Anziehungskräfte zwischen dem Wasser und den Wänden der Glasnadel wird eine große Bewegung im Kolben der Spritze in eine kleinere Bewegung des Wasserspiegels innerhalb der Nadel übersetzt, solange sich der Wasserstand im sich verjüngenden Ende der Glasnadel befindet. Dies ermöglicht eine präzise Kontrolle über die Anzahl der angesaugten Zellen und den Ort ihrer Einführung.
Um den Nutzen dieses Geräts zu demonstrieren, stellen wir drei Anwendungen in Zebrafisch-Embryonen (Danio rerio) vor. Zunächst zeigen wir, wie man lokalisierte Quellen von sezernierten Signalmolekülen erzeugt, die zur Untersuchung der Gradientenbildung verwendet werden können2,4,6. Hier werden Spenderembryonen mit mRNA injiziert, die für ein fluoreszierend markiertes Signalmolekül kodiert. Die fluoreszenzmarkierten Spenderzellen werden dann in Wildtyp-Wirtrembryonen transplantiert, wo die Bildung eines Signalgradienten abgebildet und analysiert werden kann. Zweitens beschreiben wir, wie das Gerät verwendet werden kann, um Zellen durch Extirpation zu entfernen, um größenreduzierte Embryonen zu erzeugen5,13. Schließlich zeigen wir, wie man mütterlich-zygotische Mutanten robust produzieren kann, indem Zellen, die einen primordialen Keimzellreporter tragen, in Wirtsembryonen transplantiert werden, in denen die Keimbahn abgetragen wurde6,10. In Zukunft kann das hier beschriebene Transplantationsgerät leicht an andere embryologische Manipulationen angepasst werden, die die Entfernung oder Transplantation von Zellen erfordern.
Der Erfolg eines Transplantationsexperiments hängt stark von der Feinmotorik des Experimentators ab. Um die Verfahren erfolgreich durchzuführen, ist Übung erforderlich. Das hier vorgestellte Instrument ist jedoch im Vergleich zu anderen auf dem Markt relativ einfach zu erlernen und anzuwenden, und im Allgemeinen sind nur wenige Tage Übung erforderlich.
Der Erfolg des Transplantationsverfahrens kann durch mehrere Vorsichtsmaßnahmen verbessert werden. Ein Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass der Mikromanipulator von guter Qualität ist und reibungslos funktionieren kann. Das Hinzufügen eines Okulars mit höherer Vergrößerung zum Stereomikroskop kann helfen, die Nadel relativ zum Embryo genau zu positionieren. Die Verwendung von gut gezüchteten Zebrafischen oder Medaka zur Gewinnung gesunder Embryonen und die Sorge, die Embryonen während der Handhabung (insbesondere während und nach dem Dekationierungsschritt) nicht zu beschädigen, wird auch die Erfolgsrate erhöhen.
Probleme mit verzögerter Toxizität können schwieriger zu beheben sein. Wenn ein Embryo nach einigen Stunden stirbt – aber nicht unmittelbar nach der Transplantation – könnte das Eigelb durch die Nadel beschädigt worden sein (z. B. durch zu tiefes Eindringen in den Embryo), oder vielleicht wurden die Zellen zu stark ausgestoßen. Verzögerte Toxizität und embryonaler Tod können auch durch Eigelb oder Zelltrümmer entstehen, die zusammen mit den Spenderzellen injiziert werden; Eine weitere Ursache kann eine Verschlechterung des HEPES-Puffers in der Ringer-Lösung sein. Diese Probleme können durch Waschen der Zellen (siehe Schritt 1.3.8) bzw. durch einfache Verwendung einer neuen Charge Puffer überwunden werden. Darüber hinaus können deformierte Wirtsembryonen in Keimbahntransplantationsexperimenten auf zu hohe Morpholinokonzentrationen zurückzuführen sein. Es ist entscheidend, genügend Morpholino zu verwenden, um die Wildtyp-Keimbahn des Wirts vollständig abzutragen und so zu verhindern, dass diese Zellen zum Nachwuchs beitragen – aber gleichzeitig müssen zu hohe Morpholino-Konzentrationen vermieden werden. Konsistente Morpholinomengen über alle injizierten Wirtsembryonen (einige hundert in einem typischen Experiment) sind daher der Schlüssel zum Erfolg von Keimbahntransplantationen. Dies kann durch die Ergänzung des Morpholino-Injektionsmixes mit einem leicht sichtbaren Tracerfarbstoff14 unterstützt werden, der unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop verfolgt werden kann, um sicherzustellen, dass alle Embryonen das gleiche Injektionsvolumen erhalten.
Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren beinhalten ausschließlich Manipulationen von Zellen in Zebrafisch- oder Medaka-Embryonen im Blastula-Stadium, aber in Zukunft wird es wahrscheinlich möglich sein, das Gerät an verschiedene Stadien und Spezies anzupassen, indem der Durchmesser und die Form der Transplantationsnadel geändert werden.
The authors have nothing to disclose.
Dieses Projekt wurde von der Max-Planck-Gesellschaft unterstützt und vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union gefördert (Finanzhilfevereinbarung Nr. 637840 (QUANTPATTERN) und Finanzhilfevereinbarung Nr. 863952 (ACE-OF-SPACE)).
1.0 mm glass capillary, ends cut without filament | To make the transplantation needle | ||
200 mL glass beaker | For embryo dechorionation | ||
24-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
6-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
Agarose | To coat plastic dishes | ||
Dnd1 morpholino | Gene Tools | Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT |
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Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source | To assess YSL injections and germ-line transplantations | ||
Glass micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | To make the transplantation needle |
Glass pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge |
Incubator at 28 °C | For incubating zebrafish embryos | ||
Luer tip 25 μL Hamilton syringe, 1700 series | Hamilton | Ref: 80201 | Part of the transplantation device |
Manual micromanipulator with 3 axes of movement | Narishige | M-152 | For controlling the transplantation device |
Manual pipetting pump | Bio-Tek | Cat. # 641 | For use with the glass pipettes to transfer embryos |
Metal dissecting probe | For moving and rotating zebrafish embryos | ||
Microforge | Narishige | MF2 | To make the transplantation needle |
Microinjection apparatus | For injection of mRNA and morpholino into embryos | ||
Microinjection molds, triangular grooves | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare microinjection plates with agarose |
Microinjection-molds, single wells | Adaptive Science Tools | PT-1 | To prepare transplantation plates with agarose |
Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary | World Precision Instruments | MPH6S10 | Part of the transplantation device |
mMessage mMachine Sp6 transcription kit |
Life Technologies | AM1340M | To generate capped mRNA for injection into embryos |
Plasmid with GFP-nos1 3'UTR | Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3'UTR of nos1 | ||
Plastic petri dish 100 mm | To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes | ||
Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos |
Ringer’s solution | For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration | ||
Stereomicroscope | For injection and transplantation |