Les manipulations embryologiques telles que la disparition et la transplantation de cellules sont des outils importants pour étudier le développement précoce. Ce protocole décrit un dispositif de transplantation simple et efficace pour effectuer ces manipulations chez des embryons de poisson zèbre.
Les manipulations embryologiques classiques, telles que l’élimination des cellules et la transplantation de cellules à l’intérieur ou entre les embryons, sont des techniques puissantes pour étudier des processus de développement complexes. Les embryons de poisson-zèbre sont parfaitement adaptés à ces manipulations car ils sont facilement accessibles, de taille relativement grande et transparents. Cependant, les dispositifs précédemment développés pour l’élimination et la transplantation de cellules sont lourds à utiliser ou coûteux à l’achat. En revanche, le dispositif de transplantation présenté ici est économique, facile à assembler et simple à utiliser. Dans ce protocole, nous introduisons d’abord la manipulation du dispositif de transplantation ainsi que son assemblage à partir de pièces commerciales et largement disponibles. Nous présentons ensuite trois applications pour son utilisation : la génération de clones ectopiques pour étudier la dispersion du signal à partir de sources localisées, la disparition de cellules pour produire des embryons de taille réduite et la transplantation germinale pour générer des mutants maternels-zygotiques. Enfin, nous montrons que l’outil peut également être utilisé pour des manipulations embryologiques chez d’autres espèces telles que le poisson de riz japonais medaka.
À partir des expériences classiques de Mangold et Spemann qui ont démontré l’existence d’un organisateur instruisant la formation d’un axe embryonnaire1, la transplantation de cellules entre embryons est devenue une technique établie pour étudier le développement embryonnaire2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Une configuration couramment utilisée pour la transplantation consiste en une seringue étanche aux gaz contrôlée par un micromètre et contrôlée par un lecteur reliée à un porte-micropipette à travers un tube flexible et un réservoir rempli d’huile minérale12,13. Dans cette configuration, le piston de la seringue est déplacé à travers une vis. La pression générée de cette manière est transférée à la micropipette et utilisée pour extraire les cellules d’un embryon et les déposer dans un autre. Cependant, ce dispositif à commande hydraulique se compose de nombreuses pièces et est laborieux à assembler à partir de zéro. Des appareils similaires peuvent également être achetés en tant qu’ensemble de travail complet, généralement vendus sous forme de micro-injecteurs manuels, et ces versions commerciales coûtent généralement plus de 1500 USD. Dans la version maison et la version commerciale, la micropipette pour la manipulation d’embryons est séparée du dispositif générateur de pression (la seringue étanche aux gaz) à travers un tube rempli d’huile. La manipulation de la micropipette et le mouvement du piston doivent donc être utilisés séparément avec des mains différentes, ce qui réduit le débit et l’utilité. De plus, les appareils sont encombrants à préparer pour la transplantation car le tube doit être soigneusement rempli d’huile tout en évitant la formation de bulles. Ici, nous décrivons un dispositif alternatif à commande pneumatique pour l’élimination et la transplantation de cellules qui est peu coûteux, facile à assembler et simple à utiliser.
L’appareil présenté ici comprend une seringue étanche aux gaz de 25 μL équipée d’un porte-micropipette et coûte moins de 80 US$ au total. L’appareil est facilement assemblé en insérant le porte-micropipette dans la seringue via le raccord de verrouillage Luer (Figure 1A). L’appareil est ensuite directement monté sur un micromanipulateur, ce qui permet à l’utilisateur de contrôler à la fois sa position et l’aspiration d’une seule main directement sur le micromanipulateur. Cela laisse commodément l’autre main libre pour stabiliser et déplacer le plat de transplantation contenant des embryons de donneurs et d’hôtes. L’appareil fonctionne par aspiration directe avec de l’air et n’a pas besoin d’être rempli d’huile minérale. En raison des forces d’attraction entre l’eau et les parois de l’aiguille en verre, un grand mouvement dans le piston de la seringue se traduit par un mouvement plus petit dans le niveau d’eau à l’intérieur de l’aiguille, tant que le niveau d’eau est dans l’extrémité effilée de l’aiguille en verre. Cela permet un contrôle précis du nombre de cellules aspirées et de l’emplacement de leur insertion.
Pour démontrer l’utilité de ce dispositif, nous présentons trois applications dans les embryons de poisson-zèbre (Danio rerio). Tout d’abord, nous montrons comment générer des sources localisées de molécules de signalisation sécrétées, qui peuvent être utilisées pour étudier la formation de gradient2,4,6. Ici, les embryons de donneurs sont injectés avec de l’ARNm codant pour une molécule de signalisation marquée par fluorescence. Les cellules donneuses marquées par fluorescence sont ensuite transplantées sur des embryons hôtes de type sauvage où la formation d’un gradient de signal peut être imagée et analysée. Deuxièmement, nous décrivons comment le dispositif peut être utilisé pour éliminer des cellules par extirpation afin de générer des embryons de taille réduite5,13. Enfin, nous montrons comment produire de manière robuste des mutants maternels-zygotiques en transplantant des cellules porteuses d’un rapporteur de cellules germinales primordiales dans des embryons hôtes dans lesquels la lignée germinale avait été ablation6,10. À l’avenir, le dispositif de transplantation décrit ici pourra être facilement adapté à d’autres manipulations embryologiques nécessitant le retrait ou la transplantation de cellules.
Le succès d’une expérience de transplantation repose fortement sur la motricité fine de l’expérimentateur. Pour mener à bien les procédures, la pratique est nécessaire. Cependant, l’instrument présenté ici est relativement facile à apprendre et à utiliser par rapport à d’autres sur le marché et, en général, seulement quelques jours de pratique sont nécessaires.
Le succès de la procédure de transplantation peut être amélioré en prenant plusieurs précautions. Une étape consiste à s’assurer que le micromanipulateur est de bonne qualité et capable de fonctionner en douceur. L’ajout d’une oculaire avec un grossissement plus élevé au stéréomicroscope peut aider à positionner précisément l’aiguille par rapport à l’embryon. L’utilisation de poissons-zèbres ou de medaka bien reproducteurs pour acquérir des embryons sains et en prenant soin de ne pas endommager les embryons pendant la manipulation (en particulier pendant et après l’étape de déchorionation) augmentera également le taux de réussite.
Les problèmes de toxicité retardée peuvent être plus difficiles à résoudre. Si un embryon meurt après quelques heures – mais pas immédiatement après la transplantation – le jaune peut avoir été endommagé par l’aiguille (par exemple, en entrant trop profondément dans l’embryon), ou peut-être que les cellules ont été éjectées trop fort. Une toxicité retardée et la mort embryonnaire peuvent également résulter de l’injection de jaune ou de débris cellulaires avec les cellules donneuses; une autre cause peut être la détérioration du tampon HEPES dans la solution de Ringer. Ces problèmes peuvent être surmontés en lavant les cellules (voir étape 1.3.8) ou simplement en utilisant un nouveau lot de tampon, respectivement. En outre, les embryons hôtes déformés dans les expériences de transplantation germinale pourraient résulter de concentrations excessivement élevées de morpholino. Il est crucial d’utiliser suffisamment de morpholino pour ablation complète de la lignée germinale de type sauvage de l’hôte, empêchant ainsi ces cellules de contribuer à la progéniture – mais en même temps, des concentrations excessivement élevées de morpholino doivent être évitées. Des quantités constantes de morpholino sur tous les embryons hôtes injectés (quelques centaines dans une expérience typique) sont donc la clé du succès des transplantations germinales. Cela peut être facilité en complétant le mélange d’injection de morpholino avec un colorant traceur facilement visible14, qui peut être suivi sous un stéréomicroscope à fluorescence pour s’assurer que tous les embryons reçoivent le même volume d’injection.
Les procédures décrites dans ce protocole impliquent exclusivement des manipulations de cellules dans des embryons de poisson-zèbre ou de médaka au stade de blastula, mais à l’avenir, il sera probablement possible d’adapter le dispositif à différents stades et espèces en modifiant le diamètre et la forme de l’aiguille de transplantation.
The authors have nothing to disclose.
Ce projet a été soutenu par la Société Max Planck et a reçu un financement du Conseil européen de la recherche (CER) dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (convention de subvention n° 637840 (QUANTPATTERN) et convention de subvention n° 863952 (ACE-OF-SPACE)).
1.0 mm glass capillary, ends cut without filament | To make the transplantation needle | ||
200 mL glass beaker | For embryo dechorionation | ||
24-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
6-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
Agarose | To coat plastic dishes | ||
Dnd1 morpholino | Gene Tools | Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT |
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Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source | To assess YSL injections and germ-line transplantations | ||
Glass micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | To make the transplantation needle |
Glass pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge |
Incubator at 28 °C | For incubating zebrafish embryos | ||
Luer tip 25 μL Hamilton syringe, 1700 series | Hamilton | Ref: 80201 | Part of the transplantation device |
Manual micromanipulator with 3 axes of movement | Narishige | M-152 | For controlling the transplantation device |
Manual pipetting pump | Bio-Tek | Cat. # 641 | For use with the glass pipettes to transfer embryos |
Metal dissecting probe | For moving and rotating zebrafish embryos | ||
Microforge | Narishige | MF2 | To make the transplantation needle |
Microinjection apparatus | For injection of mRNA and morpholino into embryos | ||
Microinjection molds, triangular grooves | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare microinjection plates with agarose |
Microinjection-molds, single wells | Adaptive Science Tools | PT-1 | To prepare transplantation plates with agarose |
Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary | World Precision Instruments | MPH6S10 | Part of the transplantation device |
mMessage mMachine Sp6 transcription kit |
Life Technologies | AM1340M | To generate capped mRNA for injection into embryos |
Plasmid with GFP-nos1 3'UTR | Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3'UTR of nos1 | ||
Plastic petri dish 100 mm | To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes | ||
Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos |
Ringer’s solution | For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration | ||
Stereomicroscope | For injection and transplantation |