ゼブラフィッシュ胚の簡易かつ効果的な移植装置

1. 移植装置の組み立てと使用 移植装置を組み立てる。 Luerチップ25 μLガスタイトシリンジとマイクロピペットホルダーをLuerロックフィッティングで接続して、移植装置を組み立てます(図1A)。注:水の薄膜でLuerの先端を濡らすと、水の密着と凝集を介して部品を一緒に保持することにより、接続を強化することができます。 デバイスを手動マイクロマニピュレータに直接マウントします(図1B)。装置は支配的な手だけで制御され、他の手を解放して追加の仕事をすることができる。 移植針を準備する。 マイクロピペットプーラーでガラスキャピラリーピペット(フィラメントなし)を引っ張って移植針を作製します。 鋭い縁が移植中に黄身を掻く可能性を高め、胚にとって致命的であるため、針の先端を可能な限り滑らかに壊します。注:先端は、立体顕微鏡下で直線状のカミソリの刃で簡単に壊すことができます。しかし、マイクロフォージを使用すると、所望のサイズの正確な開口部を生成することができます。異所源発生の場合、外径は約50~60μmに適しています。駆出および生殖細胞移植の場合、針の外径は約80〜90μmを測定して移植細胞の数を増やすべきである。 すぐに使用できる針を移植装置に挿入します(図1A)。 移植装置を用いた。顕微鏡の横に移植装置を置いてマイクロマニピュレーターを置きます(図1B)。 プランジャーを取り外し、リンガーの溶液(ステップ2.2.1参照)を充填した移植皿に移植針の先端が浸るまで45°の角度で下げます(図1B)。水は毛細血管の作用のために針を急ぐ。 プランジャを約半分に挿入してリンガーの溶液を洗い流し、針の薄い先細りの部分に少量の水しか残しません(図1C)。注:これは中立的な位置であり、水位はしばらくの間(>20分)安定しているはずです。水位が不安定な場合は、空気が漏れています。Luerロックフィッティングを再接続するか、シリンジを交換してください。 移植用の針を初めて使用する場合は、犠牲胚から黄身を引き出し、黄身材料を完全に排出して内側にコーティングします。コーティングは、その後の手順でガラスに細胞の付着を減らすのに役立ちます。 ドナー胚を針の助けを借りてそっと位置決めし、針の開口を胚の表面に直交させる(図1D)。注:位置はアッセイによって異なります。異所性シグナル伝達分子の発生源と細胞駆出の場合、これは動物の極の上部になります(図1E)。生殖細胞系列移植の場合、これがマージンになります(図1D、F)。 ゆっくりと慎重にプランジャーを引き上げて、針に細胞を引き込みます。メモ:セルの取り込み速度が速すぎると、損傷を受ける可能性があります。正しく行われれば、セルは円筒形の列として出てきます。移植された黄身は宿主胚にとって有毒であるため、卵黄を針に取り込まないようにしてください。 所望の数の細胞が引き込まれたら、プランジャーを少し押し下げて吸引を止めます。短く、迅速な動きで横に針をけいれんすることによって、胚から針を取り除きます。細胞カラムの両側にRingerの溶液を残し、細胞を針の先細り端部に制限します(図1C,D)。注:細胞列の前の液体は、細胞列を堆積させるときに宿主胚の細胞を強制的に離すのに役立ちます。 残りの黄身や細胞の破片を、針を浸したまま、プランジャーをゆっくりと上下に動かして、リンガーの溶液で細胞を洗い流します。正しく行われれば、損傷を受けていない細胞は、破片が洗い流されている間、柱に一緒に接着されたままになります。注:水位は針の先細り端を越えて上昇するので、このステップ中に細心の注意を払う必要があります。これは、細胞を洗浄するために使用することができる水の突然の流入を引き起こす。しかし、水位が先細りの端を通過すると、プランジャーによる細かい制御が減少し、プランジャーをよりゆっくりと慎重に移動する必要があります。 移植皿を非支配的な手で動かし、宿主胚の表面(動物の棒またはマージン)に直交する針を配置する(図1D-F)。 穏やかに圧力を加え、そして宿主胚の包み込む層を突き刺すために速く鋭い動きを与える。針で黄身を傷つけないように注意してください。注:ウェルの壁に慎重に絞ることによって胚にわずかな圧力をかけると、胚の表面張力が増加し、包み込み層のピアスが容易になります。 針が中に入ったら、プランジャーを軽く押し込み、細胞の柱を胚に押し出しながら、針をゆっくりと引っ込めます(図1D-F)。 移植針を洗浄する。 針を脱イオン水に浸しながらプランジャーを上下に動かして針をすすきます。注:針が汚れたままの場合は、水で再びすすいする前に、10 Mの水酸化ナトリウム溶液ですすいでください。 さらに使用するために適切なボックスに針を保管してください。 2. ゼブラフィッシュ胚における分泌シグナル伝達分子の異所発生源の生成 宿主およびドナー胚を準備する。 ゼブラフィッシュを交配して、新しく産んだ胚を収集します。 デコリオネート1細胞期ゼブラフィッシュ胚は、小さなガラスペトリ皿で約15分間、プロナーゼ溶液の0.5mg/mLで最大100個の胚をインキュベートすることによって行う(この手順の詳細な説明は、ロジャース、K.W.ら14によって発表された)。注:あるいは、移植直前の高段階で胚がデコリオネートされることもありますが(ステップ2.2)、これは注射されたドナー胚と未注入の宿主胚を別々にデコリオ化する必要があります。 胚培地中の胚を200 mLビーカーに沈下する。注:デコリオネートブラストラとガストルラステージ胚は非常に繊細です。彼らの露出した黄身は、プラスチック表面に付着し、空気と接触すると破裂します。したがって、それらは完全に胚培地に浸漬し、ガラスピペットで移され、アガロースコーティングされた(胚培地の1%)プラスチック皿またはガラスペトリ皿のいずれかに維持されなければならない。 慎重に胚培地のほとんどを空にし、ゆっくりと新鮮な胚培地でビーカーを満たす。この方法で引き起こされる軽度の攪拌は、弱ったころの除去を促進する。この手順を 2 ~3 回繰り返します。 ガラスパスツールピペットを使用してデコリオネート胚をアガロースコーティングされた注射皿に移します。注:ブンゼンバーナー炎に曝してガラスパスツールピペットの先端を燃やすことは、胚への損傷を防ぐのに役立つ、エッジを溶かして滑らかにすることができます。 蛍光タグ付きタンパク質をコードするmRNAを胚のサブセットに注入する(この手順の詳細な説明は、ロジャース、K.W.ら14によって公開されています)。ほぼ均質な発現のために、卵黄ではなく細胞にmRNAを注入する。注入された胚はドナーとして機能し、未注入胚は宿主として機能する。注:注入されたmRNAの量と種類は、研究されているシグナル伝達分子に依存し、通常20〜200 pg2,4,5,6の範囲(しかし、特定のケースでは1000 pgまで可能です4)。 注射した胚を、胚培地で満たされたアガロースコーティングされた6ウェル皿に移す。胚が初期の球段階に達するまで28°Cでインキュベートする。 細胞を移植して異所性源を生成する。 移植皿(個々の三角形のくさび形の井戸で、材料表を参照)にリンガーの溶液(116 mM NaCl、2.8 mM KCl、1 mM CaCl2、5 mM HEPES;4°CでHEPESバッファーを保存)を充填します。注:リンガーの溶液中のカルシウムは細胞接着を促進し、胚が移植手順から治癒するのを助ける。 胚を移植皿に移す。 宿主およびドナー胚を交互のカラムに配置し、それぞれの場合に移植針に向けた動物の極を有する。 セクション1.3に記載されているように移植を行う。異所性の移植のために、動物の極の上からソース細胞を取り出し、宿主胚の同じ位置に預ける(図1E)。注:ステップ1.3.8で詳述されているようにRingerの溶液で細胞を洗浄することは、既に分泌されたシグナル伝達分子が宿主に引き継がれていないことを確認するために、異所源生成のために重要です。ソースが分散されていないことを確認するためにあまりにも多くの細胞を移植しないでください。直径約80μm、長さ100μmのカラムは、多くの用途に適しています。 宿主胚が30分間から1時間リンガーの溶液にとどまるのを許して回復する。 蛍光体顕微鏡を用いて細胞を移植できたかどうかを調べる(図2)。 回収後、胚をアガロースコーティングされた6ウェルプレートに移し、28°Cでインキュベートする。 3. 細胞駆出によるサイズ縮小胚の生成 駆出のための胚の準備。 所望の遺伝子型のゼブラフィッシュから新しく産んだ胚を収集します。 高い段階に達するまで、28°Cで胚をインキュベートします。 胚が高い段階に達したときにステップ2.1.2-2.1.5で説明したように胚をデコール化する。注: この例では、セルの押し出しは球の段階で実行されます。したがって、胚は約30分〜1時間早くデコリオネートされる。 省略可能: 黄身の同期層 (YSL) のラベリング。注:必要に応じて、細胞を外出させる前に蛍光デックストランスをYSLに注入してください。この技術は、正常な胚発生15にとって重要である細胞除去後にYSLがそのまま残っているかどうかを判断することを可能にする。あるいは、 インビトロで 合成されたmRNAまたはタンパク質も、YSLに注入され得る。 パスツールピペットを使用して、デコール化胚を胚水で満たされたアガロースコーティング注入皿に移します。 胚を横方向に向け、ブラスタードドルムマージンを注射針に向ける(図3A)。 1.5 μg/μL 10 kDa Alexa568-DextranをYSLに0.5 nL注入し、胚の直径の約3分の1の深さでブラストドルム細胞と黄身の間の領域を目指します。1行内のすべての胚を注入します。注:注射針は絨毛を貫通する必要がないので、小さい(〜4μm)と鋭い開口が有利です。 胚を180°回転させて、ブラストドルムマージンの反対側が注射針に向かるようにします(図3A)。 ステップ3.2.3に記載されているように、1.5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextranの別の0.5 nLをYSLに注入し、胚当たり1nLの総注入量を得る。注:両側から注入すると、YSL内の蛍光デキストランをより均一に分布させることができます。 蛍光体顕微鏡で注射結果を調べる。正しく行えば、蛍光シグナルはYSL(図3B)に限定され、ブラスタードアルムの細胞間空間には見えません。 押し出し細胞 リンガーの溶液で移植皿を充填する(ステップ2.2.1を参照)。 胚を移植皿に移す。 移植針に向けて動物の棒で胚を向ける(図3C)。 ステップ1.3.5-1.3.7に記載されているように、動物の棒領域から細胞を慎重に除去し、それによってブラストドアルムを所望のサイズに減らします。 移植針からそれらを排出することによって除去された細胞を捨てます. 処置が完了したら、胚が30分から1時間リンジャーの溶液にとどまるのを許容して回復する。 任意:蛍光体顕微鏡下でYSLの完全性を調べる(図3D)。 胚を胚培地で満たされたアガロースコーティングされたプレートに移し、28°Cでインキュベートする。 生殖細胞移植による母体接合変異体の作成 宿主およびドナー胚を準備する。 突然変異体と野生型のゼブラフィッシュの両方から敷設された新しい胚を収集します。変異型の背景を持つゼブラフィッシュの胚はドナーとして機能し、野生型の背景を持つゼブラフィッシュの胚は宿主として機能する。注:生殖細胞移植は、成人期に生き残る生殖細胞移植の成功を確実にするために、多数の開始胚(ドナーの場合は〜50、宿主では〜500個)を必要とします。 パスツールピペットを使用して胚培地でアガロースコーティング注入皿に胚を移す。注: 注入は、スループットを高めるためにデコールリオネーションの前に行われます。絨毛膜を通して注射するための針は鈍く、詰まりを防ぐために大きい開口部(約10μm)を有する必要がある。 ドナー胚に100 ng/μL mRNAの1 nLを注入し、 Nos1 3’UTRでGFPをコードします。mRNAを黄身に注入して、スループットを高めます。注: nos1 3’UTRは原始生殖細胞のmRNAを安定化させ、1日の受精後に画像化すると生殖細胞が強く蛍光を発する10。 宿主胚に0.33 mM(3 μg/μL)の 行き止まり(dnd) モルフォリーノの1 nLを注入します。モルフォリノを黄身に注入して、スループットを向上させます。注: dnd モルフォリノは原始胚細胞形成をブロックし、移植後に宿主胚の生殖細胞にドナーからの細胞が排他的に移入されることを保証する10。 注入した胚を胚培地でプラスチックペトリ皿に移す。胚が高い段階に達するまで28°Cでインキュベートする。 胚が高い段階に達したときにステップ2.1.2-2.1.5で説明したように胚をデコール化する。 生殖細胞の移植 リンガーの溶液で移植皿を充填する(ステップ2.2.1を参照)。 デコリオネートされた球体からドームステージの胚に移植皿に移す。 宿主胚とドナー胚を交互のカラムに配置し、1つのドナー胚から6つの異なる宿主胚に細胞を移植する。これにより、特定の宿主胚の胚が正常に移植される可能性が高まります。 移植針に向けてマージンを持つ胚を向け、セクション1.3に記載されているように移植を行う。生殖細胞移植(図1D,F)では、元細胞をマージン(原胚細胞が配置されている場所)から取り出し、宿主胚の同じ場所に沈着させる。注意:大きなカラム(直径約80μm、長さ600μm)を移植すると、生殖細胞系列移植に成功する可能性が高まります。 移植が完了したら、胚を30分間から1時間リンガーの溶液に留めて回復させます。注:すべてのドナー胚がホモ接合突然変異体であると予想されない場合(例えば、異種性のインクロスに起因する場合)、移植後に移植された将来の生殖細胞系列の遺伝子型を決定するために、移植後に遺伝子型化する必要があります。この場合、取り扱い中に宿主とドナー胚の位置が混ざらないようにしてください。 蛍光体顕微鏡を使用して、細胞が正常に移植されたかどうかを調べます(図4A、B)。 胚を24ウェルアガロースコーティングプレートに移します。同じドナーから細胞を受け取ったすべての宿主胚を同じ井戸にグループ化し、それに応じてラベルを付けます。28°Cで翌日までインキュベートします。 必要に応じて、ドナー胚を標識PCRストリップに移してジェノタイピングを行います。 生殖細胞の移植に成功するためのスクリーニング 蛍光体後受精(hpf)約30時間の蛍光体顕微鏡下で生殖細胞移植に成功するために宿主胚をスクリーニングする。胚芽細胞は、卵黄伸展の上の溝に見られる(図4C)。注:ここで提示されたデバイスと戦略の典型的な実験は、ドナー胚ごとに移植された生殖細胞を運ぶ少なくとも1つの宿主胚を得るために〜60%-80%の成功率を有するであろう。以前の報告書は、〜10%の効率10を説明した。 該当する場合は、誤った遺伝子型を持つドナー胚から細胞を受け取った胚を捨てる。正常に正常に成長した生殖細胞を成人期に移植し、標準的な夫の状態と、制度的ガイドラインに従って幼虫を成長させます。