Nöral Kret Hücrelerindeki Mekanik Sinyalleri İncelemek İçin Optimize Edilmiş Bir O9-1/Hydrogel Sistemi
Summary
Çok güçlü O9-1 nöral kret hücreleri ve değişen sertlikteki poliakrilamid hidrojeller kullanılarak in vitro mekanik sinyallerin incelenmesi için ayrıntılı adım adım protokoller burada açıklanmıştır.
Abstract
Nöral kret hücreleri (NCC’ler), çeşitli organ ve dokulara yol açan çok çeşitli hücre tiplerine göç ürebilen ve farklılaşabilen omurgalı embriyonik multipotent hücrelerdir. Doku sertliği, NCC farklılaşmasında kritik bir rol oynayan fiziksel bir işaret olan mekanik kuvvet üretir; ancak mekanizma belirsizliğini koruyor. Burada açıklanan yöntem, değişen sertlikteki poliakrilamid hidrojellerin optimize edilmiş üretimi, bu sertliğin doğru ölçümü ve vivo NCC’leri taklit eden bir NCC hattı olan O9-1 hücrelerindeki mekanik sinyallerin etkisinin değerlendirilmesi için ayrıntılı bilgi sağlar.
Hidrojel sertliği atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) kullanılarak ölçüldü ve buna bağlı olarak farklı sertlik seviyeleri belirtildi. Değişen sertlikte hidrojeller üzerinde kültürlenen O9-1 NCC’ler, mekanik sinyal değişikliklerinin neden olduğu çeşitli biyolojik etkilere işaret eden farklı hücre morfolojisi ve stres liflerinin gen ekspresyonunun farklı olduğunu göstermiştir. Dahası, bu, hidrojel sertliğinin değiştirilmesinin, jel sertliğini değiştirerek ve NCC’lerdeki moleküler ve genetik regülasyonu analiz ederek mekanik sinyali manipüle etmek için etkili bir in vitro sistemle sonuçlendiğini ortaya çıkarmıştır. Bu nedenle, bu in vitro sistem, NCC’lerde mekanik sinyalin rolünü ve kimyasal sinyallerle etkileşimini incelemek için güçlü bir araçtır, bu da araştırmacıların sinirsel tepe gelişimi ve hastalıklarının moleküler ve genetik mekanizmalarını daha iyi anlamalarına yardımcı olacaktır.
Introduction
Nöral kret hücreleri (NCC’ler), omurgalı embriyogenez sırasında çeşitli organ ve dokuların gelişimine katkıda bulunma ve göç etme yeteneğine sahip bir grup kök hücredir. NCC’ler, eksenel kökenlinin konumuna ve NCC1,2’ninyerel çevresel rehberliğine bağlı olarak duyusal nöronlar, kıkırdak, kemik, melanositler ve düz kas hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerine farklılık gösterilebilir. Çok çeşitli hücre tiplerine farklılaşma yeteneği ile, nöral kret (NC) gelişiminin herhangi bir aşamasında düzensizliğe neden olan genetik anormallikler çok sayıda doğumsal hastalığa yol açabilir2. Örneğin, NCC’lerin oluşumu, göçü ve gelişimi sırasındaki pertürbasyonlar, toplu olarak nörokristopatiler olarak bilinen gelişimsel bozukluklara yol açar1,3. Bu hastalıklar, Treacher Collins sendromu gibi NCC oluşumundaki başarısızlığa bağlı kraniyofasiyal defektlerden, melanom3,4,5,6’dagörüldüğü gibi NCC metastatik göçmen yeteneğine bağlı çeşitli kanserleringelişmesinekadar uzanır. Son birkaç on yılda, araştırmacılar NCC’lerin gelişim ve hastalıklardaki rolleri ve mekanizmaları hakkında dikkat çekici keşifler yaptılar, bulguların çoğu kimyasal sinyallere odaklandı7,8. Daha yakın zamanda, mekanik sinyallerin NCC gelişiminde kritik ama iyi anlaşılmamış bir rol oynadığı belirtilmiştir9,10.
NCC’lerin çevresel ipuçları, NCC farklılaşmanın çeşitli hücre türlerine düzenlenmesi de dahil olmak üzere gelişimleri sırasında kritik bir rol oynar. Çevresel ipuçları, örneğin, fiziksel ipuçları, işlevsel çeşitlendirme gibi önemli davranışları ve hücresel yanıtları etkiler. Mechanotransduction, hücrelerin çeşitli biyolojik süreçleri sürdürmek için bu ipuçlarını hissetmelerini ve yanıt vermelerini sağlar2. NCC’ler komşu hücreler ve hücre dışı matris (ECM) gibi farklı substratlarla çevrilidir, bu da homeostazı korumak ve kader belirleme, çoğalma ve kesmez yoluyla değişikliklere uyum sağlamak için mekanik uyaranlara yol açabilir11. Mechanotransduction, mekanik hücre dışı uyaranların duyusal bileşeninin meydana geldiği plazma zarında başlar ve hücre içi düzenleme ile sonuçlanır12. Plazma zarının bütünleşimleri, odak yapışmaları ve kavşakları, kesme kuvvetleri, stres ve çevredeki substratların sertliği gibi mekanik sinyalleri hücresel yanıtlar üretmek için kimyasal sinyallere röle eder12. Plazma membranından gelen kimyasal sinyallerin son hücresel düzenlemeye aktarılması, organizma için farklılaşma gibi hayati süreçleri sonuçlandırmak için farklı sinyal yolları aracılığıyla gerçekleştirilir.
Çeşitli çalışmalar, substrat sertliğinden mekanik sinyal vermenin hücre farklılaşmasında rol oynadığını ileri sürtünmektedir13,14. Örneğin, önceki çalışmalar, beyin dokusununkine benzer bir sertliğe sahip yumuşak substratlarda yetişen mezenkimal kök hücrelerin (MSC’ler) nöronal hücre farklılaşmasına neden olduğunu göstermiştir15,16. Bununla birlikte, daha fazla MSC, kas sertliğini taklit eden 8-17 kPa substratlarında büyüdüğünde miyosit benzeri hücrelere farklılık sağlarken, MSC’ler sert substratlar üzerinde kültürlendiğinde osteoblast benzeri farklılaşma gözlenmiştir (25-40 kPa)15,16. Mekanotransdüksiyonun önemi, kanser, kardiyovasküler hastalıklar ve osteoporoz17 , 18,19dahil olmak üzere ciddi gelişimsel kusurlara ve hastalıklara yol açabilecek mekanik sinyal yollarındaki düzensizlikler ve anormallikler ile vurgulanır. Kanserlerde normal meme dokusu yumuşaktır ve meme kanseri riski artar Sert ve yoğun meme dokusunda, meme tümörlerine daha çok benzeyen bir ortam15. Bu bilgi birikimi ile, mekanik sinyalizasyonun NCC gelişimi üzerindeki etkileri, bir in vitro sistem aracılığıyla substrat sertliğinin basit manipülasyonu ile incelenebilir ve NC ile ilgili hastalığın ilerlemesinin ve etiyolojisinin temellerini anlamada daha fazla avantaj ve olasılık sağlar.
NCC’lerdeki mekanik sinyallerin etkisini incelemek için, daha önce yayınlanan yöntemlerin optimizasyonuna ve NCC’lerin farklı mekanik sinyallere verdiği yanıtların değerlendirilmesine dayanan NCC’ler için verimli bir in vitro sistem kurduk20,21. NCC’lerde mekanik sinyalizasyonun etkisinin farklı hidrojel sertliği hazırlanması ve değerlendirilmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bunu başarmak için, O9-1 NCC’ler sert ve yumuşak hidrojellere yanıt olarak etkileri ve değişiklikleri incelemek için NC modeli olarak kullanılır. O9-1 NCC’ler, 8.5. günde fare embriyosundan (E) izole edilmiş kararlı bir NC hücre hattıdır. O9-1 NCC’ler, tanımlanmış farklılaşma ortamı22’deçeşitli NC türevli hücre türlerine farklılaşabildiğinden, NCC’leri in vivo olarak taklit eder. NCC’lerin mekanik sinyallerini incelemek için, istenen sertliği elde etmek için çeşitli akrilamid ve bis-akrilamid çözelti konsantrasyonlarından ayarlanabilir elastikiyetli bir matris substratı imal edildi, biyolojik substrat sertliği20 , 21,23ile ilişkili. NCC’ler, özellikle O9-1 hücreleri için matris substrat koşullarını optimize etmek için, daha önce yayınlanan protokol20’dendeğişiklikler yapıldı. Bu protokolde yapılan bir değişiklik, kollajen I’deki hidrojelleri kuluçkaya yatırmaktı, bir gecede 50 mM HEPES yerine% 0.2 asetik asitle seyreltildi. Asetik asidin düşük pH’ı homojen bir dağılıma ve daha yüksek kollajen I bünyesine yol açar, böylece ECM proteininin daha düzgün bir şekilde bağlanmasına izin verir24. Ek olarak, hidrojelleri inkübatörde depolamadan önce, fosfat tampon salininde (PBS) sırasıyla% 10 ve% 5 konsantrasyonlarında at serumu ve fetal sığır serumu (FBS) kombinasyonu kullanılmıştır. At serumu, % 1025konsantrasyonda hücre çoğalmasını ve farklılaşmayı teşvik etme yeteneği nedeniyle FBS’ye ek bir takviye olarak kullanılmıştır.
Bu yöntemle, NCC’lerin büyümesi ve hayatta kalması için doğru bir in vitro ortam oluşturmak için ECM protein kaplaması (örneğin, Kollajen I) tarafından biyolojik bir ortam taklit edildi20,21. Hazırlanan hidrojellerin sertliği, elastik modül26’yıtasvir etmek için iyi bilinen bir teknik olan atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile nicel olarak analiz edildi. Farklı sertlik seviyelerinin NCC’ler üzerindeki etkisini incelemek için, vahşi tip O9-1 hücreleri, substrat sertliğindeki değişikliklere yanıt olarak hücre yapışması ve morfolojilerindeki farklılıkları göstermek için filamentli aktilona (F-actin) karşı immünofluoresans (IF) lekelenmesi için hidrojeller üzerinde kültürlendi ve hazırlandı. Bu in vitro sistemi kullanan araştırmacılar, NCC’lerdeki mekanik sinyallemenin rollerini ve diğer kimyasal sinyallerle etkileşimini inceleyerek NCC’ler ve mekanik sinyaller arasındaki ilişkiyi daha derinlemesine anlayabilecekler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut çalışmanın amacı, NCC’lerdeki mekanik sinyallerin etkisini daha iyi anlamak için etkili ve verimli bir in vitro sistem sağlamaktır. Yukarıda belirtilen adım adım protokolü takip ederek, araştırmacıların O9-1 NCC’lerin hücre kültürünün hidrojel hazırlamak için kullanılan cam kapakların türünden etkilendiğini akılda tutmaları gerekir. Örneğin, belirli bir cam kapak kapağı türüne tohumlanmış hücrelerin (Bkz. Malzeme Tablosu)hayatta kaldığı ve iyi ço…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Teksas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Atomik Kuvvet Mikroskop-UT Çekirdek tesisinin işletmecisi Dr. Ana-Maria Zaske’ye bu projede AFM’ye katkı sağlayan uzmanlığı için teşekkür ederiz. Ayrıca Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 ve R01HL142704’ten J. Wang’a) finansman kaynaklarına teşekkür ederiz.
Materials
| 12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
| 2% Bis-Acrylamide | Sigma Aldrich | M1533 | |
| 24-well plate | Greiner Bio-one | 662165 | |
| 25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
| 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
| 4-well cell culture plate | Thermo Scientific | 179830 | |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
| 40% Acrylamide | Sigma Aldrich | A4058 | |
| 50% glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G7651 | |
| 6-well cell culture plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| AFM cantilever (spherical bead) | Novascan | ||
| AFM software | Catalyst NanoScope | Model: 8.15 SR3R1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | Powder |
| anti-AP-2α Antibody | Santa Cruz | sc-12726 | |
| anti-Vinculin antibody | Abcam | ab129002 | |
| Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
| Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dichloromethylsilane (DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fluorescence microscope | Leica | Model DMi8 | |
| Fluoromount-G mounting medium | SouthernBiotech | 0100-35 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Powder |
| Horse serum | Corning | 35-030-CI | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
| Penicillin-Streptomycin antibiotic | Thermo Fisher | 15140148 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| Sterile 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
| Sterile deionized water | Hardy Diagnostics | U284 | |
| sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
| SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
References
- Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
- Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
- Watt, K. E. N., Trainor, P. A., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. , 361-394 (2014).
- Lavelle, C. L. B. . Applied oral physiology. , (1988).
- Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
- Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
- Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
- Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
- Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
- Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
- Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
- Lu, Y. -. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
- Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335 (2007).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
- Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , (2010).
- Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089 (2010).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
- Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108 (2019).
- Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
- Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young’s modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
- Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
- Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
- Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
- Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257 (2018).
- Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
- Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
- Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
- Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze’ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
- Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
- Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
- Kuo, J. -. C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346 (2018).
- Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
- Lin, Y. -. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review E. 82 (4), 041918 (2010).
- Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
- Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
- McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
- Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15 (2015).
- Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
- Gavara, N. A beginner’s guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
- Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , 363-373 (2017).
