نظام O9-1/Hydrogel محسن لدراسة الإشارات الميكانيكية في خلايا كريست العصبية
Summary
يتم وصف بروتوكولات مفصلة خطوة بخطوة هنا لدراسة الإشارات الميكانيكية في المختبر باستخدام خلايا القمم العصبية O9-1 متعددة القدرات وهيدروجيلات البولي أكريلاميد ذات صلابة متفاوتة.
Abstract
خلايا القمة العصبية (NCCs) هي خلايا متعددة القدرات الجنينية الفقارية التي يمكن أن تهاجر وتفرق إلى مجموعة واسعة من أنواع الخلايا التي تؤدي إلى مختلف الأعضاء والأنسجة. تصلب الأنسجة تنتج القوة الميكانيكية, جديلة المادية التي تلعب دورا حاسما في التمايز NCC; ومع ذلك، لا تزال الآلية غير واضحة. توفر الطريقة الموصوفة هنا معلومات مفصلة للجيل الأمثل من الهيدروجيلات البولي أكريلاميد ذات صلابة متفاوتة ، والقياس الدقيق لمثل هذه التصلب ، وتقييم تأثير الإشارات الميكانيكية في خلايا O9-1 ، وهو خط NCC يحاكي في أجهزة NCCs الحية.
تم قياس تصلب الهيدروجيل باستخدام المجهر القوة الذرية (AFM) وأشار إلى مستويات صلابة مختلفة وفقا لذلك. وأظهرت مركبات الكربون الهيدروفلورية من نوع O9-1 المستزرعة على الهيدروجيلات ذات التصلب المتفاوت مورفولوجيا الخلايا المختلفة والتعبير الجيني عن ألياف الإجهاد، مما يشير إلى آثار بيولوجية متفاوتة ناجمة عن تغيرات الإشارة الميكانيكية. وعلاوة على ذلك، أثبت هذا أن تغيير صلابة الهيدروجيل أدى إلى نظام فعال في المختبر للتلاعب بالإشارة الميكانيكية عن طريق تغيير صلابة الجل وتحليل التنظيم الجزيئي والجيني في NCCs. O9-1 NCCs يمكن أن تفرق إلى مجموعة واسعة من أنواع الخلايا تحت تأثير وسائل الإعلام التمايز المقابلة، وأنه من المناسب للتلاعب الإشارات الكيميائية في المختبر. لذلك ، فإن هذا النظام في المختبر هو أداة قوية لدراسة دور الإشارات الميكانيكية في NCCs وتفاعلها مع الإشارات الكيميائية ، مما سيساعد الباحثين على فهم أفضل للآليات الجزيئية والجينية لتطوير القمة العصبية والأمراض.
Introduction
خلايا القمة العصبية (NCCs) هي مجموعة من الخلايا الجذعية أثناء تكوين الأجنة الفقارية مع قدرة ملحوظة على الهجرة والمساهمة في تطوير مختلف الأعضاء والأنسجة. يمكن أن تفرق NCCs إلى أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا العصبية الحسية والغضاريف والعظام والخلايا الصباغية وخلايا العضلات الملساء ، اعتمادا على موقع المنشأ المحوري والتوجيه البيئي المحلي ل NCC1،2. مع القدرة على التفريق إلى مجموعة واسعة من أنواع الخلايا، يمكن أن تؤدي التشوهات الوراثية التي تسبب خلل التنظيم في أي مرحلة من مراحل التنمية العصبية (NC) إلى العديد من الأمراض الخلقية2. على سبيل المثال، تؤدي الاضطرابات أثناء تكوين الأمراض غير السارية وهجرتها وتطورها إلى اضطرابات تنموية تعرف مجتمعة باسم اعتلالات الأعصاب1و3. تتراوح هذه الأمراض من العيوب القحفية بسبب الفشل في تكوين NCC ، مثل متلازمة Treacher Collins ، إلى تطور أنواع السرطان المختلفة بسبب قدرة NCC على الهجرة النقيلية ، كما رأينا في سرطان الجلد3و4و5و6. على مدى العقود القليلة الماضية، حقق الباحثون اكتشافات ملحوظة حول أدوار وآليات NCCs في التنمية والأمراض، مع تركيز غالبية النتائج على الإشارات الكيميائية7،8. في الآونة الأخيرة، وقد أشير إشارات الميكانيكية للعب دور حاسم ولكن غير مفهومة بشكل جيد في تطوير NCC9،10.
وتلعب الإشارات البيئية للبلدان غير الوطنية دورا حاسما أثناء تطورها، بما في ذلك تنظيم تمايز الخلايا غير المكلورة عبر المحيطات إلى أنواع مختلفة من الخلايا. تؤثر الإشارات البيئية، مثل الإشارات المادية، على السلوكيات المحورية والاستجابات الخلوية، مثل التنويع الوظيفي. Mechanotransduction يسمح للخلايا لاستشعار والاستجابة لتلك الإشارات للحفاظ على العمليات البيولوجية المختلفة2. تحيط NCCs بالخلايا المجاورة والركائز المختلفة ، مثل المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، والتي يمكن أن تؤدي إلى محفزات ميكانيكية للحفاظ على التوازن والتكيف مع التغييرات من خلال تحديد المصير والانتشار وموت الخلايا المبرمج11. يبدأ التحويث الميكانيكي في غشاء البلازما حيث يحدث المكون الحسي للمحفزات الميكانيكية خارج الخلية ، مما يؤدي إلى التنظيم داخل الخلية12. Integrins، الالتصاقات البؤرية، وتقاطعات غشاء البلازما تتابع الإشارات الميكانيكية، مثل قوى القص، والإجهاد، وتصلب الركائز المحيطة بها، إلى إشارات كيميائية لإنتاج الاستجابات الخلوية12. يتم نقل الإشارات الكيميائية من غشاء البلازما إلى التنظيم الخلوي النهائي عبر مسارات إشارات مختلفة لوضع اللمسات الأخيرة على العمليات الحيوية للكائن الحي ، مثل التمايز.
وقد اقترحت العديد من الدراسات أن الإشارات الميكانيكية من صلابة الركيزة يلعب دورا في تمايز الخلية13،14. على سبيل المثال، أظهرت الدراسات السابقة أن الخلايا الجذعية المتوسطة (MSCs) نمت على ركائز لينة مع تصلب مماثلة لتلك التي من أنسجة الدماغ (في نطاق 0.1-1.0 كيلو باسكال) أدى إلى تمايز الخلايا العصبية15،16. ومع ذلك، أكثر MSCs تفرق في الخلايا الشبيهة بالخلايا العضلية عندما نمت على ركائز 8-17 كيلو باسكال تحاكي تصلب العضلات، في حين لوحظ التمايز مثل العظام عندما تم استزراع MSCs على ركائز قاسية (25-40 كيلو باسكال)15،16. وتبرز أهمية الميكانوترانسدوكشن من خلال المخالفات والتشوهات في مسار الإشارات الميكانيكية التي يحتمل أن تؤدي إلى عيوب وأمراض النمو الحادة، بما في ذلك السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية وهشاشة العظام17و18و19. في السرطانات ، يكون نسيج الثدي الطبيعي ناعما ، ويزيد خطر الإصابة بسرطان الثدي في أنسجة الثدي الصلبة والكثيفة ، وهي بيئة أقرب إلى أورام الثدي15. مع هذه المعرفة ، يمكن دراسة آثار الإشارات الميكانيكية على تطوير NCC من خلال التلاعب البسيط بصلابة الركيزة من خلال نظام في المختبر ، مما يوفر المزيد من المزايا والإمكانيات في فهم أساسيات تطور الأمراض المرتبطة بال NC والمسببات.
لدراسة تأثير الإشارات الميكانيكية في المركبات غير السارية، أنشأنا نظاما فعالا في المختبر للمركبات غير السارية على أساس تحسين الأساليب المنشورة سابقا وتقييم استجابات ال NCCs للإشارات الميكانيكية المختلفة20و21. 10- وقدم بروتوكول مفصل لإعداد وتقييم تيبس الهيدروجيل متفاوتة لتأثير الإشارات الميكانيكية في البلدان غير الوطنية. ولتحقيق ذلك، تستخدم مركبات الكربون الهيدروفلورية من طراز O9-1 كنموذج NC لدراسة الآثار والتغيرات استجابة للهيدروجلز الصلبة مقابل الهيدروجيلات اللينة. O9-1 NCCs هي خط خلايا NC مستقر معزول عن جنين الفأر (E) في اليوم 8.5. O9-1 NCCs تحاكي NCCs في الجسم الحي لأنها يمكن أن تفرق إلى أنواع مختلفة من الخلايا المشتقة من NC في وسائط التمايزالمحددة 22. لدراسة الإشارات الميكانيكية للمركبات غير السارية ، تم تصنيع ركيزة مصفوفة بمرونة غير قادرة من تركيزات مختلفة من حلول الأكريلاميد والبيس أكريلاميد لتحقيق الصلابة المطلوبة ، ترتبط بصلابة الركيزة البيولوجية20،21،23. لتحسين شروط ركيزة المصفوفة ل NCCs ، وتحديدا خلايا O9-1 ، تم إجراء تعديلات من البروتوكول المنشور سابقا20. وكان أحد التغييرات التي أجريت في هذا البروتوكول لاحتضان الهيدروجيلات في الكولاجين الأول، المخفف في حمض الخليك 0.2٪ بدلا من 50 mM HEPES، في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. انخفاض درجة الحموضة من حمض الخليك يؤدي إلى توزيع متجانسة وارتفاع الكولاجين أنا التأسيس، مما يسمح لمرفق أكثر اتساقا من البروتين ECM24. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام مزيج من مصل الحصان ومصل الأبقار الجنينية (FBS) بتركيزات 10٪ و 5٪ في محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) ، على التوالي ، قبل تخزين الهيدروجيلات في الحاضنة. تم استخدام مصل الحصان كمكمل إضافي لFBS بسبب قدرته على تعزيز انتشار الخلايا والتمايز بتركيز 10٪25.
مع هذه الطريقة، تم محاكاة البيئة البيولوجية من قبل طلاء البروتين ECM (على سبيل المثال، الكولاجين I) لخلق بيئة دقيقة في المختبر لNCCs لتنمو والبقاء على قيد الحياة20،21. تم تحليل صلابة الهيدروجيلات المعدة كميا عن طريق المجهر للقوة الذرية (AFM) ، وهي تقنية معروفة لتصوير المغير المرن26. لدراسة تأثير مستويات صلابة مختلفة على NCCs، تم استزراع الخلايا البرية O9-1 وإعدادها على الهيدروجيلات للفلورية المناعية (IF) تلطيخ ضد أكتين خيوط (F-actin) لإظهار الاختلافات في الالتصاق بالخلايا ومورفولوجيس استجابة للتغيرات في صلابة الركيزة. وباستخدام هذا النظام المختبري، سيتمكن الباحثون من دراسة أدوار الإشارات الميكانيكية في المركبات غير السارية وتفاعلها مع الإشارات الكيميائية الأخرى للحصول على فهم أعمق للعلاقة بين المركبات غير السارية والإشارات الميكانيكية.
Protocol
Representative Results
Discussion
والهدف من الدراسة الحالية هو توفير نظام فعال وفعال في المختبر لفهم تأثير الإشارات الميكانيكية في المركبات غير السارية فهما أفضل. بالإضافة إلى اتباع البروتوكول خطوة بخطوة المذكورة أعلاه، يحتاج الباحثون إلى أن نضع في اعتبارنا أن ثقافة الخلية من O9-1 NCCs تتأثر بنوع من الأغطية الزجاجية ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتورة آنا ماريا زاسكي، مشغلة منشأة المجهر-UT Core التابعة للقوة الذرية في مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس، على الخبرة المساهمة في AFM في هذا المشروع. كما نشكر مصادر التمويل من المعاهد الوطنية للصحة (K01DE026561، R03DE025873، R01DE029014، R56HL142704، وR01HL142704 إلى J. Wang).
Materials
| 12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
| 2% Bis-Acrylamide | Sigma Aldrich | M1533 | |
| 24-well plate | Greiner Bio-one | 662165 | |
| 25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
| 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
| 4-well cell culture plate | Thermo Scientific | 179830 | |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
| 40% Acrylamide | Sigma Aldrich | A4058 | |
| 50% glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G7651 | |
| 6-well cell culture plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| AFM cantilever (spherical bead) | Novascan | ||
| AFM software | Catalyst NanoScope | Model: 8.15 SR3R1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | Powder |
| anti-AP-2α Antibody | Santa Cruz | sc-12726 | |
| anti-Vinculin antibody | Abcam | ab129002 | |
| Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
| Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dichloromethylsilane (DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fluorescence microscope | Leica | Model DMi8 | |
| Fluoromount-G mounting medium | SouthernBiotech | 0100-35 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Powder |
| Horse serum | Corning | 35-030-CI | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
| Penicillin-Streptomycin antibiotic | Thermo Fisher | 15140148 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| Sterile 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
| Sterile deionized water | Hardy Diagnostics | U284 | |
| sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
| SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
References
- Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
- Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
- Watt, K. E. N., Trainor, P. A., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. , 361-394 (2014).
- Lavelle, C. L. B. . Applied oral physiology. , (1988).
- Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
- Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
- Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
- Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
- Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
- Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
- Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
- Lu, Y. -. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
- Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335 (2007).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
- Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , (2010).
- Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089 (2010).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
- Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108 (2019).
- Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
- Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young’s modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
- Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
- Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
- Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
- Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257 (2018).
- Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
- Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
- Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
- Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze’ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
- Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
- Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
- Kuo, J. -. C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346 (2018).
- Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
- Lin, Y. -. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review E. 82 (4), 041918 (2010).
- Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
- Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
- McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
- Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15 (2015).
- Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
- Gavara, N. A beginner’s guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
- Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , 363-373 (2017).
