מערכת O9-1/הידרוג'ל ממוטבת לחקר אותות מכניים בתאי ציצית עצבית
Summary
פרוטוקולים מפורטים שלב אחר שלב מתוארים כאן לחקר אותות מכניים במבחנה באמצעות תאי פסגה עצביים O9-1 רב-תכליתיים והידרוגלים פוליאקרילמידים בעלי קשיחות משתנה.
Abstract
תאי ציצית עצבית (NCCs) הם תאים רב-תכליתיים עובריים בעלי חוליות שיכולים לנדוד ולהבדיל למגוון רחב של סוגי תאים המעוררים איברים ורקמות שונים. נוקשות רקמות מייצרת כוח מכני, סימן פיזי הממלא תפקיד קריטי בבידול NCC; עם זאת, המנגנון עדיין לא ברור. השיטה המתוארת כאן מספקת מידע מפורט עבור הדור הממוטב של הידרוג’לים polyacrylamide של נוקשות משתנה, מדידה מדויקת של נוקשות כזו, ואת ההערכה של ההשפעה של אותות מכניים בתאי O9-1, קו NCC המחקה ב NCCs vivo.
נוקשות הידרוג’ל נמדדה באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM) והצביעה על רמות נוקשות שונות בהתאם. O9-1 NCCs תרבית על הידרוג’לים של נוקשות משתנה הראה מורפולוגיה תאים שונים ביטוי גנים של סיבי מתח, אשר הצביעו על השפעות ביולוגיות שונות הנגרמות על ידי שינויים באותות מכניים. יתר על כן, זה קבע כי שינוי נוקשות הידרוג’ל הביא מערכת במבחנה יעילה כדי לתפעל איתות מכני על ידי שינוי נוקשות ג’ל וניתוח הרגולציה המולקולרית והגנטית ב NCCs. O9-1 NCCs יכול להבדיל למגוון רחב של סוגי תאים תחת השפעת מדיית הבידול המתאימה, וזה נוח לתפעל אותות כימיים במבחנה. לכן, מערכת במבחנה זו היא כלי רב עוצמה לחקור את התפקיד של איתות מכני ב- NCCs ואת האינטראקציה שלה עם אותות כימיים, אשר יסייע לחוקרים להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים והגנטיים של התפתחות ציצית עצבית ומחלות.
Introduction
תאי ציצית עצבית (NCCs) הם קבוצה של תאי גזע במהלך עובר חוליות עם יכולת יוצאת דופן לנדוד ולתרום להתפתחות של איברים ורקמות שונים. NCCs יכול להבדיל לסוגי תאים שונים, כולל נוירונים חושיים, סחוס, עצם, מלנוציטים ותאי שריר חלקים, בהתאם למיקום המקור האקסיאלי וההדרכה הסביבתית המקומית של NCC1,2. עם היכולת להבדיל למגוון רחב של סוגי תאים, חריגות גנטיות הגורמות לדיסרגציה בכל שלב של התפתחות פסגת עצבים (NC) יכולות להוביל למחלות מולדות רבות2. לדוגמה, הפרעות במהלך היווצרות, הגירה, ופיתוח של NCCs להוביל להפרעות התפתחותיות המכונה באופן קולקטיבי נוירוקריסטופתיות1,3. מחלות אלה נעות בין פגמים craniofacial עקב כישלון בהיווצרות NCC, כגון תסמונת Treacher קולינס, להתפתחות של סוגי סרטן שונים עקב יכולת הנדידה גרורתית NCC, כפי שניתן לראות מלנומה3,4,5,6. במהלך העשורים האחרונים, חוקרים גילו תגליות מדהימות על התפקידים והמנגנונים של NCCs בפיתוח ומחלות, כאשר רוב הממצאים התמקדו באותות כימיים7,8. לאחרונה, אותות מכניים צוינו לשחק תפקיד קריטי אך לא מובן בפיתוח NCC9,10.
הרמזים הסביבתיים של NCCs לשחק תפקיד קריטי במהלך הפיתוח שלהם, כולל הרגולציה של בידול NCC לסוגי תאים שונים. רמזים סביבתיים, למשל רמזים פיזיים, משפיעים על התנהגויות מרכזיות ותגובות תאיות, כגון גיוון תפקודי. Mechanotransduction מאפשר לתאים לחוש ולהגיב לרמזים אלה כדי לשמור על תהליכים ביולוגיים שונים2. NCCs מוקפים בתאים שכנים ומצעים שונים, כגון מטריצה חוץ תאית (ECM), אשר יכול להוליד גירויים מכניים כדי לשמור על הומאוסטזיס ולהתאים את השינויים באמצעות קביעת גורל, התפשטות, אפופטוזיס11. Mechanotransduction מתחיל בקרום הפלזמה שבו המרכיב החושי של גירויים חוץ תאיים מכני מתרחש, וכתוצאה מכך את הוויסות התאי של התא12. אינטגרינים, הידבקויות מוקד וצמתים של ממסר קרום הפלזמה אותות מכניים, כגון כוחות גיסת, מתח, ואת נוקשות של המצעים שמסביב, לתוך אותות כימיים כדי לייצר תגובות תאיות12. העברת אותות כימיים מקרום הפלזמה לוויסות התאי הסופי מתבצעת באמצעות מסלולי איתות שונים כדי לסיים תהליכים חיוניים עבור האורגניזם, כגון בידול.
מספר מחקרים הראו כי איתות מכני מנוקשות מצע ממלא תפקיד בבידול התא13,14. לדוגמה, מחקרים קודמים הראו כי תאי גזע mesenchymal (MSCs) גדל על מצעים רכים עם נוקשות דומה לזו של רקמת המוח (בטווח של 0.1-1.0 kPa) הביא בידול תאים עצביים15,16. עם זאת, יותר MSCs להבדיל לתוך תאים דמויי myocyte כאשר גדל על מצעים 8-17 kPa מחקה את נוקשות השריר, בעוד בידול דמוי osteoblast נצפתה כאשר MSCs היו תרבית על מצעים נוקשים (25-40 kPa)15,16. המשמעות של mechanotransduction מודגשת על ידי אי סדרים וחריגות במסלול איתות מכני שעלול להוביל פגמים התפתחותיים חמורים ומחלות, כולל סרטן, מחלות לב וכלי דם, אוסטאופורוזיס17,18,19. בסרטן, רקמת שד רגילה רכה, והסיכון לסרטן השד עולה ברקמת שד נוקשה וצפופה, סביבה הדומה יותר לגידולי השד15. עם ידע זה, ההשפעות של איתות מכני על פיתוח NCC ניתן ללמוד באמצעות מניפולציה פשוטה של נוקשות מצע באמצעות מערכת במבחנה, מתן יתרונות נוספים ואפשרויות בהבנת היסודות של התקדמות המחלה הקשורים NC ואטיולוגיה.
כדי לחקור את ההשפעה של אותות מכניים ב- NCCs, הקמנו מערכת במבחנה יעילה עבור NCCs המבוססת על אופטימיזציה של שיטות שפורסמו בעבר והערכה של התגובות של NCCs לאותות מכניים שונים20,21. פרוטוקול מפורט סופק להכנת נוקשות הידרוג’ל משתנה והערכה של ההשפעה של איתות מכני ב- NCCs. כדי להשיג זאת, O9-1 NCCs מנוצלים כמודל NC כדי ללמוד את ההשפעות והשינויים בתגובה הידרוג’ל נוקשה לעומת רך. O9-1 NCCs הם קו תא NC יציב מבודד מעובר העכבר (E) ביום 8.5. O9-1 NCCs מחקים NCCs ב- vivo מכיוון שהם יכולים להבדיל לסוגי תאים שונים שמקורם ב- NC במדיה מוגדרת של בידול22. כדי לחקור את האיתות המכני של NCCs, מצע מטריצה היה מפוברק עם גמישות טונה מריכוזים שונים של אקרילאמיד ופתרונות ביס-אקרילאמיד כדי להשיג את הנוקשות הרצויה, בקורלציה נוקשות המצע הביולוגי20,21,23. כדי למטב את התנאים של מצע מטריצה עבור NCCs, במיוחד תאי O9-1, שינויים נעשו מפרוטוקול20שפורסם בעבר . שינוי אחד שנעשה בפרוטוקול זה היה לדגור על הידרוג’לים בקולגן I, מדולל ב 0.2% חומצה אצטית במקום 50 mM HEPES, ב 37 °C (57 °F) לילה. ה- pH הנמוך של חומצה אצטית מוביל להפצה הומוגנית ושילוב קולגן I גבוה יותר, ובכך מאפשר התקשרות אחידה יותר של חלבון ECM24. בנוסף, שילוב של סרום סוס סרום בקר עוברי (FBS) שימש בריכוזים של 10% ו 5% מלוחים חוצץ פוספט (PBS), בהתאמה, לפני אחסון הידרוג’ל באינקובטור. סרום סוס שימש כתוספת נוספת FBS בשל יכולתו לקדם התפשטות תאים ובידול בריכוז של 10%25.
בשיטה זו, סביבה ביולוגית חיקה על ידי ציפוי חלבון ECM (למשל, קולגן I) כדי ליצור סביבת במבחנה מדויקת עבור NCCs לגדול ולשרוד20,21. נוקשות ההידרוגלים המוכנים נותחה כמותית באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM), טכניקה ידועה לתיאור המודולוס האלסטי26. כדי לחקור את ההשפעה של רמות נוקשות שונות על NCCs, תאי O9-1 מסוג בר היו בתרבית והוכנו על הידרוג’לים עבור immunofluorescence (IF) מכתים נגד actin filamentous (F-actin) כדי להראות את ההבדלים הידבקות תאים ומורפולוגיות בתגובה לשינויים נוקשות מצע. תוך שימוש במערכת במבחנה זו, החוקרים יוכלו לחקור את התפקידים של איתות מכני ב- NCCs ואת האינטראקציה שלה עם אותות כימיים אחרים כדי לקבל הבנה עמוקה יותר של היחסים בין NCCs ואיתות מכני.
Protocol
Representative Results
Discussion
מטרת המחקר הנוכחי היא לספק מערכת במבחנה יעילה ויעילה כדי להבין טוב יותר את ההשפעה של אותות מכניים ב- NCCs. בנוסף בעקבות הפרוטוקול צעד אחר צעד שהוזכר לעיל, החוקרים צריכים לזכור כי התרבות התאית של O9-1 NCCs מושפעת מסוג כיסויי זכוכית המשמשים להכנת הידרוג’ל. לדוגמה, צוין כי תאים שנזרעו על סוג מסו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר אנה-מריה זסקה, מפעילת מתקן הליבה של הכוח האטומי מיקרוסקופ-UT במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס, על המומחיות שנתרמה ב- AFM בפרויקט זה. אנו מודים גם למקורות המימון של המכונים הלאומיים לבריאות (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 ו- R01HL142704 לג’יי וואנג).
Materials
| 12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
| 2% Bis-Acrylamide | Sigma Aldrich | M1533 | |
| 24-well plate | Greiner Bio-one | 662165 | |
| 25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
| 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
| 4-well cell culture plate | Thermo Scientific | 179830 | |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
| 40% Acrylamide | Sigma Aldrich | A4058 | |
| 50% glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G7651 | |
| 6-well cell culture plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| AFM cantilever (spherical bead) | Novascan | ||
| AFM software | Catalyst NanoScope | Model: 8.15 SR3R1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | Powder |
| anti-AP-2α Antibody | Santa Cruz | sc-12726 | |
| anti-Vinculin antibody | Abcam | ab129002 | |
| Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
| Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dichloromethylsilane (DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fluorescence microscope | Leica | Model DMi8 | |
| Fluoromount-G mounting medium | SouthernBiotech | 0100-35 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Powder |
| Horse serum | Corning | 35-030-CI | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
| Penicillin-Streptomycin antibiotic | Thermo Fisher | 15140148 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| Sterile 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
| Sterile deionized water | Hardy Diagnostics | U284 | |
| sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
| SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
References
- Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
- Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
- Watt, K. E. N., Trainor, P. A., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. , 361-394 (2014).
- Lavelle, C. L. B. . Applied oral physiology. , (1988).
- Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
- Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
- Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
- Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
- Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
- Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
- Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
- Lu, Y. -. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
- Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335 (2007).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
- Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , (2010).
- Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089 (2010).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
- Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108 (2019).
- Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
- Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young’s modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
- Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
- Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
- Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
- Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257 (2018).
- Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
- Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
- Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
- Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze’ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
- Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
- Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
- Kuo, J. -. C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346 (2018).
- Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
- Lin, Y. -. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review E. 82 (4), 041918 (2010).
- Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
- Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
- McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
- Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15 (2015).
- Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
- Gavara, N. A beginner’s guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
- Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , 363-373 (2017).
