Protocolos passo a passo detalhados são descritos aqui para o estudo de sinais mecânicos in vitro usando células de crista neural O9-1 multipotentes e hidrânis de poliacrilamida de rigidez variada.
As células de crista neural (NCCs) são células multipotentes embrionárias vertebrada que podem migrar e se diferenciar em uma ampla gama de tipos celulares que dão origem a vários órgãos e tecidos. A rigidez tecidual produz força mecânica, uma sugestão física que desempenha um papel crítico na diferenciação do NCC; no entanto, o mecanismo permanece incerto. O método descrito aqui fornece informações detalhadas para a geração otimizada de hidrânis de poliacrilamida de rigidez variada, a medição precisa de tal rigidez e a avaliação do impacto dos sinais mecânicos em células O9-1, uma linha NCC que imita NCCs in vivo.
A rigidez do hidrogel foi medida por meio da microscopia de força atômica (AFM) e indicou diferentes níveis de rigidez em conformidade. Os NCCs O9-1 cultivados em hidrogéis de rigidez variada mostraram diferentes morfologia celular e expressão genética de fibras de estresse, o que indicou efeitos biológicos variados causados por alterações mecânicas de sinal. Além disso, isso estabeleceu que a variação da rigidez do hidrogel resultou em um sistema in vitro eficiente para manipular a sinalização mecânica alterando a rigidez do gel e analisando a regulação molecular e genética em NCCs. Os NCCs O9-1 podem se diferenciar em uma ampla gama de tipos celulares sob a influência dos meios de diferenciação correspondentes, e é conveniente manipular sinais químicos in vitro. Portanto, este sistema in vitro é uma poderosa ferramenta para estudar o papel da sinalização mecânica em NCCs e sua interação com sinais químicos, o que ajudará os pesquisadores a entender melhor os mecanismos moleculares e genéticos do desenvolvimento de crista neural e doenças.
As células de crista neural (NCCs) são um grupo de células-tronco durante a embriogênese vertebrada com uma notável capacidade de migrar e contribuir para o desenvolvimento de vários órgãos e tecidos. Os NCCs podem se diferenciar em diferentes tipos celulares, incluindo neurônios sensoriais, cartilagem, osso, melanócitos e células musculares lisas, dependendo da localização de origem axial e da orientação ambiental local da NCC1,2. Com a capacidade de se diferenciar em uma ampla gama de tipos celulares, anormalidades genéticas que causam a desregulação em qualquer estágio do desenvolvimento da crista neural (NC) podem levar a inúmeras doenças congênitas2. Por exemplo, perturbações durante a formação, migração e desenvolvimento de DCNT levam a distúrbios do desenvolvimento conhecidos coletivamente como neurocristopatias1,3. Essas doenças vão desde defeitos craniofaciais devido à falha na formação do CCN, como a síndrome de Treacher Collins, até o desenvolvimento de vários cânceres devido à capacidade migratória metastática do CCN, como visto no melanoma3,4,5,6. Ao longo das últimas décadas, pesquisadores fizeram descobertas notáveis sobre os papéis e mecanismos das DCNT no desenvolvimento e nas doenças, com a maioria dos achados sendo focados em sinais químicos7,8. Mais recentemente, os sinais mecânicos foram indicados para desempenhar um papel crítico, mas mal compreendido no desenvolvimento do NCC9,10.
As sugestões ambientais das DCNT desempenham um papel crítico durante o seu desenvolvimento, incluindo a regulação da diferenciação do NCC em vários tipos de células. As sugestões ambientais, por exemplo, as pistas físicas, influenciam comportamentos fundamentais e respostas celulares, como a diversificação funcional. A mecanotransdução permite que as células osenceram e respondam a essas pistas para manter vários processos biológicos2. As NCCs são cercadas por células vizinhas e substratos diferentes, como a matriz extracelular (ECM), que pode dar origem a estímulos mecânicos para manter a homeostase e se adaptar às mudanças através da determinação do destino, proliferação e apoptose11. A mecanotransdução começa na membrana plasmática onde ocorre o componente sensorial dos estímulos extracelulares mecânicos, resultando na regulação intracelular da célula12. Integrinos, aderências focais e junções da membrana plasmática retransmitem sinais mecânicos, como forças de corte, estresse e rigidez de substratos circundantes, em sinais químicos para produzir respostas celulares12. O retransmissamento de sinais químicos da membrana plasmática para a regulação celular final é realizado através de diferentes vias de sinalização para finalizar processos vitais para o organismo, como a diferenciação.
Vários estudos sugerem que a sinalização mecânica da rigidez do substrato desempenha um papel na diferenciação celular13,14. Por exemplo, estudos anteriores mostraram que as células-tronco mesenquimais (MSCs) cultivadas em substratos macios com rigidez semelhante à do tecido cerebral (na faixa de 0,1-1,0 kPa) resultaram na diferenciação celular neuronal15,16. No entanto, mais MSCs se diferenciam em células semelhantes a miócitos quando cultivados em substratos de 8-17 kPa imitando a rigidez do músculo, enquanto a diferenciação semelhante ao osteoblasto foi observada quando os MSCs foram cultivados em substratos rígidos (25-40 kPa)15,16. A significância da mecanotransdução é destacada pelas irregularidades e anormalidades na via de sinalização mecânica que potencialmente levam a graves defeitos e doenças do desenvolvimento, incluindo câncer, doenças cardiovasculares e osteoporose17,18,19. Nos cânceres, o tecido mamário normal é macio, e o risco de câncer de mama aumenta em tecido mamário rígido e denso, um ambiente mais parecido com os tumores mamários15. Com esse conhecimento, os efeitos da sinalização mecânica no desenvolvimento do NCC podem ser estudados através da simples manipulação da rigidez do substrato através de um sistema in vitro, proporcionando mais vantagens e possibilidades na compreensão dos fundamentos da progressão e etiologia da doença relacionada à NC.
Para estudar o impacto dos sinais mecânicos nas NCCs, estabelecemos um sistema in vitro eficiente para NCCs com base na otimização de métodos publicados anteriormente e na avaliação das respostas das NCCs a diferentes sinais mecânicos20,21. Foi fornecido um protocolo detalhado para a preparação e avaliação da rigidez do hidrogel variado e a avaliação do impacto da sinalização mecânica em NCCs. Para isso, os NCCs O9-1 são utilizados como modelo nc para estudar os efeitos e mudanças em resposta a hidrogéis rígidos versus macios. Os NCCs O9-1 são uma linha de células NC estável isolada do embrião do rato (E) no dia 8.5. Os NCCs O9-1 imitam NCCs in vivo porque podem se diferenciar em vários tipos de células derivadas do NC em mídia de diferenciação definida22. Para estudar a sinalização mecânica das NCCs, foi fabricado um substrato matricial com elasticidade tunable a partir de diferentes concentrações de acrilamida e soluções de biscrilamida para alcançar a rigidez desejada, correlacionando-se com a rigidez biológica do substrato20,21,23. Para otimizar as condições do substrato matricial para NCCs, especificamente células O9-1, foram feitas modificações a partir do protocolo20publicado anteriormente. Uma mudança feita neste protocolo foi a incubação de hidrogéis em colágeno I, diluídos em ácido acético de 0,2% em vez de 50 mM HEPES, a 37 °C durante a noite. O baixo pH do ácido acético leva a uma distribuição homogênea e maior incorporação de colágeno I, permitindo assim um apego mais uniforme da proteína ECM24. Além disso, foi utilizada uma combinação de soro de cavalo e soro bovino fetal (FBS) nas concentrações de 10% e 5% em soro tampão de fosfato (PBS), respectivamente, antes de armazenar os hidrogéis na incubadora. O soro de cavalo foi utilizado como suplemento adicional à FBS devido à sua capacidade de promover a proliferação celular e a diferenciação na concentração de 10%25.
Com este método, um ambiente biológico foi imitado pelo revestimento proteico ECM (por exemplo, Colágeno I) para criar um ambiente in vitro preciso para que os NCCs cresçam e sobrevivama 20,21. A rigidez dos hidrogéis preparados foi analisada quantitativamente via microscopia de força atômica (AFM), uma técnica bem conhecida para retratar o módulo elástico26. Para estudar o efeito de diferentes níveis de rigidez em NCCs, as células do tipo selvagem O9-1 foram cultivadas e preparadas em hidrogéis para a coloração de imunofluorescência (IF) contra a actina filamentosa (F-actin) para mostrar as diferenças na adesão celular e morfologias em resposta às mudanças na rigidez substrato. Utilizando esse sistema in vitro, os pesquisadores poderão estudar os papéis da sinalização mecânica em NCCs e sua interação com outros sinais químicos para obter uma compreensão mais profunda da relação entre NCCs e sinalização mecânica.
O objetivo do presente estudo é fornecer um sistema in vitro eficaz e eficiente para entender melhor o impacto dos sinais mecânicos nos NCCs. Além de seguir o protocolo passo-a-passo mencionado acima, os pesquisadores precisam ter em mente que a cultura celular dos NCCs O9-1 é afetada pelo tipo de tampas de vidro usadas para preparar hidrogéis. Por exemplo, observou-se que as células semeadas em um tipo específico de mancha de vidro (ver a Tabela dos Materiais) sobreviveram e proliferaram…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos à Dra. Ana-Maria Zaske, operadora da instalação Atomic Force Microscópio-UT Core no Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas, pela expertise em AFM neste projeto. Agradecemos também às fontes de financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 e R01HL142704 a J. Wang).
12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
2% Bis-Acrylamide | Sigma Aldrich | M1533 | |
24-well plate | Greiner Bio-one | 662165 | |
25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
4-well cell culture plate | Thermo Scientific | 179830 | |
4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
40% Acrylamide | Sigma Aldrich | A4058 | |
50% glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G7651 | |
6-well cell culture plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
AFM cantilever (spherical bead) | Novascan | ||
AFM software | Catalyst NanoScope | Model: 8.15 SR3R1 | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | Powder |
anti-AP-2α Antibody | Santa Cruz | sc-12726 | |
anti-Vinculin antibody | Abcam | ab129002 | |
Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
Dichloromethylsilane (DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
Fluorescence microscope | Leica | Model DMi8 | |
Fluoromount-G mounting medium | SouthernBiotech | 0100-35 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Powder |
Horse serum | Corning | 35-030-CI | |
iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
Penicillin-Streptomycin antibiotic | Thermo Fisher | 15140148 | |
RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
Sterile 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
Sterile deionized water | Hardy Diagnostics | U284 | |
sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |