Summary

Un sistema O9-1/Hydrogel ottimizzato per lo studio dei segnali meccanici nelle cellule della cresta neurale

Published: August 13, 2021
doi:

Summary

Protocolli dettagliati passo-passo sono descritti qui per studiare i segnali meccanici in vitro utilizzando cellule multipotenti della cresta neurale O9-1 e idrogel di poliacrilammide di varia rigidità.

Abstract

Le cellule della cresta neurale (NCC) sono cellule multipotenti embrionali vertebrate che possono migrare e differenziarsi in una vasta gamma di tipi di cellule che danno origine a vari organi e tessuti. La rigidità dei tessuti produce forza meccanica, un segnale fisico che svolge un ruolo fondamentale nella differenziazione NCC; tuttavia, il meccanismo rimane poco chiaro. Il metodo qui descritto fornisce informazioni dettagliate per la generazione ottimizzata di idrogel di poliacrilammide di varia rigidità, la misurazione accurata di tale rigidità e la valutazione dell’impatto dei segnali meccanici nelle celle O9-1, una linea NCC che imita gli NCC in vivo.

La rigidità dell’idrogel è stata misurata utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM) e ha indicato diversi livelli di rigidità di conseguenza. Gli NCC O9-1 coltivati su idrogel di varia rigidità hanno mostrato una diversa morfologia cellulare e l’espressione genica delle fibre da stress, che indicavano diversi effetti biologici causati da cambiamenti meccanici del segnale. Inoltre, questo ha stabilito che la variazione della rigidità dell’idrogel ha portato a un efficiente sistema in vitro per manipolare la segnalazione meccanica alterando la rigidità del gel e analizzando la regolazione molecolare e genetica negli NCC. Gli NCC O9-1 possono differenziarsi in una vasta gamma di tipi di cellule sotto l’influenza dei corrispondenti mezzi di differenziazione ed è conveniente manipolare i segnali chimici in vitro. Pertanto, questo sistema in vitro è un potente strumento per studiare il ruolo della segnalazione meccanica nelle NCC e la sua interazione con i segnali chimici, che aiuterà i ricercatori a comprendere meglio i meccanismi molecolari e genetici dello sviluppo e delle malattie della cresta neurale.

Introduction

Le cellule della cresta neurale (NCC) sono un gruppo di cellule staminali durante l’embriogenesi dei vertebrati con una notevole capacità di migrare e contribuire allo sviluppo di vari organi e tessuti. Le NCC possono differenziarsi in diversi tipi di cellule, tra cui neuroni sensoriali, cartilagine, ossa, melanociti e cellule muscolari lisce, a seconda della posizione di origine assiale e della guida ambientale locale dell’NCC1,2. Con la capacità di differenziarsi in una vasta gamma di tipi di cellule, le anomalie genetiche che causano la disregolazione in qualsiasi fase dello sviluppo della cresta neurale (NC) possono portare a numerose malattie congenite2. Ad esempio, le perturbazioni durante la formazione, la migrazione e lo sviluppo di NCC portano a disturbi dello sviluppo noti collettivamente come neurocristopatie1,3. Queste malattie vanno dai difetti craniofacciali dovuti al fallimento nella formazione di NCC, come la sindrome di Treacher Collins, allo sviluppo di vari tumori dovuti alla capacità migratoria metastatica dell’NCC, come si vede nel melanoma3,4,5,6. Negli ultimi decenni, i ricercatori hanno fatto notevoli scoperte sui ruoli e i meccanismi delle NCC nello sviluppo e nelle malattie, con la maggior parte dei risultati focalizzati sui segnalichimici 7,8. Più recentemente, i segnali meccanici sono stati indicati per svolgere un ruolo critico ma poco compreso nello sviluppo NCC9,10.

I segnali ambientali degli NCC svolgono un ruolo fondamentale durante il loro sviluppo, compresa la regolazione della differenziazione NCC in vari tipi di cellule. I segnali ambientali, ad esempio i segnali fisici, influenzano i comportamenti cardine e le risposte cellulari, come la diversificazione funzionale. La meccanotrasduzione consente alle cellule di percepire e rispondere a tali segnali per mantenere vari processi biologici2. Gli NCC sono circondati da cellule vicine e diversi substrati, come la matrice extracellulare (ECM), che può dare origine a stimoli meccanici per mantenere l’omeostasi e adattarsi ai cambiamenti attraverso la determinazione del destino, la proliferazione e l’apoptosi11. La meccanotrasduzione inizia alla membrana plasmatica dove si verifica la componente sensoriale degli stimoli meccanici extracellulari, con conseguente regolazione intracellulare della cellula12. Integrine, aderenze focali e giunzioni della membrana plasmatica relè segnali meccanici, come forze di taglio, stress e rigidità dei substrati circostanti, in segnali chimici per produrre risposte cellulari12. La trasmissione di segnali chimici dalla membrana plasmatica alla regolazione cellulare finale viene effettuata attraverso diverse vie di segnalazione per finalizzare i processi vitali per l’organismo, come la differenziazione.

Diversi studi hanno suggerito che la segnalazione meccanica dalla rigidità del substrato gioca un ruolo nella differenziazione cellulare13,14. Ad esempio, studi precedenti hanno dimostrato che le cellule staminali mesenchimali (MSC) cresciute su substrati molli con una rigidità simile a quella del tessuto cerebrale (nell’intervallo di 0,1-1,0 kPa) hanno determinato la differenziazione delle cellule neuronali15,16. Tuttavia, più MSC si differenziano in cellule simili ai miociti quando cresciute su substrati di 8-17 kPa che imitano la rigidità del muscolo, mentre la differenziazione simile agli osteoblasti è stata osservata quando le MSC sono state coltivate su substrati rigidi (25-40 kPa)15,16. Il significato della meccanotrasduzione è evidenziato dalle irregolarità e dalle anomalie nella via di segnalazione meccanica che potenzialmente portano a gravi difetti e malattie dello sviluppo, tra cui cancro, malattie cardiovascolari e osteoporosi17,18,19. Nei tumori, il tessuto mammario normale è morbido e il rischio di cancro al seno aumenta nel tessuto mammario rigido e denso, un ambiente che è più simile ai tumori al seno15. Con queste conoscenze, gli effetti della segnalazione meccanica sullo sviluppo di NCC possono essere studiati attraverso la semplice manipolazione della rigidità del substrato attraverso un sistema in vitro, fornendo ulteriori vantaggi e possibilità nella comprensione dei fondamenti della progressione della malattia correlata alla NC e dell’eziologia.

Per studiare l’impatto dei segnali meccanici negli NCC, abbiamo istituito un efficiente sistema in vitro per NCC basato sull’ottimizzazione di metodi precedentemente pubblicati e sulla valutazione delle risposte degli NCC a diversi segnali meccanici20,21. È stato fornito un protocollo dettagliato per la preparazione della rigidità dell’idrogel variabile e la valutazione dell’impatto della segnalazione meccanica negli NCC. Per raggiungere questo obiettivo, gli NCC O9-1 vengono utilizzati come modello NC per studiare gli effetti e i cambiamenti in risposta agli idrogel rigidi rispetto a quelli morbidi. Gli NCC O9-1 sono una linea cellulare NC stabile isolata dall’embrione di topo (E) al giorno 8.5. Gli NCC O9-1 imitano gli NCC in vivo perché possono differenziarsi in vari tipi di cellule derivate da NC in mezzi di differenziazione definiti22. Per studiare la segnalazione meccanica degli NCC, è stato fabbricato un substrato a matrice con elasticità sintonizzabile da concentrazioni variabili di soluzioni di acrilammide e bis-acrilammide per ottenere la rigidità desiderata, correlata alla rigidità del substrato biologico20,21,23. Per ottimizzare le condizioni del substrato matriciale per NCC, in particolare le celle O9-1, sono state apportate modifiche dal protocollo20precedentemente pubblicato. Una modifica apportata a questo protocollo è stata quella di incubare idrogel nel collagene I, diluito in acido acetico allo 0,2% invece di 50 mM HEPES, a 37 °C durante la notte. Il basso pH dell’acido acetico porta ad una distribuzione omogenea e ad una maggiore incorporazione di collagene I, consentendo così un attaccamento più uniforme della proteina ECM24. Inoltre, una combinazione di siero equino e siero bovino fetale (FBS) è stata utilizzata alle concentrazioni del 10% e del 5% rispettivamente nella soluzione salina tampone fosfato (PBS), prima di conservare gli idrogel nell’incubatrice. Il siero di cavallo è stato utilizzato come supplemento aggiuntivo a FBS grazie alla sua capacità di promuovere la proliferazione e la differenziazione cellulare alla concentrazione del 10%25.

Con questo metodo, un ambiente biologico è stato imitato dal rivestimento proteico ECM (ad esempio, Collagen I) per creare un ambiente in vitro accurato per far crescere e sopravvivere20,21. La rigidità degli idrogel preparati è stata analizzata quantitativamente tramite microscopia a forza atomica (AFM), una tecnica ben nota per rappresentare il modulo elastico26. Per studiare l’effetto di diversi livelli di rigidità sugli NCC, le cellule O9-1 wild-type sono state coltivate e preparate su idrogel per la colorazione di immunofluorescenza (IF) contro l’actina filamentosa (F-actina) per mostrare le differenze nell’adesione cellulare e nelle morfologie in risposta ai cambiamenti nella rigidità del substrato. Utilizzando questo sistema in vitro, i ricercatori saranno in grado di studiare i ruoli della segnalazione meccanica negli NCC e la sua interazione con altri segnali chimici per ottenere una comprensione più profonda della relazione tra NCC e segnalazione meccanica.

Protocol

1. Preparazione dell’idrogel NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti in una cappa di coltura cellulare che è stata disinfettata con etanolo e ultravioletto (UV) sterilizzato prima dell’uso per mantenere la sterilità. Gli strumenti, come pinzette e pipette, devono essere spruzzati con etanolo. Anche le soluzioni tampone devono essere filtrate sterili. Preparazione di coperture in vetro rivestite di aminosilano Posizionare il numero desiderato di coperture in vetro su u…

Representative Results

Preparazione dell’idrogel e valutazione della rigidità tramite AFM e modello HertzQui, viene fornito un protocollo dettagliato per generare idrogel di poliacrilammide di rigidità variabile regolando il rapporto tra acrilammide e bis-acrilammide. Tuttavia, gli idrogel di poliacrilammide non sono pronti per l’adesione delle cellule a causa della mancanza di proteine ECM. Pertanto, il sulfo-SANPAH, agendo come un linker, si lega covalentemente agli idrogel e reagisce con le ammine primarie delle prote…

Discussion

L’obiettivo del presente studio è quello di fornire un sistema in vitro efficace ed efficiente per comprendere meglio l’impatto dei segnali meccanici negli NCC. Oltre a seguire il protocollo passo-passo sopra menzionato, i ricercatori devono tenere presente che la coltura cellulare di NCC O9-1 è influenzata dal tipo di coverslip di vetro utilizzati per preparare gli idrogel. Ad esempio, è stato notato che le cellule seminate su un tipo specifico di coverslip di vetro (vedi la Tabella dei materiali)</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo la dott.ssa Ana-Maria Zaske, operatore della struttura Atomic Force Microscope-UT Core presso l’Università del Texas Health Sciences Center, per l’esperienza apportata in AFM in questo progetto. Ringraziamo anche le fonti di finanziamento del National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 e R01HL142704 a J. Wang).

Materials

12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip Chemglass Life Sciences CLS-1763-012
2% Bis-Acrylamide Sigma Aldrich M1533
24-well plate Greiner Bio-one 662165
25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip Chemglass Life Sciences CLS-1763-025
3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) Sigma Aldrich A3648
4-well cell culture plate Thermo Scientific 179830
4% Paraformaldehyde Sigma Aldrich J61899-AP
40% Acrylamide Sigma Aldrich A4058
50% glutaraldehyde Sigma Aldrich G7651
6-well cell culture plate Greiner Bio-one 657160
AFM cantilever (spherical bead) Novascan
AFM software Catalyst NanoScope Model: 8.15 SR3R1
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher A12379
Ammonium Persulfate (APS) Sigma Aldrich 248614 Powder
anti-AP-2α Antibody Santa Cruz sc-12726
anti-Vinculin antibody Abcam ab129002
Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst Bruker Corporation
Collagen type I (100mg) Corning 354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher D1306
Dichloromethylsilane (DCMS) Sigma Aldrich 440272
Donkey serum Sigma Aldrich D9663
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Corning 10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV
Fluorescence microscope Leica Model DMi8
Fluoromount-G mounting medium SouthernBiotech 0100-35
HEPES Sigma Aldrich H3375 Powder
Horse serum Corning 35-030-CI
iScript Reverse Transcription Supermix Bio-Rad 1708841
Penicillin-Streptomycin antibiotic Thermo Fisher 15140148
RNeasy micro kit Qiagen 74004
Sterile 1x PBS Hyclone SH30256.02
Sterile deionized water Hardy Diagnostics U284
sulfo-SANPAH Thermo Fisher 22589
SYBR green Applied Biosystems 4472908
TEMED Sigma Aldrich T9281
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Tween 20 Sigma Aldrich P9416

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Le, T. P., Zhao, X., Erhardt, S., Gu, J., Wang, H., Findley, T. O., Wang, J. An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells. J. Vis. Exp. (174), e62693, doi:10.3791/62693 (2021).

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