PCR de gotas digitales para detectar mutaciones de Indels en poblaciones de mosquitos anofelinos modificados genéticamente
Summary
Este protocolo proporciona los pasos desde la extracción de ADN hasta la configuración experimental para la PCR digital de gotas (ddPCR), incluido el análisis para la identificación y cuantificación de eventos de unión final no homólogos (NHEJ) en sitios objetivo después de la escisión Cas9 inducida por gRNA y la reparación del ADN. Otros usos de este método incluyen aplicaciones como la detección de polimorfismo y la verificación de variantes de edición de genes.
Abstract
Los recientes avances en genómica de mosquitos y tecnologías de ingeniería genética han fomentado la necesidad de métodos rápidos y eficientes para detectar la variación de la secuencia de ADN dirigida a gran escala. Específicamente, la detección de inserciones y deleciones (indels) en sitios editados genéticamente generados por CRISPR guía RNA (gRNA) / Cas9-mediated non-homologous end-joining (NHEJ) es importante para evaluar la fidelidad de la mutagénesis y la frecuencia de cambios no deseados. Describimos aquí un protocolo para PCR de gotas digitales (ddPCR) que es muy adecuado para el análisis NHEJ de alto rendimiento. Si bien este método no produce datos que identifiquen la variación de secuencia individual, proporciona una estimación cuantitativa de la variación de secuencia dentro de una población. Además, con los recursos adecuados, este protocolo se puede implementar en un entorno de laboratorio de campo más fácilmente que la secuenciación de próxima generación o Sanger. ddPCR también tiene un tiempo de respuesta más rápido para los resultados que cualquiera de esos métodos, lo que permite un análisis más rápido y completo de la variación genética en poblaciones silvestres durante los ensayos de campo de organismos genéticamente modificados.
Introduction
Los impulsores genéticos tienen un inmenso potencial para controlar las poblaciones de insectos de relevancia médica y agrícola1,2,3,4,5. Por ejemplo, los sistemas de impulsores genéticos basados en nucleasas CRISPR Cas y ARN guía (ARNg) se pueden utilizar para modificar las poblaciones de mosquitos vectores mediante la introducción de rasgos que confieren refractariedad a los parásitos de la malaria que conducen a una transmisión reducida y menos enfermedades1,4,5. El sistema de impulsor genético se copia a sí mismo y al rasgo asociado de un cromosoma homólogo a otro en las células germinales premeióticas, y esto asegura que la mayoría de la descendencia herede el impulso y cree el potencial para una modificación de la población duradera y sostenible en el campo. Sin embargo, una desventaja de los métodos basados en Cas/gRNA es la posibilidad de generar mutaciones de inserción y deleción (indel) a través de la reparación del ADN de unión final no homóloga (NHEJ), lo que resulta en la generación de alelos resistentes a la unidad, que cuando se acumulan a una frecuencia lo suficientemente alta en la población, pueden evitar que el sistema de accionamiento se propague1,2,3,4 . Este protocolo detalla un método confiable y de alto rendimiento que puede determinar la prevalencia y la cantidad relativa de mutaciones indel, tanto a nivel poblacional como individual, durante el impulso genético basado en Cas / gRNA.
Los métodos de secuenciación de próxima generación (NGS) proporcionan una resolución de secuenciación sin precedentes. Sin embargo, el costo y los requisitos técnicos asociados con NGS prohíben las pruebas de rutina y limitan su uso como un método de alto rendimiento para evaluar los indels6,7,8. Los métodos tradicionales de cuantificación por PCR se han utilizado durante mucho tiempo como el procedimiento de evaluación estándar para los indels del genoma; sin embargo, estos métodos requieren mucha mano de obra, tardan mucho tiempo en obtener datos y tienen un alto grado de variabilidad. Se ha demostrado que la PCR digital-droplet (ddPCR) es más sensible a la detección de mutaciones que la secuenciación de Sanger en algunas aplicaciones y tiene un límite de detección más bajo que NGS en otras6,7,8,9. Además, el costo de evaluar un conjunto de muestras y el tiempo de respuesta para obtener resultados es menos costoso y más rápido, respectivamente, para ddPCR que la secuenciación de Sanger o NGS9. Utilizando un sistema de doble sonda, el ensayo Drop-Off identifica los alelos NHEJ en función de la ausencia de secuencia de tipo salvaje (WT) en el sitio de corte Cas9 del objetivo dirigido por gRNA. En este ensayo, un amplicón corto que incluye el sitio de corte predicho del sistema basado en Cas / gRNA se amplifica con un par de cebadores específicos. Una sonda fluorescente está diseñada para unirse a una región conservada del amplicón y otra sonda fluorescente reconoce la secuencia WT del sitio de corte. En presencia de un alelo NHEJ, este último no se unirá al amplicón.
El uso de ddPCR proporciona la capacidad de diseñar cebadores para apuntar a deleciones, diferencias de par de bases individuales e inserciones, lo que permitirá el perfil de NHEJ en análisis de población de mosquitos9. Dadas estas características atractivas, creamos un protocolo para ddPCR para la detección de alto rendimiento de indels generados a partir de un sistema de impulsor genético basado en Cas / gRNA en mosquitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La PCR de gotas digitales es un método eficiente para determinar la presencia de alelos indel resultantes de eventos NHEJ en un sistema de impulsor genético basado en Cas/gRNA y permite cuantificar la frecuencia de estos alelos en individuos o poblaciones. Algunos pasos del protocolo deben seguirse con especial cuidado para lograr resultados confiables. En primer lugar, la extracción de ADN genómico debe realizarse con cuidado para garantizar una alta calidad y una cantidad suficiente. Una buena extracción permitirá la determinación precisa de las copias del genoma haploide por reacción. En nuestra experiencia, un kit disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales)proporcionó consistentemente extracciones de ADN de alta calidad. Sin embargo, las extracciones de mosquitos individuales pueden resultar particularmente desafiantes ya que el gránulo de ADN se vuelve difícil de visualizar y puede ser fácilmente absorbido con el sobrenadante si no se tiene cuidado. En segundo lugar, las imprimaciones y sondas deben diseñarse cuidadosamente. Antes de completar el experimento ddPCR, asegúrese de que los cebadores diseñados den como resultado un solo producto de PCR realizando primero una PCR tradicional y visualizando un solo producto a través de la electroforesis en gel. La sonda FAM de referencia también debe diseñarse de manera que sea complementaria a una secuencia altamente conservada. Esto garantizará detecciones precisas de alelos WT en una población diversa. Las combinaciones de imprimación / sonda para cada experimento único tendrán diferentes condiciones de termociclador, y se recomienda optimizar esas condiciones utilizando un gradiente térmico.
Existen otros métodos para identificar indels, como la secuenciación de Sanger o NGS. La secuenciación de Sanger es limitada porque tiene un límite inferior de detección y un bajo poder de descubrimiento para identificar nuevas variantes. La secuenciación de Sanger también requiere mucha mano de obra y no es de alto rendimiento. En comparación con la secuenciación de Sanger, NGS no tiene las mismas limitaciones de baja sensibilidad, poder de descubrimiento y rendimiento. Otro beneficio de NGS es su capacidad para detectar una variedad de mutaciones, desde el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) hasta los reordenamientos. Sin embargo, NGS es un método más costoso y lento en la aplicación de la determinación de indels asociados a Cas9 / gRNA porque solo hay una región objetivo de interés, y es más adecuado para análisis más grandes de todo el genoma. En comparación con los métodos mencionados anteriormente, ddPCR es de alto rendimiento y tiene un tiempo de respuesta rápido. Si los materiales e instrumentos de ddPCR están disponibles internamente, se pueden procesar 96 muestras en 1-2 días, lo que lo hace muy adecuado para el análisis rápido de grandes ensayos de organismos modificados con Cas9 / gRNA.
Si bien existen muchos beneficios para ddPCR, también existen limitaciones. En primer lugar, el equipo ddPCR no está frecuentemente disponible en un entorno de laboratorio independiente. El equipo de ddPCR puede estar disponible comunitariamente en instituciones de investigación más grandes, pero esto no permite facilitar la generación y el análisis de datos fuera de la institución. En segundo lugar, a diferencia de las alternativas, ddPCR no proporciona las secuencias únicas individuales de mutaciones indel identificadas. La PCR de gotas digitales proporcionará la frecuencia de mutaciones indel dentro de una población, pero sin la secuencia, no se puede determinar si los indels presentes tienen más probabilidades de conservar o inhibir la función del gen de interés. El método ddPCR es quizás el más adecuado para analizar poblaciones silvestres después de un ensayo de liberación de campo de un organismo impulsor basado en Cas9 / gRNA porque puede determinar de manera eficiente la frecuencia de introducción del transgén en la población nativa y la generación de indels dentro de la población casi en tiempo real. Debido al rápido tiempo de respuesta de ddPCR, sería factible realizar muestreos y analizar semanalmente la población en una región de prueba de campo si los materiales estuvieran disponibles localmente. Los costos iniciales para comprar, importar y configurar el equipo ddPCR serían altos en laboratorios remotos, pero los beneficios de poder evaluar rigurosamente una población silvestre, ya que está siendo modificada desde un sistema de accionamiento justificarían los costos.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La financiación fue proporcionada por la Iniciativa de Malaria irvine de la Universidad de California. AAJ es profesor Donald Bren en la Universidad de California, Irvine.
Materials
| Reagents | |||
| ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
| DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| EDTA (pH 8.0) | Invitrogen | AM9260G | |
| Ethanol, 200 Proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| Isopropanol (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | A416-500 | |
| Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| PCR-grade Water | Any certified PCR-grade water can be used | ||
| Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| Proteinase K 20 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| Materials | |||
| ddPCR 96-Well Plate | Bio-Rad | 12001925 | |
| Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| Droplet Generation Oil for probes | Bio-Rad | 1863005 | |
| Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes) | Sigma-Aldrich | N/A | Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Forward and Reverse oligonucleotide primers | Sigma-Aldrich | N/A | Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Equipment | |||
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well |
References
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
- Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34, 78-83 (2016).
- Courtier-Orgogozo, V., Morizot, B., Boëte, C. Agricultural pest control with CRISPR-based gene drive: time for public debate: Should we use gene drive for pest control. EMBO Reports. 18 (6), 878-880 (2017).
- Carballar-Lejarazú, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553 (2020).
- Wang, Z., et al. Comparison of droplet digital PCR and direct Sanger sequencing for the detection of the BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinoma. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 33 (6), 22902 (2019).
- Dong, L., Wang, S., Fu, B., Wang, J. Evaluation of droplet digital PCR and next generation sequencing for characterizing DNA reference material for KRAS mutation detection. Scientific Reports. 8 (1), 9650 (2018).
- Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR_Cas9 induced mutations using next-generation sequencing. BMC Genomics. 15 (1), 1002 (2014).
- Carballar-Lejarazú, R., Kelsey, A., Pham, T. B., Bennett, E. P., James, A. A. Digital droplet PCR and IDAA for the detection of CRISPR indel edits in the malaria species Anopheles stephensi. Biotechniques. 68 (4), 172-179 (2020).
- Holt, R. A., et al. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298 (5591), 129-149 (2002).
