Digital-Droplet PCR zum Nachweis von Indel-Mutationen in gentechnisch veränderten Anopheline-Mückenpopulationen
Summary
Dieses Protokoll bietet die Schritte von der DNA-Extraktion bis zum Versuchsaufbau für die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR), einschließlich der Analyse zur Identifizierung und Quantifizierung von nicht-homologen End-Joining-Ereignissen (NHEJ) an Zielorten nach gRNA-induzierter Cas9-Spaltung und DNA-Reparatur. Andere Anwendungen dieser Methode umfassen Anwendungen wie den Polymorphismus-Nachweis und die Verifizierung von Gen-Editing-Varianten.
Abstract
Jüngste Fortschritte in der Moskitogenomik und den Gentechniktechnologien haben den Bedarf an schnellen und effizienten Methoden zum Nachweis gezielter DNA-Sequenzvariationen in großem Maßstab gefördert. Insbesondere der Nachweis von Insertionen und Deletionen (Indels) an geneditierten Stellen, die durch CRISPR-Guide-RNA (gRNA)/Cas9-vermittelte nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) erzeugt werden, ist wichtig, um die Genauigkeit der Mutagenese und die Häufigkeit unbeabsichtigter Veränderungen zu beurteilen. Wir beschreiben hier ein Protokoll für die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR), das sich gut für die NHEJ-Analyse mit hohem Durchsatz eignet. Während diese Methode keine Daten liefert, die individuelle Sequenzvariationen identifizieren, liefert sie eine quantitative Schätzung der Sequenzvariation innerhalb einer Population. Darüber hinaus kann dieses Protokoll mit geeigneten Ressourcen in einem Labor vor Ort einfacher implementiert werden als die Sequenzierung der nächsten Generation oder der Sanger-Sequenzierung. ddPCR hat auch eine schnellere Bearbeitungszeit für Ergebnisse als jede dieser Methoden, was eine schnellere und vollständigere Analyse der genetischen Variation in Wildpopulationen während Feldversuchen mit gentechnisch veränderten Organismen ermöglicht.
Introduction
Gene Drives haben ein immenses Potenzial, Insektenpopulationen von medizinischer und landwirtschaftlicher Relevanz zu kontrollieren1,2,3,4,5. Zum Beispiel können Gene-Drive-Systeme, die auf CRISPR-Cas-Nukleasen und Leit-RNAs (gRNAs) basieren, verwendet werden, um Vektormückenpopulationen zu modifizieren, indem Merkmale eingeführt werden, die Malariaparasiten Refraktärität verleihen, was zu einer verminderten Übertragung und weniger Krankheit führt1,4,5. Das Gene-Drive-System kopiert sich selbst und das damit verbundene Merkmal in den prämeiotischen Keimzellen von einem homologen Chromosom zum anderen, und dies stellt sicher, dass die Mehrheit der Nachkommen den Antrieb erbt und das Potenzial für eine lang anhaltende und nachhaltige Populationsmodifikation im Feld schafft. Ein Nachteil der Cas/gRNA-basierten Methoden ist jedoch die Möglichkeit, Insertions- und Deletionsmutationen (Indel) durch nicht-homologe Endverbindungs-DNA-Reparatur (NHEJ) zu erzeugen, was zur Erzeugung von antriebsresistenten Allelen führt, die, wenn sie sich in der Population zu einer ausreichend hohen Frequenz ansammeln, das Antriebssystem daran hindern können, sich auszubreiten1,2,3,4 . Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode mit hohem Durchsatz, die die Prävalenz und relative Menge von Indelmutationen sowohl auf Populations- als auch auf individueller Ebene während des Cas/gRNA-basierten Gene Drive bestimmen kann.
Next-Generation-Sequencing-Methoden (NGS) bieten eine beispiellose Sequenzierungsauflösung. Die mit NGS verbundenen Kosten und technischen Anforderungen verbieten jedoch Routineprüfungen und schränken seine Verwendung als Hochdurchsatzmethode zur Bewertung der Indel6,7,8 ein. Traditionelle PCR-Quantifizierungsmethoden werden seit langem als Standardbewertungsverfahren für Genom-Indel verwendet; Diese Methoden sind jedoch arbeitsintensiv, benötigen viel Zeit, um Daten zu beschaffen, und weisen ein hohes Maß an Variabilität auf. Die Digital-Droplet-PCR (ddPCR) hat sich in einigen Anwendungen als empfindlicher beim Nachweis von Mutationen erwiesen als die Sanger-Sequenzierung und hat in anderen Anwendungen eine niedrigere Nachweisgrenze als NGS6,7,8,9. Darüber hinaus sind die Kosten für die Bewertung eines Probensatzes und die Bearbeitungszeit für die Erzielung von Ergebnissen für die ddPCR kostengünstiger bzw. schneller als für die Sanger-Sequenzierung oder NGS9. Mit einem Dual-Probe-System identifiziert der Drop-Off-Assay NHEJ-Allele basierend auf dem Fehlen einer Wildtypsequenz (WT) an der gRNA-gerichteten Ziel-Cas9-Cut-Site. In diesem Assay wird ein kurzes Amplikon einschließlich der vorhergesagten Schnittstelle des Cas/gRNA-basierten Systems mit einem spezifischen Primerpaar amplifiziert. Eine Fluoreszenzsonde ist so konzipiert, dass sie an einen konservierten Bereich des Amplikons bindet, und eine andere Fluoreszenzsonde erkennt die WT-Sequenz der Schnittstelle. In Gegenwart eines NHEJ-Allels bindet letzteres nicht an das Amplikon.
Die Verwendung von ddPCR bietet die Möglichkeit, Primer zu entwerfen, um Deletionen, einzelne Basenpaardifferenzen und Insertionen zu erreichen, was eine NHEJ-Profilierung in Mückenpopulationsanalysen ermöglicht9. Angesichts dieser attraktiven Eigenschaften haben wir ein Protokoll für ddPCR für den Hochdurchsatznachweis von Indeln entwickelt, die aus einem Cas/gRNA-basierten Gene-Drive-System in Moskitos erzeugt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die digitale Tröpfchen-PCR ist eine effiziente Methode zur Bestimmung des Vorhandenseins von Indel-Allelen, die aus NHEJ-Ereignissen resultieren, in einem Cas/gRNA-basierten Gene-Drive-System und ermöglicht die Quantifizierung der Häufigkeit dieser Allele bei Individuen oder Populationen. Einige Schritte des Protokolls müssen mit besonderer Sorgfalt befolgt werden, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Erstens muss die genomische DNA-Extraktion sorgfältig durchgeführt werden, um eine hohe Qualität und ausreichende Quantität zu gewährleisten. Eine gute Extraktion ermöglicht eine genaue Bestimmung der haploiden Genomkopien pro Reaktion. Nach unserer Erfahrung lieferte ein kommerziell erhältliches Kit (siehe Materialtabelle)gleichbleibend hochwertige DNA-Extraktionen. Extraktionen einzelner Moskitos können sich jedoch als besonders schwierig erweisen, da das DNA-Pellet schwer zu visualisieren ist und leicht mit dem Überstand aufgesaugt werden kann, wenn es nicht vorsichtig ist. Zweitens müssen Primer und Sonden sorgfältig entworfen werden. Stellen Sie vor Abschluss des ddPCR-Experiments sicher, dass die entworfenen Primer zu einem einzelnen PCR-Produkt führen, indem Sie zunächst eine herkömmliche PCR durchführen und ein einzelnes Produkt über Gelelektrophorese visualisieren. Die Referenz-FAM-Sonde muss ebenfalls so ausgelegt sein, dass sie eine hochkonservierte Sequenz ergänzt. Dies wird einen genauen Nachweis von WT-Allelen in einer vielfältigen Population gewährleisten. Die Primer/Sonden-Kombinationen für jedes einzelne Experiment haben unterschiedliche Thermocycler-Bedingungen, und es wird empfohlen, diese Bedingungen mit einem thermischen Gradienten zu optimieren.
Es gibt andere Methoden zur Identifizierung von Indeln, wie z.B. Sanger-Sequenzierung oder NGS. Die Sanger-Sequenzierung ist begrenzt, da sie eine niedrigere Nachweisgrenze und eine geringe Entdeckungskraft hat, um neue Varianten zu identifizieren. Die Sanger-Sequenzierung ist auch arbeitsintensiv und hat keinen hohen Durchsatz. Im Vergleich zur Sanger-Sequenzierung weist NGS nicht die gleichen Einschränkungen in Bezug auf geringe Empfindlichkeit, Erkennungsleistung und Durchsatz auf. Ein weiterer Vorteil von NGS ist seine Fähigkeit, eine Vielzahl von Mutationen vom Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNPs) bis hin zu Umlagerungen nachzuweisen. NGS ist jedoch eine kostspieligere und zeitaufwendigere Methode bei der Anwendung der Bestimmung von Cas9/gRNA-assoziierten Indeln, da es nur eine Zielregion von Interesse gibt und sich am besten für größere genomweite Analysen eignet. Im Vergleich zu den oben genannten Methoden ist ddPCR ein hoher Durchsatz und hat eine schnelle Durchlaufzeit. Wenn die ddPCR-Materialien und -Instrumente im eigenen Haus verfügbar sind, können innerhalb von 1-2 Tagen 96 Proben verarbeitet werden, was sie für die schnelle Analyse großer Studien mit Cas9/gRNA-modifizierten Organismen gut geeignet macht.
Während viele Vorteile für ddPCR bestehen, gibt es auch Einschränkungen. Erstens ist die ddPCR-Ausrüstung nicht häufig in einer unabhängigen Laborumgebung verfügbar. ddPCR-Geräte können in größeren Forschungseinrichtungen kommunal verfügbar sein, aber dies ermöglicht keine einfache Datengenerierung und -analyse außerhalb der Institution. Zweitens liefert ddPCR im Gegensatz zu den Alternativen nicht die einzelnen eindeutigen Sequenzen identifizierter Indelmutationen. Die digitale Tröpfchen-PCR liefert die Häufigkeit von Indelmutationen innerhalb einer Population, aber ohne die Sequenz kann man nicht feststellen, ob die vorhandenen Indels eher die Funktion des interessierenden Gens erhalten oder hemmen. Die ddPCR-Methode eignet sich vielleicht am besten, um Wildpopulationen nach einem Feldfreisetzungsversuch eines Cas9/gRNA-basierten Antriebsorganismus zu analysieren, da sie die Häufigkeit der Einführung des Transgens in die einheimische Population und die Erzeugung von Indeln innerhalb der Population nahezu in Echtzeit effizient bestimmen kann. Aufgrund der schnellen Durchlaufzeit der ddPCR wäre es möglich, wöchentlich Probenahmen durchzuführen und die Population in einer Feldversuchsregion zu analysieren, wenn Materialien vor Ort verfügbar wären. Die Anlaufkosten für den Kauf, den Import und die Einrichtung der ddPCR-Ausrüstung wären in abgelegenen Labors hoch, aber die Vorteile, eine wild lebende Population streng bewerten zu können, während sie von einem Antriebssystem modifiziert wird, würden die Kosten rechtfertigen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Finanzierung erfolgte durch die Irvine Malaria Initiative der University of California. AAJ ist Donald Bren Professor an der University of California, Irvine.
Materials
| Reagents | |||
| ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
| DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| EDTA (pH 8.0) | Invitrogen | AM9260G | |
| Ethanol, 200 Proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| Isopropanol (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | A416-500 | |
| Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| PCR-grade Water | Any certified PCR-grade water can be used | ||
| Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| Proteinase K 20 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| Materials | |||
| ddPCR 96-Well Plate | Bio-Rad | 12001925 | |
| Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| Droplet Generation Oil for probes | Bio-Rad | 1863005 | |
| Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes) | Sigma-Aldrich | N/A | Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Forward and Reverse oligonucleotide primers | Sigma-Aldrich | N/A | Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Equipment | |||
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well |
References
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