PCR de gotícula digital para detectar mutações indelés em populações de mosquitos anofelinos geneticamente modificados
Summary
Este protocolo fornece os passos desde a extração de DNA até a configuração experimental para PCR de gotícula digital (ddPCR), incluindo análise para identificação e quantificação de eventos não homólogos de junção final (NHEJ) em locais-alvo após o decote Cas9 induzido pelo GRNA e reparação de DNA. Outros usos deste método incluem aplicações como detecção de polimorfismo e verificação de variantes de edição de genes.
Abstract
Os recentes avanços na genômica de mosquitos e tecnologias de engenharia genética têm fomentado a necessidade de métodos rápidos e eficientes para detectar a variação da sequência de DNA direcionada em larga escala. Especificamente, detectar inserções e exclusões (indels) em sites editados por genes gerados pelo guia CRISPR RNA (gRNA)/Cas9-mediado não-homólogo (NHEJ) é importante para avaliar a fidelidade da mutagênese e a frequência de alterações não intencionais. Descrevemos aqui um protocolo para PCR de gotícula digital (ddPCR) que é adequado para análise nhej de alto rendimento. Embora este método não produza dados que identifiquem a variação da sequência individual, ele fornece uma estimativa quantitativa da variação sequencial dentro de uma população. Além disso, com os recursos apropriados, este protocolo pode ser implementado em um laboratório de campo mais facilmente do que a próxima geração ou sequenciamento Sanger. O ddPCR também tem um tempo de retorno mais rápido para resultados do que qualquer um desses métodos, o que permite uma análise mais rápida e completa da variação genética em populações selvagens durante testes de campo de organismos geneticamente modificados.
Introduction
Os impulsos genéticos têm imenso potencial para controlar populações de insetos de relevância médica e agrícola1,2,3,4,5. Por exemplo, sistemas de acionamento genético baseados em núcleos CRISPR Cas e guia RNAs (gRNAs) podem ser usados para modificar populações de mosquitos vetoriais, introduzindo traços que conferem refractoridade a parasitas da malária levando à redução da transmissão e menosdoenças 1,4,5. O sistema de unidade genética copia a si mesmo e o traço associado de um cromossomo homólogo para outro nas células germinativas pré-meiotic, e isso garante que a maioria dos descendentes herdem o impulso e criem o potencial de modificação populacional duradoura e sustentável no campo. No entanto, uma desvantagem dos métodos baseados em Cas/gRNA é a possibilidade de gerar mutações de inserção e exclusão (indel) através de reparos de DNA não homólogos (NHEJ), resultando na geração de alelos resistentes a unidade, que quando acumulados a uma frequência alta o suficiente na população, podem impedir que o sistema de acionamento se espalhe1,2,3,4 . Este protocolo detalha um método de alto rendimento e confiável que pode determinar a prevalência e a quantidade relativa de mutações indel, tanto no nível populacional quanto individual, durante a unidade genética baseada em Cas/gRNA.
Os métodos de sequenciamento de próxima geração (NGS) fornecem resolução de sequenciamento incomparável. No entanto, os requisitos de custo e técnico associados ao NGS proíbem testes de rotina e limitam seu uso como método de alto rendimento para avaliar os indels6,7,8. Os métodos tradicionais de quantificação do PCR têm sido usados há muito tempo como procedimento de avaliação padrão para indels genoma; no entanto, esses métodos são intensivos em mão-de-obra, levam muito tempo para obter dados e têm um alto grau de variabilidade. O DIGITAL-Droplet PCR (ddPCR) tem se mostrado mais sensível na detecção de mutações do que o sequenciamento Sanger em algumas aplicações e tem um limite de detecção menor do que o NGS em outros6,7,8,9. Além disso, o custo para avaliar um conjunto amostral e tempo de retorno para a obtenção de resultados é menos caro e mais rápido, respectivamente, para ddPCR do que tanto o sequenciamento Sanger quanto o NGS9. Usando um sistema de sonda dupla, o ensaio Drop-Off identifica alelos NHEJ com base na ausência de sequência de tipo selvagem (WT) no local de corte Cas9 direcionado por gRNA. Neste ensaio, uma amplicon curta, incluindo o local de corte previsto do sistema baseado em Cas/gRNA, é amplificada com um par de primer específico. Uma sonda fluorescente foi projetada para se ligar a uma região conservada do amplicon e outra sonda fluorescente reconhece a sequência WT do local do corte. Na presença de um alelo NHEJ, este último não se ligará ao amplicon.
O uso do ddPCR fornece a capacidade de projetar primers para exclusões de alvo, diferenças e inserções de par de base única, o que permitirá o perfil NHEJ nas análises populacionais de mosquitos9. Dadas essas características atraentes, criamos um protocolo para ddPCR para detecção de indels de alto rendimento gerado a partir de um sistema de acionamento genético baseado em Cas/gRNA em mosquitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O PCR de gotícula digital é um método eficiente para determinar a presença de alelos indemais resultantes de eventos NHEJ em um sistema de unidade genética baseado em Cas/gRNA e permite quantificação da frequência desses alelos em indivíduos ou populações. Algumas etapas do protocolo precisam ser seguidas com cuidado especial para alcançar resultados confiáveis. Em primeiro lugar, a extração genômica de DNA precisa ser realizada cuidadosamente para garantir alta qualidade e quantidade suficiente. Uma boa extração permitirá a determinação precisa das cópias do genoma haploide por reação. Em nossa experiência, um kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) forneceu extrações de DNA de alta qualidade consistentemente. No entanto, extrações de mosquitos individuais podem ser particularmente desafiadoras à medida que a pelota de DNA se torna difícil de visualizar e pode ser facilmente sugada com o supernante se não cuidadoso. Em segundo lugar, primers e sondas devem ser projetados cuidadosamente. Antes de completar o experimento ddPCR, certifique-se de que os primers projetados resultem em um único produto PCR, realizando primeiro um PCR tradicional e visualizando um único produto via eletroforese de gel. A sonda FAM de referência também deve ser projetada para que seja complementar a uma sequência altamente conservada. Isso garantirá detecções precisas de alelos WT em uma população diversificada. As combinações de primer/sonda para cada experimento único terão condições termocicras diferentes, e é recomendável otimizar essas condições usando um gradiente térmico.
Existem outros métodos para identificar indels, como sequenciamento de Sanger ou NGS. O sequenciamento de sanger é limitado porque tem um limite menor de detecção e baixo poder de descoberta para identificar novas variantes. O sequenciamento de sanger também é intensivo em mão-de-obra e não é de alto rendimento. Comparado ao sequenciamento de Sanger, o NGS não tem as mesmas limitações de baixa sensibilidade, poder de descoberta e throughput. Outro benefício do NGS é sua capacidade de detectar uma variedade de mutações desde o polimorfismo de nucleotídeos únicos (SNPs) até rearranjos. No entanto, o NGS é um método mais caro e demorado na aplicação da determinação de indels associados ao Cas9/gRNA, porque há apenas uma região-alvo de interesse, e é mais adequado para análises maiores em todo o genoma. Comparado com os métodos acima mencionados, o ddPCR é de alto rendimento e tem um tempo de retorno rápido. Se os materiais e instrumentos ddPCR estiverem disponíveis internamente, 96 amostras podem ser processadas dentro de 1-2 dias, tornando-a adequada para análise rápida de grandes ensaios de organismos modificados cas9/gRNA.
Embora existam muitos benefícios para o ddPCR, também existem limitações. Em primeiro lugar, o equipamento ddPCR não está frequentemente disponível em um ambiente de laboratório independente. os equipamentos ddPCR podem estar disponíveis em conjunto em instituições de pesquisa maiores, mas isso não permite a facilidade de geração e análise de dados fora da instituição. Em segundo lugar, ao contrário das alternativas, o ddPCR não fornece as sequências individuais únicas de mutações indel identificadas. O PCR de gotícula digital fornecerá a frequência de mutações indel dentro de uma população, mas sem a sequência, não se pode determinar se os indels presentes são mais propensos a conservar ou inibir a função do gene de interesse. O método ddPCR é talvez adequado para analisar populações selvagens após um teste de liberação de campo de um organismo de acionamento baseado em Cas9/gRNA, pois pode determinar eficientemente a frequência de introdução do transgene na população nativa e a geração de indels dentro da população em tempo real. Devido ao tempo de rápida retorno do DDPCR, seria viável realizar amostragem e analisar a população em uma região de ensaio de campo semanalmente se os materiais estivessem disponíveis localmente. Os custos in start-up para comprar, importar e configurar os equipamentos ddPCR seriam altos em laboratórios remotos, mas os benefícios de ser capaz de avaliar rigorosamente uma população selvagem, pois está passando por modificações de um sistema de acionamento justificaria os custos.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O financiamento foi fornecido pela Iniciativa irvine de malária da Universidade da Califórnia. AAJ é um professor donald bren na Universidade da Califórnia, Irvine.
Materials
| Reagents | |||
| ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
| DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| EDTA (pH 8.0) | Invitrogen | AM9260G | |
| Ethanol, 200 Proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| Isopropanol (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | A416-500 | |
| Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| PCR-grade Water | Any certified PCR-grade water can be used | ||
| Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| Proteinase K 20 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| Materials | |||
| ddPCR 96-Well Plate | Bio-Rad | 12001925 | |
| Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| Droplet Generation Oil for probes | Bio-Rad | 1863005 | |
| Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes) | Sigma-Aldrich | N/A | Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Forward and Reverse oligonucleotide primers | Sigma-Aldrich | N/A | Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Equipment | |||
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well |
References
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