ثنائي الفينيل متعدد الكلور الرقمي القطيرات للكشف عن طفرات Indels في مجموعات البعوض Anopheline المعدلة وراثيا
Summary
يوفر هذا البروتوكول الخطوات من استخراج الحمض النووي إلى الإعداد التجريبي ل PCR القطيرات الرقمية (ddPCR) ، بما في ذلك تحليل لتحديد وتحديد كمي لأحداث الانضمام النهائي غير المتجانسة (NHEJ) في المواقع المستهدفة بعد انشقاق Cas9 الناجم عن الحمض النووي الريبي وإصلاح الحمض النووي. وتشمل الاستخدامات الأخرى لهذه الطريقة تطبيقات مثل الكشف عن تعدد الأشكال والتحقق من متغير تحرير الجينات.
Abstract
وقد عززت التطورات الأخيرة في علم جينوم البعوض وتكنولوجيات الهندسة الوراثية الحاجة إلى أساليب سريعة وفعالة للكشف عن اختلاف تسلسل الحمض النووي المستهدف على نطاق واسع. على وجه التحديد ، والكشف عن عمليات الإدراج والحذف (indels) في المواقع التي تم تحريرها الجينات التي تم إنشاؤها بواسطة دليل CRISPR الجيش الملكي النيبالي (gRNA) / Cas9 بوساطة غير متجانسة نهاية الانضمام (NHEJ) مهم لتقييم إخلاص تولد وتواتر التغيرات غير المقصودة. نحن نصف هنا بروتوكولا ل PCR الرقمية قطرة (ddPCR) التي هي مناسبة تماما لتحليل NHEJ عالية الإنتاجية. وفي حين أن هذه الطريقة لا تنتج بيانات تحدد تباين التسلسل الفردي، فإنها توفر تقديرا كميا لتباين التسلسل داخل مجموعة سكانية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تنفيذ هذا البروتوكول، بموارد مناسبة، في موقع ميداني في المختبر بسهولة أكبر من الجيل التالي أو تسلسل سانجر. كما أن DDPCR لديها وقت أسرع للنتائج من أي من هاتين الطريقتين ، مما يسمح بإجراء تحليل أسرع وكامل للتباين الجيني في المجموعات البرية أثناء التجارب الميدانية للكائنات المعدلة وراثيا.
Introduction
محركات الجينات لديها إمكانات هائلة للسيطرة على مجموعات الحشرات ذات الصلة الطبية والزراعية1،2،3،4،5. على سبيل المثال، يمكن استخدام أنظمة الدفع الجيني المستندة إلى نواة CRISPR Cas وتوجيه الرناسات (gRNAs) لتعديل مجموعات البعوض الناقل عن طريق إدخال الصفات التي تمنح الانكسار لطفيليات الملاريا مما يؤدي إلى انخفاض انتقال العدوى وتقليل المرض1و4و5. ينسخ نظام محرك الجينات نفسه والسمة المرتبطة به من كروموسوم متجانس إلى آخر في الخلايا الجرثومية قبل الميوتيكية ، وهذا يضمن أن غالبية النسل يرثون الدافع ويخلقون إمكانية تعديل السكان على المدى الطويل والمستدام في هذا المجال. ومع ذلك ، فإن أحد عيوب الأساليب المستندة إلى Cas / gRNA هو إمكانية توليد طفرات الإدراج والحذف (indel) من خلال إصلاح الحمض النووي غير المتجانس في نهاية الصلة (NHEJ) ، مما يؤدي إلى توليد أليليس مقاومة للقيادة ، والتي عندما تتراكم إلى تردد عال بما فيه الكفاية في السكان ، يمكن أن توقف نظام القيادة من الانتشار1و2و 3و4 . يفصل هذا البروتوكول طريقة عالية الإنتاجية وموثوقة يمكنها تحديد انتشار وكمية نسبية من طفرات indel ، على مستوى السكان والأفراد على حد سواء ، أثناء محرك الجينات القائم على Cas / gRNA.
توفر أساليب تسلسل الجيل التالي (NGS) دقة تسلسل لا مثيل لها. ومع ذلك، فإن التكلفة والمتطلبات التقنية المرتبطة NGS تحظر الاختبار الروتيني والحد من استخدامه كوسيلة عالية الإنتاجية لتقييم indels6،7،8. وقد استخدمت منذ فترة طويلة أساليب القياس الكمي التقليدية ل PCR كإجراء تقييم قياسي ل indels الجينوم؛ ومع ذلك، هذه الطرق كثيفة العمالة، تستغرق وقتا طويلا لشراء البيانات، ولها درجة عالية من التباين. وقد ثبت الرقمية قطرة PCR (ddPCR) لتكون أكثر حساسية في الكشف عن الطفرات من تسلسل سانجر في بعض التطبيقات ولها حد الكشف أقل من NGS في الآخرين6،7،8،9. وعلاوة على ذلك، فإن تكلفة تقييم مجموعة عينة ووقت الدوران للحصول على النتائج أقل تكلفة وأسرع، على التوالي، بالنسبة ل ddPCR من تسلسل سانجر أو NGS9. باستخدام نظام التحقيق المزدوج، يحدد المقايسة المنسدلة أليلات NHEJ استنادا إلى عدم وجود تسلسل من النوع البري (WT) في موقع قطع Cas9 المستهدف الموجه من GRNA. في هذا المقايسة، يتم تضخيم أمبليكون قصيرة بما في ذلك موقع القطع المتوقع للنظام القائم على Cas/gRNA مع زوج التمهيدي محددة. تم تصميم مسبار فلوري واحد لربط منطقة محفوظة من أمبيرليكون ومسبار فلوري آخر يتعرف على تسلسل WT لموقع القطع. في وجود أليل NHEJ ، فإن هذا الأخير لن يرتبط بالتضخيم.
يوفر استخدام ddPCR القدرة على تصميم التمهيديات لاستهداف عمليات الحذف والاختلافات الفردية بين الزوج الأساسي والإدراج ، مما سيسمح بتصنيف NHEJ في تحليلات مجموعات البعوض9. وبالنظر إلى هذه الميزات الجذابة ، أنشأنا بروتوكولا ل ddPCR للكشف عن الإنتاجية العالية للإندلات المتولدة من نظام محرك الجينات القائم على Cas / gRNA في البعوض.
Protocol
Representative Results
Discussion
الرقمية قطرة PCR هو وسيلة فعالة لتحديد وجود أليليس indel الناتجة عن الأحداث NHEJ في نظام محرك الجينات المستندة إلى Cas / gRNA ويسمح للقياس الكمي لتواتر هذه الأليل في الأفراد أو السكان. وينبغي اتباع بعض الخطوات الواردة في البروتوكول بعناية خاصة لتحقيق نتائج موثوقة. أولا، يجب إجراء استخراج الحمض النووي الجينومي بعناية لضمان جودة عالية وكمية كافية. واستخراج جيدة تسمح بتحديد دقيق لنسخ الجينوم haploid لكل رد فعل. في تجربتنا، قدمت مجموعة متاحة تجاريا (انظر جدول المواد)باستمرار استخراج الحمض النووي عالية الجودة. ومع ذلك ، يمكن أن يثبت استخراج البعوض الفردي أنه صعب بشكل خاص حيث يصبح من الصعب تصور بيليه الحمض النووي ويمكن امتصاصه بسهولة مع البعوض الخارق إن لم يكن حذرا. ثانيا، يجب تصميم التهيئة والتحقيقات بعناية. قبل الانتهاء من تجربة ddPCR ، تأكد من أن التمهيديات المصممة تؤدي إلى منتج PCR واحد من خلال إجراء أول PCR التقليدية وتصور منتج واحد عن طريق الكهربائي هلام. يجب أيضا تصميم مسبار FAM المرجعي بحيث يكون مكملا لتسلسل محفوظ للغاية. وهذا من شأنه أن يضمن الكشف الدقيق عن أليليس WT في جميع أنحاء مجموعة متنوعة من السكان. سيكون لتركيبات التمهيدي/المسبار لكل تجربة فريدة ظروف مختلفة لدراجة حرارية، ويوصى بتحسين هذه الظروف باستخدام تدرج حراري.
توجد طرق أخرى لتحديد indels، مثل تسلسل سانجر أو NGS. تسلسل سانجر محدود لأنه يحتوي على حد أدنى للكشف وقوة اكتشاف منخفضة لتحديد المتغيرات الجديدة. تسلسل سانجر هو أيضا كثيفة العمالة وليس عالية الإنتاجية. بالمقارنة مع تسلسل سانجر، لا تملك NGS نفس القيود المفروضة على الحساسية المنخفضة، وقوة الاكتشاف، والإنتاجية. فائدة أخرى من NGS هو قدرته على الكشف عن مجموعة متنوعة من الطفرات من تعدد الأشكال النيوكليوتيدية واحدة (SNPs) لإعادة ترتيب. ومع ذلك، فإن نظام المعلومات غير الحكومية هو طريقة أكثر تكلفة وتستغرق وقتا طويلا في تطبيق تحديد ال indels المرتبطة ب Cas9/gRNA لأنه لا يوجد سوى منطقة مستهدفة واحدة ذات أهمية، وهي الأنسب للتحليلات الأكبر على نطاق الجينوم. بالمقارنة مع الأساليب المذكورة أعلاه ، ddPCR هو الإنتاجية العالية ولها وقت سريع بدوره حولها. إذا كانت مواد وأدوات ddPCR متوفرة داخليا ، يمكن معالجة 96 عينة في غضون 1-2 يوم ، مما يجعلها مناسبة تماما للتحليل السريع للتجارب الكبيرة للكائنات المعدلة Cas9 /gRNA.
في حين أن العديد من الفوائد موجودة لddPCR هناك أيضا قيود. أولا، معدات ddPCR غير متوفرة في كثير من الأحيان في بيئة مختبرية مستقلة. قد تكون معدات ddPCR متاحة بشكل جماعي في مؤسسات البحث الأكبر ، ولكن هذا لا يسمح بسهولة توليد البيانات وتحليلها خارج المؤسسة. ثانيا، على عكس البدائل، لا يوفر ddPCR التسلسلات الفريدة الفردية لطفرات indel المحددة. وسيوفر ثنائي الفينيل متعدد الكلور الرقمي القطرة تكرار طفرات إنديل داخل السكان، ولكن بدون التسلسل، لا يمكن للمرء أن يحدد ما إذا كان من المرجح أن تحافظ الهندباء الموجودة على وظيفة الجين ذات الاهتمام أو تمنعها. ولعل طريقة ddPCR هي الأنسب لتحليل المجموعات البرية بعد تجربة إطلاق حقل لكائن محرك أقراص يستند إلى Cas9/gRNA لأنه يمكن أن يحدد بكفاءة وتيرة إدخال المتحول إلى السكان الأصليين وتوليد indels داخل السكان في وقت قريب من الوقت الحقيقي. ونظرا لسرعة وقت التحول في تقرير التنمية المستدامة، سيكون من الممكن إجراء أخذ العينات وتحليل السكان في منطقة التجارب الميدانية أسبوعيا إذا كانت المواد متاحة محليا. وستكون تكاليف بدء شراء واستيراد وإعداد معدات DDPCR مرتفعة في المختبرات النائية ولكن فوائد القدرة على تقييم السكان البريين بدقة لأنها تخضع للتعديل من نظام القيادة تبرر التكاليف.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقدمت مبادرة جامعة كاليفورنيا إيرفين لمكافحة الملاريا التمويل. AAJ هو أستاذ دونالد برين في جامعة كاليفورنيا، إيرفين.
Materials
| Reagents | |||
| ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
| DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| EDTA (pH 8.0) | Invitrogen | AM9260G | |
| Ethanol, 200 Proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| Isopropanol (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | A416-500 | |
| Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| PCR-grade Water | Any certified PCR-grade water can be used | ||
| Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| Proteinase K 20 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| Materials | |||
| ddPCR 96-Well Plate | Bio-Rad | 12001925 | |
| Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| Droplet Generation Oil for probes | Bio-Rad | 1863005 | |
| Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes) | Sigma-Aldrich | N/A | Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Forward and Reverse oligonucleotide primers | Sigma-Aldrich | N/A | Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Equipment | |||
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well |
References
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
- Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34, 78-83 (2016).
- Courtier-Orgogozo, V., Morizot, B., Boëte, C. Agricultural pest control with CRISPR-based gene drive: time for public debate: Should we use gene drive for pest control. EMBO Reports. 18 (6), 878-880 (2017).
- Carballar-Lejarazú, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553 (2020).
- Wang, Z., et al. Comparison of droplet digital PCR and direct Sanger sequencing for the detection of the BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinoma. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 33 (6), 22902 (2019).
- Dong, L., Wang, S., Fu, B., Wang, J. Evaluation of droplet digital PCR and next generation sequencing for characterizing DNA reference material for KRAS mutation detection. Scientific Reports. 8 (1), 9650 (2018).
- Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR_Cas9 induced mutations using next-generation sequencing. BMC Genomics. 15 (1), 1002 (2014).
- Carballar-Lejarazú, R., Kelsey, A., Pham, T. B., Bennett, E. P., James, A. A. Digital droplet PCR and IDAA for the detection of CRISPR indel edits in the malaria species Anopheles stephensi. Biotechniques. 68 (4), 172-179 (2020).
- Holt, R. A., et al. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298 (5591), 129-149 (2002).
