Digital-Droplet PCR per rilevare mutazioni di Indels in popolazioni di zanzare anofeline geneticamente modificate
Summary
Questo protocollo fornisce le fasi dall’estrazione del DNA al set-up sperimentale per la PCR a goccia digitale (ddPCR), compresa l’analisi per l’identificazione e la quantificazione di eventi di giunzione finale non omologa (NHEJ) nei siti bersaglio a seguito di scissione Cas9 indotta da gRNA e riparazione del DNA. Altri usi di questo metodo includono applicazioni come il rilevamento del polimorfismo e la verifica delle varianti di modifica genetica.
Abstract
I recenti progressi nella genomica delle zanzare e nelle tecnologie di ingegneria genetica hanno favorito la necessità di metodi rapidi ed efficienti per rilevare variazioni mirate della sequenza di DNA su larga scala. In particolare, il rilevamento di inserzioni e delezioni (indels) in siti geneticamente modificati generati da CRISPR guide RNA (gRNA)/Cas9-mediated non-omologo end-joining (NHEJ) è importante per valutare la fedeltà della mutagenesi e la frequenza dei cambiamenti non intenzionali. Descriviamo qui un protocollo per la PCR a goccia digitale (ddPCR) che è adatto per l’analisi NHEJ ad alto rendimento. Sebbene questo metodo non produca dati che identifichino la variazione della singola sequenza, fornisce una stima quantitativa della variazione della sequenza all’interno di una popolazione. Inoltre, con risorse appropriate, questo protocollo può essere implementato in un ambiente di laboratorio sul campo più facilmente rispetto al sequenziamento di nuova generazione o Sanger. ddPCR ha anche un tempo di risposta più rapido per i risultati rispetto a uno di questi metodi, che consente un’analisi più rapida e completa della variazione genetica nelle popolazioni selvatiche durante le prove sul campo di organismi geneticamente modificati.
Introduction
I gene drive hanno un immenso potenziale per controllare le popolazioni di insetti di rilevanza medica e agricola1,2,3,4,5. Ad esempio, i sistemi di gene-drive basati su nucleasi CRISPR Cas e RNA guida (gRNA) possono essere utilizzati per modificare le popolazioni di zanzare vettori introducendo tratti che conferiscono refrattarietà ai parassiti della malaria portando a una ridotta trasmissione e meno malattie1,4,5. Il sistema di gene-drive copia se stesso e il tratto associato da un cromosoma omologo a un altro nelle cellule germinali pre-meiotiche, e questo assicura che la maggior parte della prole erediti l’unità e crei il potenziale per una modifica duratura e sostenibile della popolazione sul campo. Tuttavia, uno svantaggio dei metodi basati su Cas/gRNA è la possibilità di generare mutazioni di inserzione e delezione (indel) attraverso la riparazione del DNA non omologo (NHEJ), con conseguente generazione di alleli resistenti all’unità, che se accumulati ad una frequenza abbastanza elevata nella popolazione, possono impedire al sistema di azionamento di diffondersi1,2,3,4 . Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo affidabile e ad alto rendimento in grado di determinare la prevalenza e la quantità relativa di mutazioni indel, sia a livello di popolazione che individuale, durante il gene drive basato su Cas / gRNA.
I metodi di sequenziamento di nuova generazione (NGS) forniscono una risoluzione di sequenziamento senza precedenti. Tuttavia, i costi e i requisiti tecnici associati all’NGS vietano i test di routine e ne limitano l’uso come metodo ad alto rendimento per valutare gli indels6,7,8. I metodi tradizionali di quantificazione pcr sono stati a lungo utilizzati come procedura di valutazione standard per gli indel del genoma; tuttavia, questi metodi sono laboriosi, richiedono molto tempo per procurarsi i dati e hanno un alto grado di variabilità. La Digital-Droplet PCR (ddPCR) ha dimostrato di essere più sensibile nel rilevare le mutazioni rispetto al sequenziamento Sanger in alcune applicazioni e ha un limite di rilevazione inferiore rispetto all’NGS in altre6,7,8,9. Inoltre, il costo per valutare un set di campioni e il tempo di risposta per ottenere risultati è meno costoso e più veloce, rispettivamente, per la ddPCR rispetto al sequenziamento Sanger o NGS9. Utilizzando un sistema a doppia sonda, il test Drop-Off identifica gli alleli NHEJ in base all’assenza di sequenza wild-type (WT) nel sito di taglio Cas9 bersaglio diretto al gRNA. In questo test, un breve amplicon che include il sito di taglio previsto del sistema basato su Cas / gRNA viene amplificato con una coppia di primer specifica. Una sonda fluorescente è progettata per legarsi a una regione conservata dell’amplicon e un’altra sonda fluorescente riconosce la sequenza WT del sito di taglio. In presenza di un allele NHEJ, quest’ultimo non si legherà all’amplicon.
L’uso di ddPCR fornisce la possibilità di progettare primer per delezioni mirate, differenze e inserzioni di singole coppie di basi, che consentiranno la profilazione NHEJ nelle analisi della popolazione di zanzare9. Date queste caratteristiche interessanti, abbiamo creato un protocollo per ddPCR per il rilevamento ad alto rendimento di indels generati da un sistema di gene-drive basato su Cas / gRNA nelle zanzare.
Protocol
Representative Results
Discussion
La PCR a goccioline digitali è un metodo efficace per determinare la presenza di alleli indel derivanti da eventi NHEJ in un sistema di gene-drive basato su Cas/gRNA e consente la quantificazione della frequenza di questi alleli in individui o popolazioni. Alcuni passaggi del protocollo devono essere seguiti con particolare attenzione per ottenere risultati affidabili. In primo luogo, l’estrazione del DNA genomico deve essere eseguita con attenzione per garantire un’alta qualità e una quantità sufficiente. Una buona estrazione consentirà una determinazione accurata delle copie del genoma aploide per reazione. Nella nostra esperienza, un kit disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali)ha fornito estrazioni di DNA costantemente di alta qualità. Tuttavia, le estrazioni di singole zanzare possono rivelarsi particolarmente impegnative in quanto il pellet di DNA diventa difficile da visualizzare e può essere facilmente risucchiato con il surnatante se non attenzione. In secondo luogo, primer e sonde devono essere progettati con attenzione. Prima di completare l’esperimento ddPCR, assicurarsi che i primer progettati si traducano in un singolo prodotto PCR eseguendo prima una PCR tradizionale e visualizzando un singolo prodotto tramite elettroforesi su gel. Anche la sonda FAM di riferimento deve essere progettata in modo da essere complementare a una sequenza altamente conservata. Ciò garantirà rilevamenti accurati degli alleli WT in una popolazione diversificata. Le combinazioni primer/sonda per ogni esperimento unico avranno condizioni di termociclatore diverse e si consiglia di ottimizzare tali condizioni utilizzando un gradiente termico.
Esistono altri metodi per identificare gli indel, come il sequenziamento Sanger o NGS. Il sequenziamento con metodo Sanger è limitato perché ha un limite inferiore di rilevamento e un basso potere di scoperta per identificare nuove varianti. Anche il sequenziamento con metodo Sanger richiede un uso intensivo del lavoro e non è ad alta produttività. Rispetto al sequenziamento Sanger, NGS non ha le stesse limitazioni di bassa sensibilità, potenza di scoperta e throughput. Un altro vantaggio di NGS è la sua capacità di rilevare una varietà di mutazioni dal polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) ai riarrangiamenti. Tuttavia, NGS è un metodo più costoso e dispendioso in termini di tempo nell’applicazione della determinazione degli indel associati a Cas9 / gRNA perché esiste solo una regione target di interesse ed è più adatto per analisi più ampie a livello di genoma. Rispetto ai metodi di cui sopra, ddPCR è ad alto throughput e ha un tempo di risposta rapido. Se i materiali e gli strumenti ddPCR sono disponibili internamente, 96 campioni possono essere elaborati entro 1-2 giorni, rendendolo adatto per l’analisi rapida di grandi prove di organismi modificati Cas9 / gRNA.
Mentre esistono molti vantaggi per ddPCR ci sono anche limitazioni. In primo luogo, l’apparecchiatura ddPCR non è spesso disponibile in un ambiente di laboratorio indipendente. Le apparecchiature ddPCR possono essere disponibili in comune presso istituti di ricerca più grandi, ma ciò non consente una facile generazione e analisi dei dati al di fuori dell’istituzione. In secondo luogo, a differenza delle alternative, la ddPCR non fornisce le singole sequenze uniche di mutazioni indel identificate. La PCR a goccioline digitali fornirà la frequenza delle mutazioni indel all’interno di una popolazione, ma senza la sequenza, non si può determinare se gli indel presenti hanno maggiori probabilità di conservare o inibire la funzione del gene di interesse. Il metodo ddPCR è forse più adatto per analizzare le popolazioni selvatiche dopo una prova sul campo di rilascio di un organismo di guida basato su Cas9 / gRNA perché può determinare in modo efficiente la frequenza di introduzione del transgene nella popolazione nativa e la generazione di indels all’interno della popolazione quasi in tempo reale. A causa del rapido tempo di risposta ddPCR, sarebbe possibile eseguire il campionamento e analizzare la popolazione in una regione di prova sul campo settimanalmente se i materiali fossero disponibili localmente. I costi di avviamento per l’acquisto, l’importazione e l’installazione dell’apparecchiatura ddPCR sarebbero elevati nei laboratori remoti, ma i vantaggi di essere in grado di valutare rigorosamente una popolazione selvatica in quanto è in fase di modifica da un sistema di azionamento giustificherebbero i costi.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il finanziamento è stato fornito dalla University of California Irvine Malaria Initiative. AAJ è donald bren professor presso l’Università della California, Irvine.
Materials
| Reagents | |||
| ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
| DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| EDTA (pH 8.0) | Invitrogen | AM9260G | |
| Ethanol, 200 Proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| Isopropanol (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | A416-500 | |
| Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| PCR-grade Water | Any certified PCR-grade water can be used | ||
| Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| Proteinase K 20 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| Materials | |||
| ddPCR 96-Well Plate | Bio-Rad | 12001925 | |
| Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| Droplet Generation Oil for probes | Bio-Rad | 1863005 | |
| Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes) | Sigma-Aldrich | N/A | Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Forward and Reverse oligonucleotide primers | Sigma-Aldrich | N/A | Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Equipment | |||
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well |
References
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