Tek Taraflı Siyatik Sinir Ezilme Yaralanması Sonrası Sıçanlarda Motor Davranışın Multifaktöriyel Değerlendirilmesi
Summary
Siyatik sinir ezilme yaralanmasından sonra sıçanlarda davranışsal test pili ile motor davranışın değerlendirilmesi için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Periferik sinir hasarının indüksiyonu, diğerleri arasında onarım ve ağrı mekanizmalarının değerlendirilmesi için nörobilimde yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Ek olarak, hareket bozuklukları araştırma alanında, siyatik ezilme yaralanması, distoninin genetik olarak yatkın DYT-TOR1A kemirgen modellerinde distoni benzeri bir fenotipi tetiklemek için almıştır. Siyatik sinir ezilme yaralanmasından sonra tutarlı, tekrarlanabilir ve karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için, standartlaştırılmış fenotipik karakterizasyona ek olarak, sinir ezilmesini teşvik etmek için standartlaştırılmış bir yöntem gereklidir. Sadece belirli davranışsal test çeşitlerine değil, aynı zamanda teknik gereksinimlere, doğru yürütmeye ve ardışık veri analizine de dikkat edilmelidir. Bu protokol, siyatik sinir ezilme yaralanmasının nasıl gerçekleştirildiğini ayrıntılı olarak açıklar ve sıçanlarda motor açıklarının değerlendirilmesi için açık alan testi, CatWalk XT yürüyüş analizi, ışın yürüme görevi ve merdiven basamak yürüyüş görevini içeren bir davranışsal test pili sağlar.
Introduction
Kemirgenler, birden fazla biyolojik düzeyde hipotezleri test ederek insan hastalıkları1,2’nin anlaşılmasını derinleştirmek için mükemmel model organizmalardır. Kemirgen modellerinin karakterizasyonu için temel biyolojik düzeylerden biri, davranışsal değerlendirmelerle ölçülen fenotip seviyesidir. Hayvan modeline ve bilimsel araştırma sorusuna bağlı olarak, güçlü ve güvenilir bir davranışsal test pilinin seçimi, Parkinson hastalığı ve distoni 3 ,4,5,6hayvan modelleri gibi çok çeşitli davranışsal yönleri kapsamak için gereklidir.
Siyatik sinir, duyusal liflerin yanı sıra motor ile insan vücudundaki en büyük sinirdir. Siyatik sinirinin yaralanmaları trafik kazaları ve ameliyatlar gibi çeşitli olaylardan kolayca sonuçlanabilir7,8. Bu nedenle, siyatik sinir yaralanmaları olan kemirgen modellerini kullanan araştırma faaliyetleri, çevirisel olarak ilgili değerdedir. Sinir yenilenmesinin sıçandan insana çevirisel yönü eleştirel olarak ele alınması gerekse de9Kemirgen modellerinde siyatik sinir ezilme yaralanması (axonotmesis), periferik sinirlerin dejenerasyon ve rejenerasyon süreçlerini analiz etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir10,11. Ezilme yaralanması durumunda sinir tamamen transected değildir. Aksona zarar verir, ezilme yaralanmasından hemen sonra iletim bloğuna neden olur ve ardından rejeneratif süreçler 4,12,13.
Ayrıca, distoni araştırmalarında, tek taraflı siyatik sinir ezilme yaralanması, genetik olarak yatkın distoni kemirgen modellerinde distoni benzeri hareketleri (DLM) tetiklemek için yerleşik bir yöntemdir, bu da DLM’yi 4,14başına göstermez. Periferik sinir travmasının motor ve duyusal fonksiyonlardan sorumlu siyatik sinir liflerini etkileyerek sensorimotor entegrasyonunu bozduğ varsayılıyor15.
Burada, siyatik sinirin standartlaştırılmış bir ezilme yaralanması ve açık alan testi (OFT), CatWalk XT yürüyüş analizi, ışın yürüyüş görevi ve naif vahşi tip (wt) sıçanlarda (n= 8-9) ve wt sıçanlarında tek taraflı siyatik sinir ezilme yaralanmasından beş hafta sonra (n= 10) oluşan bir motor davranış değerlendirmesi pili için ayrıntılı bir açıklama sunuyoruz. OFT, genel lokomotor aktivitesi hakkında bilgi sağlarken, otomatik yürüyüş analiz sistemi CatWalk XT tarafından ayrıntılı bir yürüyüş analizi elde edilir. Kiriş yürüme görevi, kirişi geçme süresini ve ayak yerleştirme hatalarının sayısını değerlendirerek motor koordinasyonunu değerlendirmek için kullanılır. Yürüyüş performans analizi için merdiven basamak yürüyüş görevi, ayak veya pençe yerleşimi ve sabit ama düzensiz bir basamak desenli yatay merdiven basamak aparatındaki hatalar hakkında bilgi verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu davranışsal değerlendirme protokolü, siyatik sinir ezilme yaralanmasından sonra kemirgen modelinde seçilen davranışsal test pilinin olası okumalarının yanı sıra avantajlara ve dezavantajlara genel bir bakış sağlar.
Siyatik sinir ezilme yaralanmasının karşılaştırmalı bir sonucunu elde etmek için tutarlı bir ezme tekniği zorunludur. Tırtıksız kelepçe (Ultra İnce Hemostat) yerine uzun tırtıklı kelepçe kullanılması ezilmenin kıvamını artırabilir. Eşit sinir sıkışmasını garanti etmek için aynı kelepçeyi ve aynı ezilme pozisyonunu kullanın. Kelepçenin ezilme yaralanması ve kelepçenin özenle işlenmesi için özel kullanımı tutarlılığı artırır. Ayrıca, ezilme yaralanması prosedürünü dikkatli bir şekilde gerçekleştirin. Ameliyat sırasında sinirin istenmeyen çekişi gibi ek hasarlar otomutilasyon gibi istenmeyen yan etkilere yol açabilir. Bu nedenle, dikkatli bir sinir hazırlığının yanı sıra en az iki gün boyunca bir ağrı kesicinin kullanılması önerilir.
Motor davranışın multifaktöriyel değerlendirmesi, çeşitli seviyelerdeki sıçanlarda sinir ezilme yaralanmasından sonra fenotipi karakterize edebilir. OFT, CatWalk XT yürüyüş analizi, ışın yürüyüşü görevi ve merdiven basamak yürüyüş görevini kullandık. Bu deneyler için kör bir deneysel prosedür ve deneysel gruplara veri analizi şarttır. Davranış değerlendirmesinden önce, hayvanlar test odasında en az 30 dakika boyunca test koşulları altında alıştırıldı. Burada uygulanan tüm davranış testleri, yiyecek veya su yoksunluğunun gerekli olmadığı avantajına sahiptir. Açıklanan tüm davranış testlerinde aynı hayvan grubu kullanılmıştır. Her hayvan için günde en fazla iki farklı davranış testi yapıldı. Davranış testleri düzenli aralıklarla yapılırsa, testin aynı hayvan düzeninde ve günün aynı saatinde yapılması gibi karşılaştırılabilir bir prosedüre dikkat edin. Davranış analizi için bir diğer önemli husus da sıçanların gece-gündüz döngüsüdür. Gün döngüsünde (karanlık döngü) daha doğal ve daha yüksek aktivite seviyeleri elde etmek için ters bir gündüz-gece döngüsü düşünün. Bu, özellikle OFT gibi spontan davranışların ölçümü için düşünülmalıdır. Bu deneyde, tersine çevrilmiş bir gündüz-gece döngüsü uygulanamadı, ancak test koşullarına yeterli bir iklimlendirme sağlandı. Kiriş yürüyüşü görevi ve merdiven basamak yürüyüş görevi için yüksek çözünürlüklü videolar için mükemmel bir aydınlatma gereklidir. Karanlıkta deneyler yapılırken bu yüksek video kalitesine ulaşılamıyor.
Yürüyüşün değerlendirilmesi sürekli bir görev performansı gerektirir. Sürekli bir görev performansının ilk önemli yönü, hayvanları kurulumu geçmeye ikna etmektir. Motivasyonunu artırmak için, kurulumun sonuna küçük gıda peletleri (45 mg) yerleştirin. Hayvanların yiyecek peletlerine aşina olmaları için, peletler testten önce onlara beslenmelidir. Ayrıca, kurulumun sonundaki bir gol kutusu yardımcı olabilir. CatWalk’un kurulumu zaten bir gol kutusu içeriyor, ancak sıçanlar bazen gol kutusuna girmekte tereddüt ediyor. Alternatif olarak, kale kutusuna küçük bir kafes ekleyebilirsiniz, ancak sıçanlardan gelen ev kafesi kale kutusuna sığmaz. Sıçanın elde etmeden önce birkaç dakika kafeste alışkanlık haline getirin. Ayrıca, aynı ev kafesinden başka bir sıçan kale kutusuna veya gol kutusunun içindeki kafese yerlenebilir. İkinci sıçanın kutuda kaldığından ve kale kutusuna girişi engellemediğinden emin olun. Ayrıca, gol kutusunu CatWalk sisteminden çıkarmak ve sıçanın her koşudan sonra “ev bölgelerine” girmesini sağlayan sıçan ev kafesini yürüyüş yolunun sonuna yerleştirmek de mümkündür. Kiriş yürüyüş görevinin kurulumu ve merdiven basamak yürüyüş görevi için, kurulumun sonuna bir gol kutusu veya ev kafesi eklemenizi öneririz. Tutarlılık sağlamak için, CatWalk, kiriş yürüyüş görevi ve merdiven basamak yürüyüş görevi haftada en az bir kez altı ila on koşu ile yapılmalıdır.
Her analiz bu çalışmada önemli farklılıklar yaratmasa da, genetiği değiştirilmiş hayvanların veya tedavi gruplarının dahil edilmesinin, grupları aynı davranış testlerinden ayırt edebilecek değerli veriler üretebileceğini düşünün.
Sinir ezilme yaralanmasının, beş dakikalık bir OFT ile ölçülen sıçanın lokomotor aktivitesi üzerinde hiçbir etkisi olmadı. Catwalk XT yürüyüş analizi, yürüyüş, pençe ve burun yerleşimini analiz etmek için daha objektif ve hassas bir araçtır. Yoğun bir eğitimden sonra, sıçanlar CatWalk XT cihazının yürüyüş yolundan varsayılan ayarlara geçmeyi öğrenirler. Sinir hasarı, sıçanların geçiti geçme yeteneğini azaltmaz. Çeşitli parametrelerin otomatik hesaplanması verileri objektif olarak sunar. “İnteraktif Ayak İzi Ölçümleri” modülü kullanılarak ek bilgiler elde edilebilir ve gerçekten de bu analizler, sinir hasarı olan ve olmayan sıçanları karşılaştırarak vücut eksenine ayak izi yayılımı, baskı uzunluğu ve pençe açısının çeşitli parametrelerinde önemli farklılıklar sağladı.
Sıçanlar ışın yürüyüşü görevi için kolayca eğitilebilir. Işını geçmek için gecikme süresindeki ve sinir yaralı hindlimb’in adım başına ayak kayması sayısındaki farklılıklar, naif ile ezilmiş sıçanlar karşılaştırılarak tespit edildi. Işın yürüme görevi ile sinir yaralı sıçanları analiz etmenin bir dezavantajı kirişin büyüklüğüdür. Siyatik sinir ezilme yaralanmasından sonraki ilk iki hafta içinde, sıçanların dengeleri bozuldukça kirişi geçmek için yardıma ihtiyaçları vardır. Bazı sıçanlar kirişi geçebilse de, düşmenin neden olduğu yaralanma riski yüksektir. Bu nedenle sinir ezilmiş hayvanlar, siyatik sinir ezilme yaralanmasından sonraki ilk iki hafta veya gerekirse daha uzun süre kirişi geçmelerine yardımcı olmalıdır. Ancak, yardımlı ve yardımsız çalıştırmaları karşılaştırmak zordur. Ayrıca, motor dengesi ışın yürüme görevi tarafından değerlendirilen önemli bir parametredir. Bu parametrenin sinir ezilme sıçanı modelimizle ilgili olmadığını düşündük. Bu nedenle, Ohwatashi ve arkadaşları tarafından açıklanan puanlar kullanılamadı ve tamamlanmamış bir ışın geçişi ile çalıştırmalar veri analizi için hariç tutuldu18,19.
Metz ve ark.’dan 7 kategorili ölçek, hem ön hem de arka ayakları analiz edebilir ve merdiven basamak yürüyüş görevi16 , 17sırasında tüm uzuvların hatalarının farklı önem düzeylerini ayırt edebilir. 0’dan 2’ye kategorileri içeren en belirgin hataları analiz ederek, sinirden yaralanan wt sıçanlarını naif wt sıçanlarla karşılaştırırken arka planda adım başına hata farkı tespit edilemedi. Ayrıca, merdiven basamak aparatını geçmenin gecikme süresi sinirden yaralanmış wt sıçanları ve wt naif sıçanlar arasında farklılık göstermedi. Derin öğrenme modelleri, otomatik bir yaklaşımla merdiven basamak yürüyüş görevinin veri analizini geliştirebilir ve hızlandırabilir.
Sinir ezilme yaralanmasının yanı sıra açıklanan tüm davranış testlerinin, kurulumların ayarlarını ve boyutlarını uyarlayarak farelere kolayca çevrilebileceğini belirtmek önemlidir. Farelerin model organizma olarak kullanılması, birçok insan hastalığı için transgenik modellerin var olduğu yararlı etkiye sahiptir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (BMBF DysTract to C.W.I.) ve Würzburg Üniversitesi Disiplinlerarası Klinik Araştırmalar Merkezi (IZKF) (N-362 ila C.W.I.; Z2-CSP3’den L.R.’ye). Buna ek olarak, bu proje Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programından EJP RD COFUND-EJP N° 825575 (EurDyscover’dan J.V.’ye) ve VERUM Vakfı’ndan fon almıştır. Ayrıca C.W.I., Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Reseach Foundation) Project-ID 424778381-TRR 295, Deutsche Stiftung Neurologie ve ParkinsonFonds tarafından finanse edilmektedir. L.R. ayrıca Dystonia Medical Reseach Foundation tarafından desteklenmektedir.
Yazarlar Keali Röhm, Veronika Senger, Heike Menzel ve Louisa Frieß’e teknik yardımları için ve hayvan bakımı için Helga Brünner’e teşekkür ediyorlar.
Materials
| Acetic acid, ≥99.8% | Sigma-Aldrich | 33209-1L | |
| Appose ULC skin stapler 35W | Covidien | 8886803712 | |
| Beam | self made | ||
| Bepanthen eye cream | Bayer Vital GmbH | 81552983 | |
| Box for OFT | self made | ||
| Camcorder GC-PX100 | JVC | ||
| Catwalk XT | Noldus | setup and software | |
| Chamber for isofluran | GT-Labortechnik | custom made | |
| Disposable scalpel No. 11 | Feather | 20.001.30.011 | |
| Dräger Vapor 19.3 isoflurane system | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Dumont #2 – laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | super-fine |
| Dustless precision pellets 45 mg | Bio-Serv | F0021 | |
| EthoVision XT | Noldus | setup and software | |
| Forceps 160 mm | Hartenstein | PZ09 | |
| Gas anesthesia mask, rat | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Goal box for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Hair clipper Magnum 5000 | Wahl GmbH | ||
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Heating table | MEDAX | 13801 | |
| Isofluran CP 1ml/ml, 250 ml | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
| Kinovea | www.kinovea.org | ||
| Ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Needleholder | KLS Martin | 20-526-14-07 | |
| Octeniderm | Schülke | 118211 | |
| Rimadyl 50 mg/ml, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
| Rubber band retractors | self made | ||
| Spacer for beam | self made | ||
| Spacer for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Suture Silkam 4/0 DS 19 | B. Braun | C0762202 | |
| Ultra fine hemostats (non-serrated clamp) | Fine Science Tools | 13020-12 |
References
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats. Disease Models & Mechanisms. 2 (5-6), 206-210 (2009).
- Phifer-Rixey, M., Nachman, M. W. Insights into mammalian biology from the wild house mouse Mus musculus. Elife. 4, (2015).
- Musacchio, T., et al. Subthalamic nucleus deep brain stimulation is neuroprotective in the A53T alpha-synuclein Parkinson’s disease rat model. Annals of Neurology. 81 (6), 825-836 (2017).
- Ip, C. W., et al. Tor1a+/- mice develop dystonia-like movements via a striatal dopaminergic dysregulation triggered by peripheral nerve injury. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 108 (2016).
- Rauschenberger, L., et al. Striatal dopaminergic dysregulation and dystonia-like movements induced by sensorimotor stress in a pharmacological mouse model of rapid-onset dystonia-parkinsonism. Experimental Neurology. 323, 113109 (2020).
- Klein, A., Wessolleck, J., Papazoglou, A., Metz, G. A., Nikkhah, G. Walking pattern analysis after unilateral 6-OHDA lesion and transplantation of foetal dopaminergic progenitor cells in rats. Behavioural Brain Research. 199 (2), 317-325 (2009).
- Kim, D. H., Murovic, J. A., Tiel, R., Kline, D. G. Management and outcomes in 353 surgically treated sciatic nerve lesions. Journal of Neurosurgery. 101 (1), 8-17 (2004).
- Kline, D. G., Kim, D., Midha, R., Harsh, C., Tiel, R. Management and results of sciatic nerve injuries: a 24-year experience. Journal of Neurosurgery. 89 (1), 13-23 (1998).
- Kaplan, H. M., Mishra, P., Kohn, J. The overwhelming use of rat models in nerve regeneration research may compromise designs of nerve guidance conduits for humans. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 26 (8), 226 (2015).
- Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis. Journal of Visualized Experiments. (60), e3606 (2012).
- Savastano, L. E., et al. Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. Journal of Neuroscience Methods. 227, 166-180 (2014).
- Menorca, R. M., Fussell, T. S., Elfar, J. C. Nerve physiology: mechanisms of injury and recovery. Hand Clinics. 29 (3), 317-330 (2013).
- Luis, A. L., et al. Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat. Microsurgery. 28 (6), 458-470 (2008).
- Knorr, S., et al. The evolution of dystonia-like movements in TOR1A rats after transient nerve injury is accompanied by dopaminergic dysregulation and abnormal oscillatory activity of a central motor network. Neurobiology of Disease. , 105337 (2021).
- Quartarone, A., Hallett, M. Emerging concepts in the physiological basis of dystonia. Movement Disorders. 28 (7), 958-967 (2013).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: a scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Johansson, B. B., Ohlsson, A. L. Environment, social interaction, and physical activity as determinants of functional outcome after cerebral infarction in the rat. Experimental Neurology. 139 (2), 322-327 (1996).
- Ohwatashi, A., Ikeda, S., Harada, K., Kamikawa, Y., Yoshida, A. Exercise enhanced functional recovery and expression of GDNF after photochemically induced cerebral infarction in the rat. EXCLI Journal. 12, 693-700 (2013).
