Multifactoriële beoordeling van motorisch gedrag bij ratten na unilaterale ischias zenuw crush letsel
Summary
We bieden een protocol voor de beoordeling van motorisch gedrag via een gedragstestbatterij bij ratten na ischias zenuwverpletteringsletsel.
Abstract
De inductie van een perifere zenuwbeschadiging is een veel gebruikte methode in de neurowetenschappen voor de beoordeling van onder andere reparatie- en pijnmechanismen. Bovendien is op het gebied van bewegingsstoornissen is ischiasverpletteringsletsel gebruikt om een dystonie-achtig fenotype te activeren in genetisch gepredisponeerde DYT-TOR1A knaagdiermodellen van dystonie. Om consistente, reproduceerbare en vergelijkbare resultaten te bereiken na een ischias zenuwverpletteringsletsel, is een gestandaardiseerde methode voor het induceren van de zenuwverplettering essentieel, naast een gestandaardiseerde fenotypische karakterisering. Er moet niet alleen aandacht worden besteed aan het specifieke assortiment gedragstests, maar ook aan de technische vereisten, de juiste uitvoering en opeenvolgende gegevensanalyse. Dit protocol beschrijft in detail hoe een heupzenuwverpletteringsletsel moet worden uitgevoerd en biedt een gedragstestbatterij voor de beoordeling van motorische tekorten bij ratten, waaronder de open veldtest, de CatWalk XT-ganganalyse, de balkwandeltaak en de ladderlooptaak.
Introduction
Knaagdieren zijn uitstekende modelorganismen om het begrip van menselijke ziekten te verdiepen1,2 door hypothesen op meerdere biologische niveaus te testen. Een fundamenteel biologisch niveau voor de karakterisering van knaagdiermodellen is het fenotypeniveau, gemeten aan de hand van gedragsbeoordelingen. Afhankelijk van het diermodel en de wetenschappelijke onderzoeksvraag is de selectie van een krachtige en betrouwbare gedragstestbatterij essentieel om een breed scala aan gedragsaspecten te behandelen, zoals voor diermodellen van de ziekte van Parkinson en dystonie3,4,5,6.
De heupzenuw is de grootste zenuw in het menselijk lichaam met motorische en zintuiglijke vezels. Verwondingen van de heupzenuw kunnen gemakkelijk het gevolg zijn van een verscheidenheid aan gebeurtenissen, zoals verkeersongevallen en operaties7,8. Daarom zijn onderzoeksactiviteiten met knaagdiermodellen met ischiaszenuwletsels van translationele relevante waarde. Hoewel het translationele aspect van zenuwregeneratie van rat naar mens kritisch moet worden beschouwd9, is de ischiaszenuwverpletteringsletsel (axonotmesis) in knaagdiermodellen een veelgebruikte methode om degeneratie – en regeneratieprocessen van perifere zenuwen te analyseren10,11. In geval van een verbrijzelingsletsel is de zenuw niet volledig doorgetranseceerd. Het beschadigt het axon, wat resulteert in geleidingsblok direct na verbrijzelingsletsel gevolgd door regeneratieve processen 4,12,13.
Bovendien is in dystonieonderzoek de unilaterale ischiaszenuwverpletteringsletsel een gevestigde methode om dystonie-achtige bewegingen (DLM) te activeren in genetisch gepredisponeerde dystonie knaagdiermodellen, die geen DLM per se4,14vertonen . Aangenomen wordt dat het perifere zenuwtrauma de sensorimotorische integratie verstoort door de ischiaszenuwvezels aan te tasten, die verantwoordelijk zijn voor motorische en sensorische functies15.
We geven hier een gedetailleerde beschrijving voor een gestandaardiseerde verbrijzelingsblessure van de heupzenuw en een batterij motorische gedragsbeoordelingen die bestaat uit de open veldtest (OFT), CatWalk XT-ganganalyse, balkwandeltaak en ladderlooptaak bij naïeve wilde type (wt) ratten (n = 8-9) en wt ratten vijf weken na unilaterale ischiaszenuwverpletteringsletsel (n = 10). De OFT geeft informatie over de algemene motorische activiteit, terwijl een gedetailleerde ganganalyse wordt bereikt door het geautomatiseerde ganganalysesysteem CatWalk XT. De balklooptaak wordt gebruikt om de motorcoördinatie te beoordelen door de tijd te evalueren om de balk over te steken en het aantal voetplaatsingsfouten. Voor loopprestatiesanalyse geeft de ladderlooptaak informatie over voet- of pootplaatsing en fouten op een horizontaal ladderloopapparaat met een constant maar onregelmatig looppatroon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit gedragsbeoordelingsprotocol biedt een overzicht van voor- en nadelen en mogelijke uitlezingen van de geselecteerde gedragstestbatterij in een knaagdiermodel na ischiaszenuwverpletteringsletsel.
Om een vergelijkende uitkomst van de ischias zenuwverpletteringsblessure te verkrijgen, is een consistente verbrijzelingstechniek verplicht. Het gebruik van een niet-gekartelde klem (Ultra Fine Hemostat) in plaats van een tang kan de consistentie van de crush verbeteren. Gebruik dezelfde klem en dezelfde verbrijzelingspositie om gelijke zenuwcompressie te garanderen. Het exclusieve gebruik van de klem voor het verbrijzelen en voorzichtig hanteren van de klem verbetert de consistentie. Voer ook de procedure van het verbrijzelingsletsel met zorg uit. Extra schade aan de zenuw tijdens de operatie, zoals ongewenste tractie van de zenuw, kan leiden tot ongewenste bijwerkingen zoals automutilatie. Daarom wordt een zorgvuldig zenuwpreparaat en een toediening van een pijnstiller gedurende minimaal twee dagen aanbevolen.
Multifactoriële beoordeling van motorisch gedrag kan het fenotype karakteriseren na zenuwverpletteringsletsel bij ratten op verschillende niveaus. We gebruikten de OFT, CatWalk XT ganganalyse, beam walking task en ladder rung walking task. Een geblindeerde experimentele procedure en data-analyse voor experimentele groepen is essentieel voor deze experimenten. Vóór de gedragsbeoordeling werden dieren gedurende ten minste 30 minuten onder testomstandigheden in de testruimte geacclimatiseren. Alle gedragstests die hierin worden toegepast, hebben het voordeel dat voedsel- of watertekort niet vereist is. Dezelfde groep dieren werd gebruikt in alle beschreven gedragstests. Per dier werden maximaal twee verschillende gedragstests per dag uitgevoerd. Als gedragstests met regelmatige tussenpozen worden uitgevoerd, let dan op een vergelijkbare procedure, zoals het uitvoeren van de test in dezelfde dierorde en op hetzelfde tijdstip van de dag. Een ander belangrijk aspect voor gedragsanalyse is de dag-nachtcyclus van ratten. Overweeg een omgekeerde dag-nachtcyclus om meer natuurlijke en hogere niveaus van activiteit op de dagcyclus (donkere cyclus) te verkrijgen. Dit moet vooral worden overwogen voor het meten van spontaan gedrag, zoals de OFT. In dit experiment kon een omgekeerde dag-nachtcyclus niet worden geïmplementeerd, maar werd gezorgd voor een adequate acclimatisatie aan de testomstandigheden. Een perfecte verlichting is essentieel voor video’s met hoge resolutie voor de beam walking-taak en de ladder rung walking-taak. Deze hoge videokwaliteit kan niet worden bereikt bij het uitvoeren van experimenten in het donker.
De beoordeling van de gang vereist een continue taakprestatie. Het eerste belangrijke aspect van een continue taakprestatie is om de dieren te overtuigen om de opstelling over te steken. Om de motivatie te verhogen, plaatst u kleine voedselkorrels (45 mg) aan het einde van de opstelling. Om ervoor te zorgen dat dieren vertrouwd raken met de voedselkorrels, moeten de pellets vóór het testen aan hen worden gevoerd. Ook kan een doelvak aan het einde van de installatie nuttig zijn. De opzet van de CatWalk bevat al een doelbox, maar ratten aarzelen soms om de doelbox in te gaan. Als alternatief kunt u een kleine kooi in de doeldoos toevoegen, maar de thuiskooi van ratten past niet in de doelbox. Laat de rat een paar minuten in de kooi gewennen voordat hij wordt aanwinst. Bovendien kan een andere rat uit dezelfde thuiskooi in de doelbox of in de kooi in de doelbox worden geplaatst. Zorg ervoor dat de tweede rat in de doos blijft en de ingang van de doelbox niet blokkeert. Bovendien is het ook mogelijk om de doelbox uit het CatWalk-systeem te verwijderen en de rattenhuiskooi aan het einde van de loopbrug te plaatsen, waardoor de rat na elke run zijn “thuisgebied” kan betreden. Voor de installatie van de balklooptaak en de ladderlooptaak raden we aan om aan het einde van de opstelling een doelbox of de thuiskooi toe te voegen. Om consistentie te garanderen, moeten de CatWalk, de balkwandeltaak en de ladderlooptaak minstens één keer per week worden uitgevoerd met zes tot tien runs.
Hoewel niet elke analyse significante verschillen in deze studie opleverde, is u van mening dat een opname van genetisch gemodificeerde dieren of behandelingsgroepen waardevolle gegevens kan opleveren die onderscheid kunnen maken tussen groepen van dezelfde gedragstests.
De zenuwverpletteringsblessure had geen effect op de motorische activiteit van de rat, die in vijf minuten OFT werd gemeten. Catwalk XT ganganalyse is een objectiever en gevoeliger hulpmiddel om gang-, poot- en teenplaatsing te analyseren. Na een intensieve training leren de ratten de loopbrug van het CatWalk XT-apparaat over te steken naar de standaardinstellingen. De zenuwbeschadiging vermindert het vermogen van de ratten om de loopbrug over te steken niet. De automatische berekening van verschillende parameters presenteert de gegevens objectief. Aanvullende informatie kan worden verkregen met behulp van de module “Interactieve voetafdrukmetingen” en inderdaad, deze analyses leverden aanzienlijke verschillen op in verschillende parameters van teenspreiding, afdruklengte en poothoek tot lichaamsas die ratten met en zonder zenuwletsel vergelijken.
Ratten kunnen gemakkelijk worden getraind voor de balkwandeling. Verschillen in de latentietijd om de balk over te steken en in het aantal voetslips per stap van de zenuwgewonde hindlimb werden gedetecteerd door naïef te vergelijken met verbrijzelde ratten. Een nadeel van het analyseren van zenuwgewonde ratten met de balkwandeltaak is de grootte van de balk. Binnen de eerste twee weken na de ischias zenuwverpletteringsblessure hebben de ratten hulp nodig om de balk over te steken omdat hun evenwicht is aangetast. Hoewel sommige ratten in staat kunnen zijn om de balk over te steken, is het risico op verwondingen veroorzaakt door een val groot. Zenuwgemalen dieren moeten daarom worden geholpen om de balk over te steken gedurende de eerste twee weken na ischias zenuwverpletteringsletsel of langer, indien nodig. Het is echter moeilijk om runs met en zonder hulp te vergelijken. Ook is de motorbalans een belangrijke parameter die wordt beoordeeld door de balklooptaak. We vonden deze parameter niet relevant voor ons zenuwverpletterende rattenmodel. Daarom konden scores beschreven door Ohwatashi et al. en Johansson & Ohlsson niet worden gebruikt en werden runs met een onvolledige balkdoorvoer uitgesloten voor gegevensanalyse18,19.
De schaal van 7 categorieën van Metz et al. kan zowel voor- als achterpoten analyseren en onderscheid maken tussen verschillende ernstniveaus van fouten van alle ledematen tijdens de ladderlooptaak16,17. Door de meest prominente fouten te analyseren, waaronder de categorieën van 0 tot 2, konden geen verschillen in fouten per stap worden gedetecteerd in de hindlimb bij het vergelijken van zenuwgewonde wt-ratten met naïeve wt-ratten. Bovendien verschilde de latentietijd van het doorkruisen van het ladderloopapparaat niet tussen zenuwgewonde wt-ratten en wt-naïeve ratten. Deep learning-modellen kunnen de gegevensanalyse van de ladderlooptaak verbeteren en versnellen door middel van een geautomatiseerde aanpak.
Het is belangrijk om te vermelden dat de zenuwverpletteringsblessure en alle beschreven gedragstests gemakkelijk kunnen worden vertaald naar muizen, door de instellingen en maten van de opstellingen aan te passen. Het gebruik van muizen als modelorganisme heeft het gunstige effect dat transgene modellen voor veel menselijke ziekten bestaan.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Duitse federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF DysTract tot C.W.I.) en door het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) van de Universiteit van Würzburg (N-362 tot C.W.I.; Z2-CSP3 naar L.R.). Daarnaast heeft dit project financiering ontvangen van het horizon 2020-onderzoek- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van het EJP RD COFUND-EJP N° 825575 (EurDyscover aan J.V.) en van de VERUM Foundation. Bovendien wordt C.W.I. gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Reseach Foundation) Project-ID 424778381-TRR 295, door het Deutsche Stiftung Neurologie and ParkinsonFonds. L.R. wordt daarnaast ondersteund door de Dystonia Medical Reseach Foundation.
De auteurs danken Keali Röhm, Veronika Senger, Heike Menzel en Louisa Frieß voor hun technische bijstand en Helga Brünner voor de verzorging van dieren.
Materials
| Acetic acid, ≥99.8% | Sigma-Aldrich | 33209-1L | |
| Appose ULC skin stapler 35W | Covidien | 8886803712 | |
| Beam | self made | ||
| Bepanthen eye cream | Bayer Vital GmbH | 81552983 | |
| Box for OFT | self made | ||
| Camcorder GC-PX100 | JVC | ||
| Catwalk XT | Noldus | setup and software | |
| Chamber for isofluran | GT-Labortechnik | custom made | |
| Disposable scalpel No. 11 | Feather | 20.001.30.011 | |
| Dräger Vapor 19.3 isoflurane system | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Dumont #2 – laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | super-fine |
| Dustless precision pellets 45 mg | Bio-Serv | F0021 | |
| EthoVision XT | Noldus | setup and software | |
| Forceps 160 mm | Hartenstein | PZ09 | |
| Gas anesthesia mask, rat | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Goal box for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Hair clipper Magnum 5000 | Wahl GmbH | ||
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Heating table | MEDAX | 13801 | |
| Isofluran CP 1ml/ml, 250 ml | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
| Kinovea | www.kinovea.org | ||
| Ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Needleholder | KLS Martin | 20-526-14-07 | |
| Octeniderm | Schülke | 118211 | |
| Rimadyl 50 mg/ml, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
| Rubber band retractors | self made | ||
| Spacer for beam | self made | ||
| Spacer for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Suture Silkam 4/0 DS 19 | B. Braun | C0762202 | |
| Ultra fine hemostats (non-serrated clamp) | Fine Science Tools | 13020-12 |
References
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats. Disease Models & Mechanisms. 2 (5-6), 206-210 (2009).
- Phifer-Rixey, M., Nachman, M. W. Insights into mammalian biology from the wild house mouse Mus musculus. Elife. 4, (2015).
- Musacchio, T., et al. Subthalamic nucleus deep brain stimulation is neuroprotective in the A53T alpha-synuclein Parkinson’s disease rat model. Annals of Neurology. 81 (6), 825-836 (2017).
- Ip, C. W., et al. Tor1a+/- mice develop dystonia-like movements via a striatal dopaminergic dysregulation triggered by peripheral nerve injury. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 108 (2016).
- Rauschenberger, L., et al. Striatal dopaminergic dysregulation and dystonia-like movements induced by sensorimotor stress in a pharmacological mouse model of rapid-onset dystonia-parkinsonism. Experimental Neurology. 323, 113109 (2020).
- Klein, A., Wessolleck, J., Papazoglou, A., Metz, G. A., Nikkhah, G. Walking pattern analysis after unilateral 6-OHDA lesion and transplantation of foetal dopaminergic progenitor cells in rats. Behavioural Brain Research. 199 (2), 317-325 (2009).
- Kim, D. H., Murovic, J. A., Tiel, R., Kline, D. G. Management and outcomes in 353 surgically treated sciatic nerve lesions. Journal of Neurosurgery. 101 (1), 8-17 (2004).
- Kline, D. G., Kim, D., Midha, R., Harsh, C., Tiel, R. Management and results of sciatic nerve injuries: a 24-year experience. Journal of Neurosurgery. 89 (1), 13-23 (1998).
- Kaplan, H. M., Mishra, P., Kohn, J. The overwhelming use of rat models in nerve regeneration research may compromise designs of nerve guidance conduits for humans. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 26 (8), 226 (2015).
- Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis. Journal of Visualized Experiments. (60), e3606 (2012).
- Savastano, L. E., et al. Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. Journal of Neuroscience Methods. 227, 166-180 (2014).
- Menorca, R. M., Fussell, T. S., Elfar, J. C. Nerve physiology: mechanisms of injury and recovery. Hand Clinics. 29 (3), 317-330 (2013).
- Luis, A. L., et al. Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat. Microsurgery. 28 (6), 458-470 (2008).
- Knorr, S., et al. The evolution of dystonia-like movements in TOR1A rats after transient nerve injury is accompanied by dopaminergic dysregulation and abnormal oscillatory activity of a central motor network. Neurobiology of Disease. , 105337 (2021).
- Quartarone, A., Hallett, M. Emerging concepts in the physiological basis of dystonia. Movement Disorders. 28 (7), 958-967 (2013).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: a scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Johansson, B. B., Ohlsson, A. L. Environment, social interaction, and physical activity as determinants of functional outcome after cerebral infarction in the rat. Experimental Neurology. 139 (2), 322-327 (1996).
- Ohwatashi, A., Ikeda, S., Harada, K., Kamikawa, Y., Yoshida, A. Exercise enhanced functional recovery and expression of GDNF after photochemically induced cerebral infarction in the rat. EXCLI Journal. 12, 693-700 (2013).
