Avaliação multifatorial do comportamento motor em ratos após lesão unilateral do esmagamento do nervo ciático
Summary
Fornecemos um protocolo para a avaliação do comportamento motor através de uma bateria de teste comportamental em ratos após lesão de esmagamento do nervo ciático.
Abstract
A indução de uma lesão nervosa periférica é um método amplamente utilizado na neurociência para a avaliação de mecanismos de reparação e dor, entre outros. Além disso, no campo de pesquisa de distúrbios do movimento, a lesão por esmagamento ciático foi empregada para desencadear um fenótipo semelhante à distonia em modelos de roedores DYT-TOR1A geneticamente predispostos de distonia. Para alcançar resultados consistentes, reprodutíveis e comparáveis após uma lesão de esmagamento do nervo ciático, um método padronizado para induzir o esmagamento nervoso é essencial, além de uma caracterização fenotípica padronizada. Deve-se prestar atenção não apenas à variedade específica de testes comportamentais, mas também aos requisitos técnicos, à execução correta e à análise de dados consecutivas. Este protocolo descreve em detalhes como realizar uma lesão de esmagamento do nervo ciático e fornece uma bateria de teste comportamental para a avaliação de déficits motores em ratos que inclui o teste de campo aberto, a análise da marcha CatWalk XT, a tarefa de caminhada do feixe e a tarefa de caminhada de degraus da escada.
Introduction
Os roedores são excelentes organismos modelo para aprofundar a compreensão das doenças humanas1,2, testando hipóteses em múltiplos níveis biológicos. Um nível biológico fundamental para a caracterização dos modelos de roedores é o nível de fenótipo, medido por avaliações comportamentais. Dependendo do modelo animal e da questão da pesquisa científica, a seleção de uma poderosa e confiável bateria de teste comportamental é essencial para cobrir uma ampla gama de aspectos comportamentais, como para modelos animais da doença de Parkinson e distonia3,4,5,6.
O nervo ciático é o maior nervo do corpo humano com motor, bem como fibras sensoriais. Lesões do nervo ciático podem resultar facilmente de uma variedade de eventos, como acidentes de trânsito e cirurgias7,8. Portanto, as atividades de pesquisa utilizando modelos de roedores com lesões no nervo ciática, são de valor traduções relevantes. Embora o aspecto translacional da regeneração nervosa de rato para humano tenha que ser considerado criticamente9, a lesão do esmagamento do nervo ciático (axonotmesis) em modelos de roedores é um método comumente usado para analisar processos de degeneração e regeneração dos nervos periféricos10,11. Em caso de lesão por esmagamento, o nervo não é completamente transcectado. Danifica o axônio, resultando em bloqueio de condução logo após lesão por esmagamento seguido de processos regenerativos 4,12,13.
Além disso, na pesquisa da distonia, a lesão unilateral do esmagamento do nervo ciático é um método estabelecido para desencadear movimentos semelhantes à distonia (DLM) em modelos de roedores de distonia geneticamente predispostos, que não mostram DLM por se4,14. Supõe-se que o trauma nervoso periférico perturba a integração sensorial afetando as fibras nervosas ciáticas, responsáveis pelas funções motoras e sensoriais15.
Nós fornecemos aqui uma descrição detalhada para uma lesão de esmagamento padronizada do nervo ciático e uma bateria de avaliações de comportamento motor que é composta do teste de campo aberto (OFT), análise de marcha CatWalk XT, tarefa de caminhada do feixe e tarefa de caminhada de degrau de escada em ratos selvagens ingênuos (wt) e ratos wt cinco semanas após lesão unilateral do nervo ciático (n= 10). O OFT fornece informações sobre a atividade locomotor geral, enquanto uma análise detalhada da marcha é realizada pelo sistema automatizado de análise de marcha CatWalk XT. A tarefa de caminhada do feixe é usada para avaliar a coordenação motora, avaliando o tempo para atravessar a viga e o número de erros de colocação do pé. Para análise de desempenho de marcha, a tarefa de caminhada de degraus da escada fornece informações sobre a colocação do pé ou da pata e erros em um aparelho de degrau horizontal da escada com um padrão de degrau constante, mas irregular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo de avaliação comportamental fornece uma visão geral das vantagens e desvantagens, bem como possíveis leituras da bateria de teste comportamental selecionada em um modelo de roedor após lesão de esmagamento do nervo ciático.
Para obter um resultado comparativo da lesão do esmagamento do nervo ciático, uma técnica consistente de esmagamento é obrigatória. O uso de um grampo não serrilado (Hemostat Ultra Fino) em vez de fórceps pode melhorar a consistência do esmagamento. Use o mesmo grampo, bem como a mesma posição de esmagamento para garantir a igual compressão do nervo. O uso exclusivo do grampo para a lesão do esmagamento e manuseio do grampo com cuidado melhora a consistência. Além disso, realize o procedimento da lesão do esmagamento com cuidado. Danos adicionais ao nervo durante a cirurgia, como a tração indesejada do nervo, podem levar a efeitos colaterais indesejados, como a automutilação. Portanto, recomenda-se uma preparação cuidadosa do nervo, bem como uma administração de um analgésico por um mínimo de dois dias.
A avaliação multifatorial do comportamento motor pode caracterizar o fenótipo após lesão de esmagamento nervoso em ratos em vários níveis. Usamos a análise de marcha OFT, CatWalk XT, tarefa de caminhada de feixe e tarefa de caminhada de degraus de escada. Um procedimento experimental cego e a análise de dados para grupos experimentais são essenciais para esses experimentos. Antes da avaliação do comportamento, os animais foram aclimatados na sala de testes em condições de teste por pelo menos 30 minutos. Todos os testes comportamentais aqui aplicados têm a vantagem de que a privação de alimentos ou água não é necessária. O mesmo grupo de animais foi utilizado em todos os testes comportamentais descritos. Foram realizados no máximo dois testes comportamentais diferentes por dia para cada animal. Se os testes comportamentais forem realizados em intervalos regulares, preste atenção a um procedimento comparável, como a realização do teste na mesma ordem animal e na mesma hora do dia. Outro aspecto importante para a análise comportamental é o ciclo diurno dos ratos. Considere um ciclo diurno invertido para obter níveis mais naturais e mais altos de atividade no ciclo diurno (ciclo escuro). Isso deve ser considerado especialmente para a medição do comportamento espontâneo, como o OFT. Neste experimento, não foi possível implementar um ciclo diurno invertido, mas foi assegurada uma aclimatação adequada às condições de teste. Uma iluminação perfeita é essencial para vídeos de alta resolução para a tarefa de caminhada do feixe e a tarefa de caminhada da escada. Essa alta qualidade de vídeo não pode ser alcançada ao realizar experimentos no escuro.
A avaliação da marcha requer um desempenho contínuo da tarefa. O primeiro aspecto importante de um desempenho contínuo da tarefa é convencer os animais a atravessar a configuração. Para aumentar a motivação, coloque pequenas pelotas de alimentos (45 mg) no final da configuração. Para que os animais se familiarizem com as pelotas de alimentos, as pelotas devem ser alimentadas com eles antes dos testes. Além disso, uma caixa de gol no final da configuração pode ser útil. A configuração do CatWalk já inclui uma caixa de gol, mas os ratos às vezes hesitam em entrar na caixa de gol. Alternativamente, você pode adicionar uma pequena gaiola na caixa de gol, mas a gaiola de casa de ratos não cabe na caixa de gol. Deixe o rato habituar na gaiola por alguns minutos antes da aquisição. Além disso, outro rato da mesma gaiola doméstica pode ser colocado na caixa de gol ou na gaiola dentro da caixa de gol. Certifique-se de que o segundo rato permaneça na caixa e não bloqueie a entrada da caixa de gol. Além disso, também é possível remover a caixa de gol do sistema CatWalk e colocar a gaiola de rato no final da passarela, o que permite que o rato entre em seu “território de origem” após cada corrida. Para a configuração da tarefa de caminhada do feixe e da tarefa de caminhada do degrau da escada, recomendamos adicionar uma caixa de gol ou a gaiola doméstica no final da configuração. Para garantir a consistência, o CatWalk, a tarefa de caminhada do feixe e a tarefa de caminhada do degrau da escada devem ser realizados pelo menos uma vez por semana com seis a dez corridas.
Embora nem todas as análises tenham apresentado diferenças significativas neste estudo, considere que a inclusão de animais geneticamente modificados ou grupos de tratamento poderia produzir dados valiosos que possam distinguir entre grupos dos mesmos testes comportamentais.
A lesão por esmagamento nervoso não teve efeito na atividade locomotor do rato, que foi medida em cinco minutos de OFT. A análise da marcha da passarela XT é uma ferramenta mais objetiva e sensível para analisar a colocação da marcha, pata e dedo do dedo do dedo. Após um treinamento intensivo, os ratos aprendem a atravessar a passarela do aparelho CatWalk XT para as configurações padrão. A lesão nervosa não reduz a capacidade dos ratos de atravessar a passarela. A computação automática de vários parâmetros apresenta os dados objetivamente. Informações adicionais podem ser obtidas usando o módulo “Medidas interativas de pegada” e, de fato, essas análises produziram diferenças significativas em vários parâmetros de propagação do dedo do pé, comprimento de impressão e ângulo da pata ao eixo corporal comparando ratos com e sem lesão nervosa.
Ratos podem ser treinados facilmente para a tarefa de andar de feixe. Diferenças no tempo de latência para atravessar o feixe e no número de deslizamentos de pé por passo da perna traseira lesionada pelo nervo foram detectadas comparando-se ingênuas com ratos feridos por esmagamento. Uma desvantagem de analisar ratos feridos pelo nervo com a tarefa de andar de viga é o tamanho da viga. Nas duas primeiras semanas após a lesão do nervo ciático, os ratos precisam de assistência para atravessar a trave, pois seu equilíbrio é prejudicado. Embora alguns ratos possam ser capazes de atravessar a viga, o risco de ferimentos causados por uma queda é alto. Os animais esmagados pelos nervos devem, portanto, ser auxiliados a atravessar o feixe durante as duas primeiras semanas após lesão de esmagamento do nervo ciático ou mais, se necessário. No entanto, é difícil comparar corridas com e sem assistência. Além disso, o equilíbrio motor é um parâmetro importante avaliado pela tarefa de caminhada do feixe. Consideramos este parâmetro não relevante para o nosso modelo de rato de esmagamento nervoso. Portanto, pontuações descritas por Ohwatashi et al. e Johansson & Ohlsson não puderam ser utilizadas e corridas com uma travessia de feixe incompleta foram excluídas para análise de dados18,19.
A escala de 7 categorias de Metz et al. pode analisar os preços dos antees e traseiros e distinguir entre diferentes níveis de gravidade de erros de todos os membros durante a tarefa de caminhada do degrau da escada16,17. Analisando os erros mais proeminentes, que incluem as categorias de 0 a 2, não foram detectadas diferenças de erros por etapa na etapa traseira ao comparar ratos wt feridos pelo nervo com ratos ingênuos. Além disso, o tempo de latência de atravessar o aparelho de degrau da escada não difere entre ratos wt feridos pelo nervo e ratos ingênuos. Modelos de aprendizagem profunda podem melhorar e acelerar a análise de dados da tarefa de caminhada de degraus de escada através de uma abordagem automatizada.
É importante mencionar que a lesão por esmagamento nervoso, bem como todos os testes comportamentais descritos podem facilmente traduzir para camundongos, adaptando as configurações e tamanhos das configurações. O uso de camundongos como organismo modelo tem o efeito benéfico de que existem modelos transgênicos para muitas doenças humanas.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério Federal alemão da Educação e Pesquisa (BMBF DysTract to C.W.I.) e pelo Centro Interdisciplinar de Pesquisa Clínica (IZKF) da Universidade de Würzburg (N-362 a C.W.I.; Z2-CSP3 para L.R.). Além disso, este projeto recebeu financiamento do programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia no âmbito do EJP RD COFUND-EJP N° 825575 (EurDyscover to J.V.), e da Fundação VERUM. Além disso, a C.W.I. é financiada pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Reseach Foundation) Project-ID 424778381-TRR 295, pela Deutsche Stiftung Neurologie and ParkinsonFonds. L.R. é adicionalmente apoiado pela Dystonia Medical Reseach Foundation.
Os autores agradecem a Keali Röhm, Veronika Senger, Heike Menzel e Louisa Frieß por sua assistência técnica, bem como Helga Brünner pelo cuidado com os animais.
Materials
| Acetic acid, ≥99.8% | Sigma-Aldrich | 33209-1L | |
| Appose ULC skin stapler 35W | Covidien | 8886803712 | |
| Beam | self made | ||
| Bepanthen eye cream | Bayer Vital GmbH | 81552983 | |
| Box for OFT | self made | ||
| Camcorder GC-PX100 | JVC | ||
| Catwalk XT | Noldus | setup and software | |
| Chamber for isofluran | GT-Labortechnik | custom made | |
| Disposable scalpel No. 11 | Feather | 20.001.30.011 | |
| Dräger Vapor 19.3 isoflurane system | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Dumont #2 – laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | super-fine |
| Dustless precision pellets 45 mg | Bio-Serv | F0021 | |
| EthoVision XT | Noldus | setup and software | |
| Forceps 160 mm | Hartenstein | PZ09 | |
| Gas anesthesia mask, rat | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Goal box for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Hair clipper Magnum 5000 | Wahl GmbH | ||
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Heating table | MEDAX | 13801 | |
| Isofluran CP 1ml/ml, 250 ml | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
| Kinovea | www.kinovea.org | ||
| Ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Needleholder | KLS Martin | 20-526-14-07 | |
| Octeniderm | Schülke | 118211 | |
| Rimadyl 50 mg/ml, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
| Rubber band retractors | self made | ||
| Spacer for beam | self made | ||
| Spacer for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Suture Silkam 4/0 DS 19 | B. Braun | C0762202 | |
| Ultra fine hemostats (non-serrated clamp) | Fine Science Tools | 13020-12 |
References
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