تقييم متعدد العوامل للسلوك الحركي في الفئران بعد إصابة سحق العصب الوركي من جانب واحد
Summary
نحن نقدم بروتوكولا لتقييم السلوك الحركي عن طريق بطارية اختبار سلوكية في الفئران بعد إصابة سحق العصب الوركي.
Abstract
تحريض إصابة العصب المحيطي هو طريقة تستخدم على نطاق واسع في علم الأعصاب لتقييم آليات الإصلاح والألم من بين أمور أخرى. بالإضافة إلى ذلك ، في مجال أبحاث اضطرابات الحركة ، تم استخدام إصابة سحق الوركي لإثارة النمط الظاهري الشبيه بخلل التوتر في نماذج القوارض DYT-TOR1A المهيأة وراثيا من خلل التوتر. لتحقيق نتائج متسقة وقابلة للاستنساخ وقابلة للمقارنة بعد إصابة سحق العصب الوركي ، من الضروري استخدام طريقة موحدة لتحفيز سحق العصب ، بالإضافة إلى توصيف شكلي موحد. يجب إيلاء الاهتمام ليس فقط لل تشكيلة محددة من الاختبارات السلوكية، ولكن أيضا إلى المتطلبات التقنية والتنفيذ الصحيح وتحليل البيانات المتتالية. يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية إجراء إصابة سحق العصب الوركي ويوفر بطارية اختبار سلوكية لتقييم العجز الحركي في الفئران التي تشمل اختبار الحقل المفتوح ، وتحليل مشية CatWalk XT ، ومهمة المشي شعاع ، ومهمة المشي درجة السلم.
Introduction
القوارض هي كائنات نموذجية ممتازة لتعميق فهم الأمراض البشرية1،2 عن طريق اختبار الفرضيات على مستويات بيولوجية متعددة. أحد المستويات البيولوجية الأساسية لتوصيف نماذج القوارض هو مستوى النمط الظاهري ، الذي تقاس به التقييمات السلوكية. اعتمادا على نموذج الحيوان ومسألة البحث العلمي ، واختيار بطارية اختبار سلوكية قوية وموثوق بها أمر ضروري لتغطية مجموعة واسعة من الجوانب السلوكية مثل النماذج الحيوانية لمرض باركنسون وخلل التوتر3،4،5،6.
العصب الوركي هو أكبر عصب في جسم الإنسان مع الألياف الحركية وكذلك الحسية. إصابات العصب الوركي يمكن أن تنتج بسهولة من مجموعة متنوعة من الأحداث مثل حوادث المرور والعمليات الجراحية7،8. لذلك ، فإن الأنشطة البحثية باستخدام نماذج القوارض مع إصابات العصب الوركي ، ذات قيمة ذات صلة ترجمة. على الرغم من أن الجانب الترجمي لتجديد العصب من الفئران إلى الإنسان يجب أن ينظر إليه بشكل نقدي9، فإن إصابة سحق العصب الوركي (axonotmesis) في نماذج القوارض هي طريقة شائعة الاستخدام لتحليل عمليات الانحطاط والتجديد للأعصاب الطرفية10،11. في حالة إصابة سحق العصب لا يتم تحويلها تماما. فإنه يضر المحور، مما أدى إلى كتلة التوصيل مباشرة بعد سحق الإصابة تليها العمليات التجديدية 4،12،13.
وعلاوة على ذلك، في البحوث خلل التوتر، وإصابات سحق العصب الوركي من جانب واحد هو وسيلة راسخة لتحريك حركات تشبه خلل التوتر (DLM) في نماذج القوارض خلل التوتر الوراثي، والتي لا تظهر DLM في حد ذاتها4،14. ومن المفترض أن الصدمة العصبية الطرفية يزعج التكامل الحسي الحركي عن طريق التأثير على الألياف العصبية الوركية، والتي هي المسؤولة عن الوظائف الحركية والحسية15.
نحن هنا نقدم وصفا مفصلا لإصابة سحق موحدة للعصب الوركي وبطارية من تقييمات السلوك الحركي التي تتكون من اختبار المجال المفتوح (OFT) ، وتحليل مشية CatWalk XT ، ومهمة المشي شعاع وسلم درجة المشي المهمة في نوع البرية السذاجة (wt) الفئران (ن = 8-9) والجرذان wt بعد خمسة أسابيع من إصابة سحق العصب الوركي من جانب واحد (ن = 10). يوفر مكتب مراقبة الطبيعة معلومات حول النشاط الحركي العام، في حين يتم تحقيق تحليل مشية مفصل من خلال نظام تحليل المشي الآلي CatWalk XT. يتم استخدام مهمة المشي شعاع لتقييم التنسيق الحركي من خلال تقييم الوقت لعبور شعاع وعدد من الأخطاء موضع القدم. لتحليل أداء مشية سلم درجة المشي المهمة يعطي معلومات حول وضع القدم أو مخلب والأخطاء على جهاز درجة سلم أفقي مع نمط درجة ثابتة ولكن غير النظامية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر بروتوكول التقييم السلوكي هذا نظرة عامة على المزايا والعيوب بالإضافة إلى قراءات محتملة لبطارية الاختبار السلوكي المختارة في نموذج القوارض بعد إصابة سحق العصب الوركي.
للحصول على نتيجة مقارنة لإصابة سحق العصب الوركي ، فإن تقنية السحق الثابتة إلزامية. استخدام المشبك غير مسننة (الترا غرامة Hemostat) بدلا من ملقط يمكن تحسين اتساق سحق. استخدام المشبك نفسه وكذلك نفس الموقف سحق لضمان ضغط العصب على قدم المساواة. الاستخدام الحصري للمشبك لإصابة سحق والتعامل مع المشبك بعناية يحسن الاتساق. أيضا، إجراء إصابة سحق بعناية. يمكن أن يؤدي تلف إضافي للعصب أثناء الجراحة مثل الجر غير المرغوب فيه للعصب إلى آثار جانبية غير مرغوب فيها مثل التبدل التلقائي. لذلك ، يوصى بإعداد العصب بعناية بالإضافة إلى إدارة مسكن للألم لمدة يومين على الأقل.
تقييم متعدد العوامل للسلوك الحركي يمكن أن تميز النمط الظاهري بعد إصابة سحق الأعصاب في الفئران على مختلف المستويات. استخدمنا OFT، CatWalk XT تحليل مشية، شعاع المشي مهمة وسلم درجة المشي المهمة. إجراء تجريبي أعمى وتحليل البيانات للمجموعات التجريبية أمر ضروري لهذه التجارب. قبل تقييم السلوك، تم تأقلم الحيوانات في غرفة الاختبار تحت ظروف الاختبار لمدة 30 دقيقة على الأقل. جميع الاختبارات السلوكية المطبقة هنا لها ميزة أن الحرمان من الطعام أو الماء غير مطلوب. تم استخدام نفس المجموعة من الحيوانات في جميع الاختبارات السلوكية الموصوفة. تم إجراء اختبارين سلوكيين مختلفين كحد أقصى لكل في اليوم. إذا تم إجراء الاختبارات السلوكية على فترات منتظمة، انتبه إلى إجراء مماثل، مثل إجراء الاختبار بنفس الترتيب الحيواني وفي نفس الوقت من اليوم. وثمة جانب آخر مهم للتحليل السلوكي هو دورة ليلا نهارا من الفئران. النظر في عكس دورة ليلا نهارا للحصول على مستويات أكثر طبيعية وأعلى من النشاط في دورة النهار (دورة الظلام). هذا يجب أن ينظر خصوصا لقياس السلوك العفوي، مثل OFT. وفي هذه التجربة، لم يكن من الممكن تنفيذ دورة نهارية معكوسة، ولكن تم ضمان التأقلم الكافي مع ظروف الاختبار. الإضاءة المثالية ضرورية لمقاطع الفيديو عالية الدقة لمهمة المشي الحزمة ومهمة المشي الدرجة السلم. لا يمكن الوصول إلى جودة الفيديو العالية هذه عند إجراء التجارب في الظلام.
يتطلب تقييم المشية أداء مهمة مستمرة. الجانب المهم الأول من أداء المهمة المستمر هو إقناع الحيوانات لعبور الإعداد. لزيادة الحافز، ضع حبيبات الطعام الصغيرة (45 ملغ) في نهاية الإعداد. من أجل الحصول على الحيوانات على دراية الكريات الغذائية، وينبغي تغذية الكريات لهم قبل الاختبار. أيضا، يمكن أن يكون مربع الهدف في نهاية الإعداد مفيدا. يتضمن إعداد CatWalk بالفعل مربع هدف ، ولكن الفئران تتردد أحيانا في دخول مربع الهدف. بدلا من ذلك، يمكنك إضافة قفص صغير في مربع الهدف، ولكن القفص المنزلي من الفئران لا يصلح في مربع الهدف. دع الفئران تعود في القفص لبضع دقائق قبل الاستحواذ. بالإضافة إلى ذلك، قد يتم وضع فأر آخر من نفس القفص المنزلي في مربع المرمى أو في القفص داخل مربع المرمى. تأكد من أن الجرذ الثاني يبقى في منطقة الجزاء ولا يمنع مدخل مربع الهدف. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن أيضا لإزالة مربع الهدف من نظام CatWalk ووضع قفص الفئران المنزل في نهاية الممشى، والذي يسمح للجرذ لدخول “أراضي الوطن” بعد كل شوط. لإعداد مهمة المشي شعاع وسلم درجة المشي المهمة، نوصي بإضافة مربع الهدف أو القفص المنزل في نهاية الإعداد. لضمان الاتساق ، يجب تنفيذ CatWalk ، ومهمة المشي الحزمة ، ومهمة المشي الدرجة السلم مرة واحدة على الأقل في الأسبوع مع ستة إلى عشرة أشواط.
على الرغم من أن ليس كل تحليل أسفر عن اختلافات كبيرة في هذه الدراسة، والنظر في أن إدراج الحيوانات المعدلة وراثيا أو مجموعات العلاج يمكن أن تنتج بيانات قيمة التي يمكن أن تميز بين مجموعات من نفس الاختبارات السلوكية.
لم يكن لإصابة سحق العصب أي تأثير على النشاط الحركي للجرذ ، والذي تم قياسه في خمس دقائق من OFT. Catwalk XT gait analysis هو أداة أكثر موضوعية وحساسية لتحليل المشية ومخلب وإيداع القدم. بعد تدريب مكثف ، تتعلم الفئران عبور ممشى جهاز CatWalk XT إلى الإعدادات الافتراضية. لا تقلل إصابة العصب من قدرة الفئران على عبور الممشى. الحساب التلقائي لمختلف المعلمات يعرض البيانات موضوعيا. ويمكن الحصول على معلومات إضافية باستخدام وحدة “قياسات البصمة التفاعلية” وبالفعل، أسفرت هذه التحليلات عن اختلافات كبيرة في مختلف المعلمات لانتشار إصبع القدم وطول الطباعة وزاوية مخلب لمحور الجسم مقارنة الفئران مع وبدون إصابة الأعصاب.
يمكن تدريب الفئران بسهولة لمهمة المشي شعاع. تم الكشف عن اختلافات في وقت الكمون لعبور الشعاع وفي عدد زلات القدم في كل خطوة من الأطراف الخلفية المصابة بالأعصاب من خلال مقارنة السذاجة مع الفئران المصابة بالسحق. عيب تحليل الفئران المصابة بالأعصاب مع مهمة المشي شعاع هو حجم شعاع. في غضون الأسبوعين الأولين بعد إصابة سحق العصب الوركي ، تحتاج الفئران إلى المساعدة لعبور الشعاع حيث يضعف توازنها. على الرغم من أن بعض الفئران قد تكون قادرة على عبور شعاع، وخطر الإصابات الناجمة عن السقوط مرتفعة. لذلك ينبغي مساعدة الحيوانات المسحوقة بالأعصاب على عبور الشعاع لأول أسبوعين بعد إصابة سحق العصب الوركي أو لفترة أطول ، إذا لزم الأمر. ومع ذلك، من الصعب مقارنة الركض مع وبدون مساعدة. أيضا، التوازن الحركي هو معلمة هامة تقييمها من قبل مهمة المشي شعاع. اعتبرنا هذه المعلمة لا تكون ذات صلة لنموذجنا الفئران سحق العصب. لذلك، تم استبعاد الدرجات التي وصفها Ohwatashi وآخرون ويوهانسون &؛ Ohlsson ويمكن استخدامها مع اجتياز شعاع غير مكتملة لتحليل البيانات18،19.
مقياس 7 فئات من ميتز وآخرون يمكن تحليل كل من الأمامية و hindlimbs والتمييز بين مستويات شدة مختلفة من الأخطاء من جميع الأطراف خلال سلم درجة المشي المهمة16،17. من خلال تحليل أبرز الأخطاء ، والتي تشمل الفئات من 0 إلى 2 ، لا يمكن اكتشاف أي اختلافات في الأخطاء في الخطوة الواحدة في الأطراف الخلفية عند مقارنة فئران wt المصابة بالأعصاب مع فئران wt السذاجة. وعلاوة على ذلك، فإن زمن الكمون من عبور جهاز درجة سلم لا تختلف بين الفئران WT المصابة بالأعصاب والجرذان السذاجة wt. يمكن لنماذج التعلم العميق تحسين وتسريع تحليل البيانات لمهمة المشي الدرجة سلم من خلال نهج الآلي.
من المهم أن نذكر أن إصابة سحق العصب وكذلك جميع الاختبارات السلوكية الموصوفة يمكن ترجمتها بسهولة إلى الفئران ، من خلال تكييف إعدادات وأحجام الاجهزة. استخدام الفئران ككائن حي نموذجي له تأثير مفيد أن النماذج المعدلة وراثيا لكثير من الأمراض البشرية موجودة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل وزارة التعليم والبحوث الاتحادية الألمانية (BMBF DysTract to C.W.I.) والمركز متعدد التخصصات للبحوث السريرية (IZKF) في جامعة فورتسبورغ (N-362 إلى C.W.I.; Z2-CSP3 إلى L.R.). وبالإضافة إلى ذلك، تلقى هذا المشروع تمويلا من برنامج الاتحاد الأوروبي للأبحاث والابتكار في أفق 2020 في إطار برنامج EJP RD COFUND-EJP N° 825575 (EurDyscover to J.V.)، ومن مؤسسة VERUM. وعلاوة على ذلك، يتم تمويل C.W.I. من قبل دويتشه فورتشونجسجيمينشافت (DFG، مؤسسة ريسيتش الألمانية) مشروع معرف 424778381-TRR 295، من قبل دويتشه ستيفتونغ Neurologie وباركنسونفوندس. L.R. بالإضافة إلى ذلك بدعم من مؤسسة Dystonia الطبية Reseach.
يشكر المؤلفون كيالي روم وفيرونيكا سينغر وهيكي مينزيل ولويزا فريس على مساعدتهم التقنية وكذلك هيلغا برونر على رعاية الحيوانات.
Materials
| Acetic acid, ≥99.8% | Sigma-Aldrich | 33209-1L | |
| Appose ULC skin stapler 35W | Covidien | 8886803712 | |
| Beam | self made | ||
| Bepanthen eye cream | Bayer Vital GmbH | 81552983 | |
| Box for OFT | self made | ||
| Camcorder GC-PX100 | JVC | ||
| Catwalk XT | Noldus | setup and software | |
| Chamber for isofluran | GT-Labortechnik | custom made | |
| Disposable scalpel No. 11 | Feather | 20.001.30.011 | |
| Dräger Vapor 19.3 isoflurane system | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Dumont #2 – laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | super-fine |
| Dustless precision pellets 45 mg | Bio-Serv | F0021 | |
| EthoVision XT | Noldus | setup and software | |
| Forceps 160 mm | Hartenstein | PZ09 | |
| Gas anesthesia mask, rat | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Goal box for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Hair clipper Magnum 5000 | Wahl GmbH | ||
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Heating table | MEDAX | 13801 | |
| Isofluran CP 1ml/ml, 250 ml | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
| Kinovea | www.kinovea.org | ||
| Ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Needleholder | KLS Martin | 20-526-14-07 | |
| Octeniderm | Schülke | 118211 | |
| Rimadyl 50 mg/ml, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
| Rubber band retractors | self made | ||
| Spacer for beam | self made | ||
| Spacer for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Suture Silkam 4/0 DS 19 | B. Braun | C0762202 | |
| Ultra fine hemostats (non-serrated clamp) | Fine Science Tools | 13020-12 |
References
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats. Disease Models & Mechanisms. 2 (5-6), 206-210 (2009).
- Phifer-Rixey, M., Nachman, M. W. Insights into mammalian biology from the wild house mouse Mus musculus. Elife. 4, (2015).
- Musacchio, T., et al. Subthalamic nucleus deep brain stimulation is neuroprotective in the A53T alpha-synuclein Parkinson’s disease rat model. Annals of Neurology. 81 (6), 825-836 (2017).
- Ip, C. W., et al. Tor1a+/- mice develop dystonia-like movements via a striatal dopaminergic dysregulation triggered by peripheral nerve injury. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 108 (2016).
- Rauschenberger, L., et al. Striatal dopaminergic dysregulation and dystonia-like movements induced by sensorimotor stress in a pharmacological mouse model of rapid-onset dystonia-parkinsonism. Experimental Neurology. 323, 113109 (2020).
- Klein, A., Wessolleck, J., Papazoglou, A., Metz, G. A., Nikkhah, G. Walking pattern analysis after unilateral 6-OHDA lesion and transplantation of foetal dopaminergic progenitor cells in rats. Behavioural Brain Research. 199 (2), 317-325 (2009).
- Kim, D. H., Murovic, J. A., Tiel, R., Kline, D. G. Management and outcomes in 353 surgically treated sciatic nerve lesions. Journal of Neurosurgery. 101 (1), 8-17 (2004).
- Kline, D. G., Kim, D., Midha, R., Harsh, C., Tiel, R. Management and results of sciatic nerve injuries: a 24-year experience. Journal of Neurosurgery. 89 (1), 13-23 (1998).
- Kaplan, H. M., Mishra, P., Kohn, J. The overwhelming use of rat models in nerve regeneration research may compromise designs of nerve guidance conduits for humans. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 26 (8), 226 (2015).
- Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis. Journal of Visualized Experiments. (60), e3606 (2012).
- Savastano, L. E., et al. Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. Journal of Neuroscience Methods. 227, 166-180 (2014).
- Menorca, R. M., Fussell, T. S., Elfar, J. C. Nerve physiology: mechanisms of injury and recovery. Hand Clinics. 29 (3), 317-330 (2013).
- Luis, A. L., et al. Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat. Microsurgery. 28 (6), 458-470 (2008).
- Knorr, S., et al. The evolution of dystonia-like movements in TOR1A rats after transient nerve injury is accompanied by dopaminergic dysregulation and abnormal oscillatory activity of a central motor network. Neurobiology of Disease. , 105337 (2021).
- Quartarone, A., Hallett, M. Emerging concepts in the physiological basis of dystonia. Movement Disorders. 28 (7), 958-967 (2013).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: a scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Johansson, B. B., Ohlsson, A. L. Environment, social interaction, and physical activity as determinants of functional outcome after cerebral infarction in the rat. Experimental Neurology. 139 (2), 322-327 (1996).
- Ohwatashi, A., Ikeda, S., Harada, K., Kamikawa, Y., Yoshida, A. Exercise enhanced functional recovery and expression of GDNF after photochemically induced cerebral infarction in the rat. EXCLI Journal. 12, 693-700 (2013).
