一方的坐骨神経クラッシュ傷害後のラットにおける運動行動の多因子的評価

すべての動物実験は、ドイツのレジエルン・フォン・ウンテルフランケン(ドイツ・ヴュルツブルク)で地元当局によって承認され、動物のケアと使用に関する国際的、国内的、および/または制度的ガイドラインに従って実施されました。 1. 坐骨神経クラッシュ傷害 注:手術全体の間に無菌環境を維持します。必要な機器を使用して手術台を設置します。 O2(2 L/分)でイソフルラン3.0%の閉じたキャビネットでラットを深く麻酔します。キャビネットからネズミを取り出します。右後肢の広い領域を剃ります。 ラットを麻酔マスクに入れ、O2(2 L/分)でイソフルラン2.0%で深部麻酔を続けます。後方の足のデジタル間ウェビングをつまんで麻酔の深さを制御します。離脱反射の欠如は、十分な麻酔を示す。 テープでラットの胴体と両方の後肢を固定します。両後肢を対称的で伸長した位置に置き、足を手術台に平らにします。 眼の眼に眼の軟膏を適用して、ドライアイを防ぎます。かき領域の皮膚を消毒剤で消毒します。 イリウムの坐骨神経座のノッチを検索します。 坐骨切りからメスで足の方向に皮膚切開を行います。皮膚切開はできるだけ小さくする必要があります(約1〜2cm)。 後肢が固定され、皮膚切開が正しく行われると、大殿筋と上腕二頭筋との間の筋膜内の空洞が「白線」に似ているのが分かる。閉じた超微細止血鉗子(No.5)をキャビティに挿入し、鉗子を広げます。筋膜面は筋肉組織を傷つけずに開く必要があります。 皮膚切開を開いたままにするために、筋肉の下にゴムバンドレトラクターを置きます。 神経が完全に露出するまで、坐骨神経から周囲の組織や血管をそっと取り除きます。全体の手順の間に神経を伸ばしたり引っ張ったりしないことが重要です。 一定かつ再現可能な圧力で非鋸歯状クランプ(超微細止血)で坐骨神経を粉砕します。このためには、クランプを開き、クランプの下顎に神経を置き、クランプを最初の位置に3回10秒間ロックして閉じます。坐骨神経クラッシュの位置は、坐骨神経管の近くに位置し、主坐骨神経束の分裂部位に近い。クラッシュの怪我の後、クランプを慎重に開き直します。坐骨神経のクラッシュ部位は半透明に見える。 ゴムバンドレトラクターを取り外します。 再ソーブル4-0縫合で魅惑的な面切開を閉じます。ボディスキンステープルで皮膚切開を閉じます。 手術後24時間ごとに術後の痛みの軽減のためにGV-SOLASガイドライン(5mg /kg体重、皮下注射)に従ってリマジルを適用します。 手術のセットアップからラットを取り除きます。ラットが起きるまで、加熱プレート(37°C)に寝具を入れずにきれいなケージにラットを入れます。ネズミをきれいな家のケージに戻します。 手術後4~6日で体の皮膚ステープルを取り除きます。 2. オープンフィールドテスト(OFT) 注:ロコモド活動と行動活動はOFTによって分析することができます。 セットアップ 暗くて静かな環境でOFT(図1A)を設定します。それは自動ビデオ追跡システムEthoVision XT(コンピュータ、ライセンスを持つソフトウェア)と58.5 cm(長さ)x 58.5 cm (幅)x 45 cm (高さ)を傷つき、きれいな黒い表面を持つアリーナで構成されています。白い動物を追跡する際にコントラストを高めるためには、黒い表面が重要です。 査定 アリーナとカメラを正しい位置に配置します。最適な解像度で開いているフィールド ボックス全体が記録されるカメラを調整します。暗い環境で実験を行います。設定に光が必要な場合は、アリーナでのライトスポット、反射、陰影を避けるために、小さな拡散光を使用してください。アリーナの異なる領域でルクスメーターで照度を測定することにより、等しい光条件を確保します。 エソビジョン XT ソフトウェアをセットアップします。最も重要な設定は次のとおりです。[実験の設定]で、[ビデオ ソース] の[ライブ トラッキング] を選択し、[トラッキングされた機能] の中心点検出を選択します。アリーナ設定でアリーナのサイズを検証します。データ取得の開始条件を、ラットがアリーナの中央に配置されてから 3 秒後に、総実行時間を[トライアルコントロール設定] で 5 分に設定します。[検出設定] の[メソッド] で [静的減算] を選択します。チェックマーク取得設定でメソッドのビデオを保存します。 テストアリーナの中央にそっとネズミを置きます(図1B)。 取得コントロールの[試用を開始] ボタンを押して、記録を開始します。 記録中は、ラットの気をそらさないように、OFTセットアップから離れてください。 各試験の後、試験場からラットを静かに取り除き、前に記録されたラットの臭いによって気を散らさないように0.1%酢酸でセットアップをきれいにします。 データ分析 EthoVision XT ソフトウェアを使用した OFT のデータ分析については、左側のバーの[分析] セクションに移動し、[結果] タブ (図 1C)の下の [視覚化の追跡] を選択します。次に、必要なパラメータを Excel にエクスポートします。ソフトウェア内で、データ分析のためにさまざまなカテゴリから変数を選択します。この特定の科学的目的のための重要な変数は、「距離と時間」カテゴリの下に「移動距離」と「速度」です。選択したパラメータの統計解析を実行します (図 1D)。 3. キャットウォークXT歩行解析 注:CatWalk XTシステムを介した歩行分析は、動物モデルのフットプリント、スタンス、歩行に関する多くの異なるパラメータを評価するのに役立ちます。ガラスの歩道は緑色の光で照らされ、動物の足跡によって散乱された光は、歩道の下に位置する高速ビデオカメラでキャプチャされます。信号はCatWalk XTソフトウェアで分析することができます。 セットアップ CatWalk XT を使用した歩行解析では、CatWalk システムと対応するソフトウェア (コンピューター、ライセンスを使用したソフトウェア) を使用します (図 2A)。 データ取得は、緑色のLEDライトを持つCatWalkシステムの歩道の照明に依存するため、暗い条件下で実験を行います。暗い条件下で実験手順を容易にするために、実験室を赤色光で照らす。 長さ65cm、幅7cmの計測を行う、定義された歩道を使用してください。しかし、歩道の大きさはラットの大きさによって異なります。歩道をできるだけ大きく設定して、各足にできるだけ多くの足跡を記録します。 各実行の足あたり 3 つのフットプリントの最小数をキャプチャします。歩道の長さを定義する際には、開始信号または停止信号が正しく検出されず、実行の完了前または完了後に定義された歩道に残っている場合、ランが準拠として分類されない可能性があるため、ラットの本体と尾を考慮してください。 訓練注:CatWalkシステム用のラットのトレーニングは、セットアップに動物を習慣化し、中断することなく歩道を横断することを学ぶために必要です。適切なトレーニングは、実験評価中の時間を節約し、より良い結果を得るという利点を提供します。トレーニングセッション中にCatWalkシステムのデータ取得を開始すると、ラットは評価条件(ノイズ/ライト)に慣れることができます。CatWalkシステムのセットアップを開始します。 蒸留水と糸くずのない柔らかい布でガラスの歩道をきれいにしてください。実験の開始時と終了時、またはガラスの歩道が汚れている場合は、ガラス洗浄液と糸くずのない柔らかい布を使用して、ガラスの歩道をきれいにします。ガラス洗浄液を使用した後、液体の任意の残留物から歩道を取り除き、動物の気をそらさないようにします。 実験設定を選択します。重要なパラメータは実行基準です。[最小実行期間]、[最長実行期間]、[取得する準拠の実行の最小数] の適切な値を設定します。[最大許容速度変動を使用する] ボックスにチェックマークを付けて、値を設定します。実行基準は、トレーニングの最初の 4 ~ 5 日間は無視できます。 カメラを所定の位置に置き、フォーカスを調整します。最適なカメラ位置を見つけて、適切な長さの歩道と記録された足の最適な解像度を同時に達成します。CatWalk システム上のカメラ位置にラベルを付け、録画間でカメラの配置が同じになるようにします。 新しい実験の自動検出を使用して、検出設定を設定します。すべてのフットプリントを最小限のバックグラウンドノイズで検出できることを確認してください。必要に応じて、検出設定を手動で最適化し、緑の強度のしきい値を変更します。実験全体で同じ検出設定を使用します。 CatWalk システムのコリドーウォールを設定します。廊下の壁は、できるだけラットに近い必要があります。廊下の壁が歩道に平行であることを確認します。 歩道の長さを定義する:「歩道を 定義 」アイコンをクリックします。特定の研究プロジェクトに従って、白い長方形の長さと幅のサイズを調整します。 [OK] をクリックします。 歩道を調整する:[歩道の調整]アイコン を クリックします。歩道の中央に20 x 10 cmの長方形のキャリブレーションシートを置きます。白い長方形のサイズをキャリブレーションシートに合わせます。 [OK] をクリックします。 次に、背景画像をスナップする:歩道が清潔で空であることを事前に確認してください。[ 背景をスナップ ]ボタンをクリックして、背景画像を生成します。 実際の実験を開始する前に、少なくとも8日間動物を訓練してください。連続した日のトレーニングをお勧めします。 訓練の1日目:ラットがCatWalkシステムに慣れるために、動物が歩道とゴールボックスを自由に探索できるようにします。ネズミが歩道を渡る練習をさせてゴールボックスに入ります。歩道の端またはゴールボックスでラットを拾い上げ、ラットを歩道の出発点に戻します。実験設定に準拠する必要なく、トレーニングの初日には5回の実行をお勧めします。 トレーニングの2日目:ラットは歩道とゴールボックスを自由に探索することができます。実験設定に準拠せずに5回の実行を推奨します。 トレーニングの3日目:実験設定に準拠せずに8回の実行をお勧めします。 トレーニングの4日目:実験設定に準拠せずに10回の実行をお勧めします。 トレーニングの5日目:10回のランをお勧めします。実験の設定は、心に留めておいてください。中断することなく歩道を横断するラットをやる気にさせる。 トレーニングの6日目:10回のランをお勧めします。実験の設定は、心に留めておいてください。中断することなく歩道を横断するラットをやる気にさせる。 トレーニングの7日目:10回のランをお勧めします。最低 3 つの準拠した実行を実行する必要があります。動物がこの目標に到達できなかった場合は、さらに実行を追加します。 トレーニングの8日目:10回のランをお勧めします。最低 3 つの準拠した実行を実行する必要があります。動物がこの目標に到達できなかった場合は、さらに実行を追加します。 査定 定義された実行基準に従って、データ分析のためにラットごとに 3 つの準拠実行を実行します。評価については、手順 3.2.1 に従ってください。- 3.2.1.8.トレーニングセクションで説明されているように。ラットが最初の3回のラン内で3つの準拠したランに達した場合でも、トレーニング目的でセッションごとに1週間あたり最低6回の実行を行います。 複数のタイム ポイントを持つ実験の安定した歩行パターンのために、週に 6 回実行する少なくとも 1 つの (トレーニング) セッションを実行します。実験と検出の設定は、実験全体で一貫しています。 データ分析 データ分析の場合は、準拠した実行のみを評価します。非準拠の実行を削除します。 必要に応じて、足の分類前に「緑強度しきい値」を確認し、緑強度しきい値を増減します。緑強度しきい値は、すべての動物とすべての実行に対して一貫している必要があります。 CatWalk XT ソフトウェアを使用して、足のプリントを自動的に分類します (図 2B)。 足の印刷ラベルを手動で確認します。間違った足のプリントラベルを修正し、検出されていない足のプリントのラベルを追加し、ノイズや間違ったラベルを手動で削除します。ビデオを手動で確認する必要がある位置に移動します。間違ったラベル付けされた足のプリントを修正するには、特定の足のプリントの長方形を選択し、[ リセット]をクリックして、同じ四角形を再度選択し、リストから正しいラベルを割り当てます。検出されなかった足のプリントにラベルを付ける場合は、検出されなかった足の周りに長方形を描き、[ 印刷の追加]をクリックして新しく生成された長方形を選択し、リストから正しいラベルを割り当てます。ノーズまたはボディが自動的に印刷されるソフトウェアの場合は、特定のラベルの長方形を選択し、[ 印刷の削除] をクリックします。 数値の結果を確認します。数値の結果は、いくつかの基本的なパラメータを示す Excel シートに表示されます。研究の関心に応じて事前定義された特定のパラメータを選択し、通常どおりに統計解析を実行します(図2D)。 各フットプリントの詳細については、後足のつま先を分類してください。この解析には 、インタラクティブフットプリント測定モジュールが必要です 。 必要に応じて、インタラクティブフットプリント測定解析に適合するグリーン強度しきい値を調整します。緑強度しきい値は、すべての動物とすべての実行に対して一貫している必要があります。 フットプリント解析のマーカーを手動で設定します。3 つの準拠した実行ですべての後ろ足の印刷を分析します。「つま先スプレッド」を測定するために、最初のつま先の中心から5番目のつま先の中心に線を引きます。2番目のつま先の中心から4番目のつま先の中心に線を引き、「中間つま先スプレッド」を測定します。3 番目のつま先の中心から後足のかかとまでの線を引いて、「手動印刷の長さ」(図2C)を測定します。 別シートに表示された「インタラクティブフットプリント測定」の数値結果を確認します。「インタラクティブフットプリント測定」の特定のパラメータを選択し、通常通り統計解析を実行します(図2E)。 4. ビーム歩行作業 注:歩行の赤字はビーム歩行作業によって決定することができる。この特定の研究トピックにおけるビーム歩行タスクの焦点は、運動協調の分析であり、身体運動中の姿勢制御能力として定義される運動バランスの評価ではなく、複数の身体部分からの筋肉活性化を調整する能力として定義される。 セットアップ ビーム歩行作業には、ビーム、スペーサ、テーブル、均一な背景、ビデオカメラを使用します(図3A)。 長さ90cm、幅1.7cm、高さ2cmの木製ビームを使用してください。長さ20.5cm、幅15cm、梁両端の高さ2cmのプラットフォームをお勧めします。プラットフォームとビームに同じ材料を使用し、プラットフォームとビームの間の障壁を避けます。 ビームとテーブルの間の距離は少なくとも44cmである。ホームケージのような身近な環境は、ビームプラットフォームの端に配置することができるビームを横切るためにラットを動機づける。 訓練 テーブルの上にスペーサーとホームケージでビームを設定します。 7日間動物を訓練します。連続した日のトレーニングをお勧めします。 トレーニングの1日目 ビームのスタートプラットフォーム上の1つのホームケージからすべてのラットを配置します。 ラットは、環境(プラットフォーム/ビーム)を探索してみましょう。 1つのラットを尾で注意深く保持し、ラットを軽くビームに押し込んでラットをビームに導きます。 ラットを少なくとも2回尾で保持してビームを横断するのを助ける。 ラットは助けを借りずにさらに3回のランのためにビームを横断してみましょう。ラットを観察し、必要に応じて支援を提供します。ラットがビームを横断しなかった場合は、怪我やビームを横断する恐怖の発達を避けるために落下を傍受します。 すべてのラットに対してこの手順を続行します。注:時にはラットがビームを横断するために互いに従って、その場合、援助は必要ありません。しかし、ラットを観察し、転倒をインターセプトし、必要に応じて支援を提供することが重要である。 トレーニング2日目 ビームのスタートプラットフォーム上の1つのホームケージからすべてのラットを配置します。 ラットがビームを6回横断してみましょう。 必要に応じて、援助を提供し、落下を傍受します。 3日目のトレーニング ビームの開始プラットフォームに1つのラットを置きます。 ラットがビームを6回横断してみましょう。 必要に応じて、援助を提供し、落下を傍受します。 トレーニングの4-7日目 ビームの開始プラットフォームに1つのラットを置きます。 ネズミはビームを10回横断してみましょう。 必要に応じて、援助を提供し、落下を傍受します。 訓練の終わりに、ラットは少なくとも3回の実行のために中断することなくビームを横断する必要があります。開始プラットフォーム上でラットを穏やかに押して動きの開始をトリガーすることは許される。 査定 テーブルの上にスペーサーとホームケージでビームを設定します。 ビデオカメラを位置に置き、動物を焦点にしてビームに平行に整列します。ビデオカメラの位置は、記録された動きの最適な解像度を達成するために、動物にできるだけ近い必要があります。ビームと両方のプラットフォームの一部は、記録によってキャプチャする必要があります。 記録を開始し、まずセッションと動物を識別します。 梁のスタートプラットフォームにラットを置きます。 ラットは、任意の中断することなく、ビームを3回横断する必要があります。ラットが最初の 3 回の実行内で 3 つの準拠した実行に達した場合でも、継続的なタスクパフォーマンスを実現するために、最低 6 ~ 10 回の実行を実行します。 必要に応じて、常に動物を観察し、落下をインターセプトします。 作業の後、前に記録されたラットの臭いによって気晴らしを避けるために0.1%酢酸でビームとテーブルをきれいにします。注:神経クラッシュの傷害後の最初の2週間以内に、ラットは助けなしにビームを横断することができません。したがって、神経クラッシュ傷害後の最初の2週間で6〜8回のアシストを提供する必要があります。第3週から第5週まで、5回のランが支援を受けて実行され、さらに10回のランが支援なしで実行されました。 データ分析 データ分析のための無料のビデオ分析ソフトウェアキノベアを使用してください。 録画から3つの準拠ランのビデオシーケンスを選択します。このためには、動物の助けを借りずに実行された最初の3つの準拠した実行を選択します。すべてのラットの準拠の実行選択で一貫している。 選択した 3 つの準拠した実行の開始時間と終了時間を定義します (図 3D-E)。この設定では、開始点は梁の黒い線でラベル付けされ、黒い線の後ろの最初の後肢の配置は、実行の開始点を定義しました。梁の終点のプラットフォーム上の最初の後肢の配置は、終了タイムポイントを定義します。 次に、ラットがビームを通過するのに必要な時間を計算します。ビームを横切る待機時間としてデータをレポートし、通常どおりに統計解析を実行します (図 3B)。 ソフトウェアのズームとスローモーション機能を使用して、両方の後肢の3つの準拠した実行からステップ数とエラー数を個別にスコア付けします。エラーには、合計フットスリップとハーフフットスリップが含まれます。足の総スリップは、深いスリップが続き、影響を受けた足とビームとの接触の損失を引き起こす足の配置として定義されます(図3F)。ハーフスリップは、ビームとの完全な接触を失うことなく、ビームの側壁から滑り落ちる足と定義されます(図3G)。 ビームを横切るステップ数(四肢の足のスリップ数x 100%)/同じ四肢のステップ数に対する足のスリップの割合を計算します。フィートスリップの割合としてデータを提示し、通常通り統計分析を実行します (図 3C)。 5.ラダーラング歩行作業 注:ラダーラング歩行タスクは、運動機能、前肢と後肢の両方の配置、およびインターリムの調整を評価することができます。 セットアップ この動作テストには、ラダーラン装置、スペーサ、テーブル、均一な背景、ビデオカメラを使用します(図4A)。水平ラダーラン装置は金属のラングおよび透明なポリカーボネートの側面から成っている。装置は119.5 cmの長さがあり、幅は7.4 cmに調節される。解析する歩道の長さは100cmです。 サイドウォールに黒い線で始点と終点にラベルを付けます。1 cm間隔で装置上にラングのプレースホルダを置きます。ラング間の距離1〜5cmの100cmの歩道のためのラングの不規則なパターンを配置します。最初の10cmは、装置の最後の9.5cmで、解析から除外され、1cmの距離を持つラングの規則的なパターンを有する。 歩道とテーブルの間の距離を約30cm使用します(図4A-B)。ホームケージのように、装置の最後にゴールボックスや身近な環境は、ラットがはしごラング装置を横断する動機付けになります。 訓練 テーブルの上にスペーサーとゴールボックスを備えたラダーラン装置を設置します。 8日間動物を訓練します。連続した日のトレーニングをお勧めします。 トレーニングの1日目 1つのホームケージからすべてのラットをラダーラン装置に置きます。 ラットが環境(ラダーラン装置/ゴールボックス)を探索してみましょう。 ゴールボックスの方向にネズミをそっと押し込みます。ゴールボックスに入る際にラットを支援します。ネズミはしばらくの間、ゴールボックスを探索してみましょう。 すべてのネズミがゴールボックスに入った後。ゴールボックスから最初のラットを取り、再度装置の開始ゾーンにラットを置きます。1つのホームケージのすべてのラットに対して同じ手順を続けます。ゴールボックスの方向にネズミをそっと押し込み、必要に応じてゴールボックスに入る手助けをします。 ラットが装置を4回横断させる。 トレーニング2日目 トレーニングの初日に記載されているのと同じプロトコルを実行します。 ラットが装置を6回横断させる。 3日目のトレーニング トレーニングの初日に記載されているのと同じプロトコルを実行します。 ラットが装置を8回横断させましょう。 トレーニング4日目 ラダーラン装置の開始位置に1つのラットを置きます。 ラットが装置を横切らず、自発的にゴールボックスに入った場合は、後ろからネズミを軽く押して支援を行います。 ラットが装置を8回横断させましょう。 トレーニング5-8日目 ラダーラン装置の開始に1ラットを置きます。 ラットが装置を横切らず、自発的にゴールボックスに入った場合は、後ろからネズミを軽く押して支援を行います。 ラットが装置を10回横断させましょう。 訓練の終わりに、ラットは最低3回の走行のために中断と援助なしに歩道を横断することができるはずです。ラットに開始ゾーンで穏やかなプッシュを与えて動きの開始をトリガーすることは許される。 査定 テーブルの上にスペーサーとゴールボックスを備えたラダーラン装置を設置します。 ビデオカメラを位置に置き、動物に焦点を合わせて装置に平行に整列させる。ビデオカメラを動物にできるだけ近づけて、記録された動きの最適な解像度を達成し、ラダーラン装置全体が記録にキャプチャされるようにします。 記録を開始し、まずセッションと動物を識別します。 ラダーラン装置の開始ゾーンにラットを置きます。 ラットは、準拠の走行として資格を得るために、はしごラン装置の100cmの歩道を中断することなく3回横断する必要があります。最初の 3 回の実行でラットが 3 つの準拠の実行に達した場合でも、継続的なタスクパフォーマンスのために最低 10 回の実行を実行する必要があります。 作業後、前に記録したラットの臭いによって気を散らさないように、装置とテーブルを0.1%の酢酸で洗浄します。 データ分析 データ分析のための無料のビデオ分析ソフトウェアキノベアを使用してください。 録画から3つの準拠ランのビデオシーケンスを選択します。データ分析に対して最初の 3 つの準拠の実行を選択します。 選択した 3 つの準拠した実行の開始時間ポイントと終了時間を定義します。100 cmの歩道の開始点にラベルを付ける装置の側壁の最初の黒い線の後ろに最初の後肢の配置は、走行の開始時点を定義する。100 cmの歩道の終点にラベルを付ける装置の側壁の第2の黒い線の後ろに第1の前肢の配置は、走行の終点を定義する。 開始時間と終了時刻を指定します。次に、歩道を横切る走行時間を計算します。データを、歩路を数秒で通過し、通常通りの統計解析を実行する待ち時間としてレポートします(図4C)。 ソフトウェアのスローモーションまたはフレームごとの機能を使用して、Metzらから7カテゴリスケールで3つの準拠したランをスコア付けする (図5)16,17。各四肢のスケールのカテゴリに応じて、ステップ数とエラー数を個別に決定します。スケールは、(0) 総ミス (1) 深いスリップ (2) わずかなスリップ (3) 置換 (4) 補正 (5) 部分配置、 (6) 正しい配置の各カテゴリーを区別します。発起肢の誤差のみが評価された。最初のエラーによって引き起こされるさらなるエラーは評価されるべきではありません。 以下の要件を考慮して、エラー/ステップを計算します。カテゴリ (0) 合計ミス (1) 深いスリップ (2) わずかなスリップ数はエラーとしてカウントされます。エラーの数を、各後肢のステップ数で割り、各実行を個別に行います。各動物と各後肢の3つの準拠したランの平均値を個別に決定し、通常通り統計解析を実行します(図4D)。