Активация и конъюгация растворимых полисахаридов с использованием 1-циано-4-диметиламинопиридина тетрафторбората (CDAP)

ПРИМЕЧАНИЕ: Заранее подготовьте полисахаридный раствор, раствор АДГ, раствор DMAP и раствор запаса CDAP перед выполнением процедур активации и функционализации полисахарида. Разместите решения и оборудование в организованном, удобном и логичном месте. Описанная реакция рассчитана на 10 мг полисахарида и может быть увеличена или уменьшена. Рекомендуется оценить протокол в небольшом масштабе перед масштабированием. 1. Приготовить 5 мг/мл раствора полисахарида, 2 мл. Для лиофилизированного полисахарида Дайте полисахаридной емкости выйти на комнатную температуру перед открытием. Взвесьте 10 мг полисахарида внутри трубки с винтовой крышкой с помощью аналитических весов. Используйте статический элиминатор для упрощения отбора проб и более точного взвешивания порошка. Добавьте 2 мл 0,15 М хлорида натрия (NaCl) в пробирку для растворения полисахарида. Колпачок и вихрь трубки.ПРИМЕЧАНИЕ: Хлорид натрия не влияет на реакцию CDAP, но может влиять на вторичную структуру полисахарида. Некоторые полисахариды более растворимы при различных концентрациях солей. Перемешайте трубку путем сквозного вращения в течение 12-24 ч, в зависимости от молекулярной массы полисахарида, чтобы полисахарид полностью гидратироваться. При необходимости аккуратно прогрейте трубку, чтобы способствовать солюбилизации. Для солюбилизированного полисахарида в буферном раствореПРИМЕЧАНИЕ: Для эффективной активации CDAP раствор полисахарида не должен содержать буфера, особенно фосфат-иона. Следуйте приведенной ниже процедуре, чтобы заменить буфер водой или солевым раствором и отрегулировать концентрацию полисахарида до 5 мг/мл. Получают 4 мл или 15 мл центробежно-спинового фильтрующего устройства соответствующей молекулярно-весовой отсечки (MWCO).ПРИМЕЧАНИЕ: MWCO в идеале в 5-10 раз меньше молекулярной массы полисахарида. Добавьте в фильтрующий вкладыш объем буферного раствора полисахарида, содержащего ~20 мг полисахарида. Заполнить до полной отметки водой или солевым раствором. Плотно закрепить фильтр крышкой. Перемешайте по окончанию несколько раз. Центрифугировать фильтрующее устройство при центробежной силе, предложенной заводом-изготовителем. Убедитесь, что время центрифугирования достаточно долгое, чтобы достичь по крайней мере 5-кратного уменьшения объема после каждого вращения. Отбросьте сквозной поток. Соберите фильтрующее устройство. Заправьте фильтрующий вкладыш до полной отметки пресной водой или солевым раствором. Плотно закрепить фильтр крышкой. Перемешайте содержимое в фильтре путем сквозного вращения ~10 раз или путем мягкого вихря; повторите вращение.ПРИМЕЧАНИЕ: Полисахарид может накапливаться в нижней части фильтрующей вставки центробежного устройства, образуя гель. Рекомендуется повторно смешать ретентант внутри фильтрующей вставки со свежим заправом перед следующим отжимом. Повторите цикл заправки и отжима не менее 3 раз. Выполните упражнение ниже, чтобы восстановить полисахаридный ретентентар из фильтрующей вставки. Добавьте свежую воду или физиологический раствор в фильтрующий раствор, чтобы объем был ~1 мл. Перемешайте путем пипетки вверх и вниз или путем мягкого вихря. Перенесите весь смешанный ретентант в пробирку 5 мл. Добавьте 1 мл пресной воды или физиологического раствора в фильтрующий вкладыш. Промывайте фильтр путем пипетки вверх и вниз или путем мягкого вихря. Перенесите и соедините все полоскания с восстановленным полисахаридом. Определение концентрации полисахарида (см. анализ полисахаридов в разделе 7.3). Разбавляют полисахарид дополнительной водой или физиологическим раствором до 5 мг/мл. Когда раствор полисахарида приготовлен, охладите трубку, содержащую раствор полисахарида, в ведре со льдом. 2. Готовят 0,5 М раствора дигидразида адипиновой кислоты (АДГ), 10 мл. Весят 0,87 г АДГ в аналитических весах и солюбилизируют в 8 мл 0,1 М HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), рН 8. Отрегулируйте целевой рН с помощью 1 М гидроксида натрия (NaOH), контролируемого рН-метром. Доведите до 10 мл с дополнительным буфером и повторно подтвердите рН. 3. Подготовьте раствор 2,5 М DMAP, 10 мл. ПРИМЕЧАНИЕ: DMAP токсичен и проникает в кожу. Надевайте нитриловые перчатки при выполнении процедуры. Тщательно взвесьте 3 г DMAP в коническую трубку 50 мл. Добавьте 5 мл воды в DMAP и перемешайте путем вихря в течение 5 мин до получения мутного раствора (~ 7 мл). Во время смешивания добавьте 50 мкл с шагом 10 N соляной кислоты (HCl) в раствор DMAP. Смешайте между каждым добавлением. Прекратите добавление, когда решение станет ясным. Добавьте 10 Н NaOH с шагом 25 мкл, чтобы довести раствор DMAP до ~pH 8. Доведите раствор DMAP до 10 мл с водой, чтобы получить раствор 2,5 мл. Тонкая настройка рН раствора DMAP 2,5 М.ПРИМЕЧАНИЕ: рН раствора DMAP изменяется с концентрацией и ионной силой. Это упражнение заключается в тонкой настройке запаса DMAP 2,5 М до определенного рН таким образом, чтобы при смешивании с 10 объемами полисахарида полученный раствор был близок к целевому рН для активации. Готовят серию из 1,5 мл пробирок, содержащих 1 мл воды или раствора NaCl, в зависимости от того, что использовалось для приготовления раствора полисахарида. Охладите трубки на льду. Добавьте 100 мкл DMAP в охлажденный тюбик. Вихрь и измерьте pH с помощью pH-метра. Затем отбросьте измеренную трубку. Если измеренный рН не близок к целевому значению, скорректируйте рН запаса DMAP с 1 М NaOH или HCl в зависимости от обстоятельств. Повторяйте шаги 3.5.2 и 3.5.3 до тех пор, пока измеренный рН не приблизится к целевому рН. 4. Приготовьте 100 мг/мл раствора CDAP ПРИМЕЧАНИЕ: Порошок CDAP следует держать плотно закрытым и хранить при -20 °C и дать ему перейти к комнатной температуре перед открытием. Надевайте нитриловые перчатки при выполнении процедуры. Натрите микроцентрифужную трубку емкостью 1,5 мл на аналитические весы. Используя небольшой шпатель, взвесьте 10-140 мг CDAP в пробирку. Обратите внимание на фактический вес CDAP. Определить объем ацетонитрила необходимо для приготовления 100 мг/мл CDAP. Открыть ацетонитрил в вытяжке. Используя соответствующий объем пипетки, вытяните и освободите ацетонитрил, чтобы уравновесить его пар в наконечнике пипетки. Подождите, пока растворитель выпадет из наконечника пипетки через несколько секунд, и будьте готовы перенести его непосредственно в трубку CDAP. Нарисуйте расчетный объем ацетонитрила и непосредственно перенесите его в трубку CDAP. Закройте крышку.ПРИМЕЧАНИЕ: Ацетонитрил также может быть перенесен в трубку CDAP с помощью шприца Гамильтона или его эквивалента подходящего размера. Вихрь для полной солюбилизации CDAP. Поместите трубку CDAP в ведро со льдом.ПРИМЕЧАНИЕ: CDAP стабилен в ацетонитриле на холоде. Растворимые запасы могут храниться при -20 °C в течение >1 недели. Однако предпочтительнее готовить свежие растворы CDAP. 5. Активация полисахарида и функционализация гидразидов Перед началом активации убедитесь, что все следующие продукты готовы и растворы охлаждаются на льду: 2 мл раствора полисахарида 5 мг/мл в контейнере с плоским дном с широким горлом, со стержнем, помещенном поверх магнитной мешалки; 100 мг/мл ХДАП раствора для запаса; 2.5 M DMAP складовое решение; рН-метр с полумикрозондом рН, таким как датчик диаметром 6 мм, откалиброванный на 0 °C в соответствии с инструкциями завода-изготовителя; готовый к использованию пипетка 100 мкл; таймер очищен и готов к использованию; расположенная головка дозатора автотитратора или готовая к использованию пипетка 10 мкл; 0,5 М АДГ раствора. Предварительно отрегулируйте pH полисахарида до целевого pH с помощью DMAP. Поместите pH-зонд в раствор полисахарида и оставьте его в растворе в течение всей процедуры активации. Переложить 200 мкл раствора DMAP в раствор полисахарида путем по каплевидного добавления при перемешивание. Отрегулируйте pH раствора в соответствии с целевым pH активации. Добавьте 0,1 M HCl для снижения pH и 0,1 M NaOH для повышения pH. Избегайте превышения целевого рН более чем на 0,1 единицы рН и держите реакцию охлажденной на ледяной водяной бане в течение всего периода активации. Активация CDAP Пипетка 100 мкл CDAP вверх и вниз для уравновешиния пара в наконечнике пипетки. Переложить 100 мкл CDAP в раствор полисахарида при перемешивание.ПРИМЕЧАНИЕ: Эта активация использует 1 мг CDAP на 1 мг полисахарида в качестве начального соотношения. Коэффициент может быть увеличен или уменьшен при оптимизации активации. Запустите таймер и следите за изменением pH в течение всей активации. Поддерживайте реакцию на целевом рН путем быстрого добавления к реакции приращений 10 мкл 0,1 М NaOH с помощью автотитраторного дозатора (или пипетки).ПРИМЕЧАНИЕ: Это может помочь уменьшить время отклика pH для мягкого перемешивания с помощью pH-зонда. pH падает быстрее в начале, и может потребоваться чаще добавлять 0,1 M NaOH. По мере протекая реакции снижение рН становится медленнее, а добавление становится менее частым. pH должен оставаться практически неизменным при приближении к оптимальному времени активации, которое составляет 10-15 мин для активации pH 9. Функционализация АДГ Когда будет достигнуто оптимальное время активации, добавьте 2 мл 0,5 М АДГ сразу к активированной полисахариду при перемешивание. Убедитесь, что pH находится в целевом диапазоне (pH 8-9 для АДГ).ПРИМЕЧАНИЕ: Одно добавление с быстрым перемешиванием сводит к минимуму вероятность того, что оба конца дигидразида вступают в реакцию с активированным полисахаридом, предотвращая сшивание полисахарида. Продолжайте перемешивать реакционную смесь в течение не менее 1 ч. Перенесите реакционную смесь до 4 °C, но допустимо 0-20 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция функционализации АДГ не сильно зависит от температуры. Поскольку большой избыток дигидразида действует как закаляющий реагент, нет необходимости в дальнейшем закалывать активированный полисахарид. Однако при непосредственном конъюгировании белков реакцию следует закалять, как правило, с 1 М глицина, рН 8-9. 6. Очистка АДГ-функционализированного полисахарида методом диализа ПРИМЕЧАНИЕ: Сырой продукт реакции функционализации АДГ содержит высокую концентрацию АДГ (0,5 М), которая может быть удалена наиболее эффективно путем обширного диализа. Гелевая фильтрация, либо с помощью колонны, либо со спиновым обессоливляющим устройством, не так эффективна, особенно когда требуется удалить остаточное загрязняющее свойство АДГ. Определение MWCO диализной мембраны. Используйте отсечку 3 кДа для небольших полисахаридов.ПРИМЕЧАНИЕ: MWCO диализной мембраны в идеале в 5-10 раз меньше, чем MW полисахарида. Выберите желаемый формат диализа (кассеты или трубки) и правильную емкость устройства. Убедитесь, что емкость устройства в 2 раза больше объема образца. Ознакомьтесь с инструкциями производителей по использованию устройства. Увлажняйте мембрану диализа в воде перед использованием. Перенесите сырой производный раствор полисахарида на диализное устройство в соответствии с инструкциями производителя.ПРИМЕЧАНИЕ: Носите нитриловые перчатки, чтобы избежать контакта с DMAP. Диализ в контейнере, наполненном 2-4 л 1 М NaCl и перемешивании. Поместите контейнер на тарелку в холодном помещении или в холодильнике. Перемешайте диализат осторожно и непрерывно во время диализа. После диализа в течение не менее 4 ч, переведите на свежий 1 М NaCl и диализуйте в течение не менее 12 ч. Диализ против 2 изменений по 0,15 М физиологического раствора, каждый в течение не менее 12 ч. При желании диализуют против 2 смен воды. Проверьте, удалены ли все АДГ, протестировав ночной диалисат с помощью быстрого теста TNBS. Получите 3 боросиликатные трубки, пометьте их как отрицательный контроль (ctrl), положительный ctrl и образец соответственно. К отрицательной трубке ctrl добавьте 975 мкл 0,1 М бората, рН 9. К положительной трубке ctrl добавляют 100 мкл 0,05 мМ АДГ (0,1 мМ гидразида) и 875 мкл 0,1 М бората, рН 9. В пробирку для образцов добавляют 500 мкл ночного диализата и 475 мкл 0,1 М бората, рН 9. Добавьте 25 мкл 1% TNBS во все три пробирки. Хорошо перемешать. Поставить в темное время суток на 1 ч. Сравните интенсивность цвета 3 тубок за 1 ч. Убедитесь, что интенсивность цвета пробирки находится между интенсивностью положительного ctrl и отрицательного ctrl, что указывает на то, что загрязняющее вещество АДГ снижается до 0,01 мМ или ниже. Диализе еще раз.ПРИМЕЧАНИЕ: Разумно максимально снизить уровень адг-загрязнителя, чтобы на гидразид АДГ приходится менее 1% от общего количества гидразида в очищенном гидразид-полисахариде. Восстанавливают дериватизированный полисахарид после диализа. Определяют концентрацию полисахаридов и гидразидов. Рассчитайте соотношение гидразид/полисахарид (см. раздел 7). Если диализованный полисахарид должен быть концентрирован до 5-10 мг/мл, обратитесь к разделу 1.2. 7. Анализ гидразид-дериватизированных полисахаридов ПРИМЕЧАНИЕ: Целью анализа, описанного здесь, является определение концентрации полисахарида, концентрации гидразида и уровня дериватизации гидразида в терминах соотношения гидразида/полисахарида. ПробоподготовкаПРИМЕЧАНИЕ: Полисахариды для анализа должны быть свободны от низкомолекулярных примесей углеводов, аминов или гидразидов. Лиофилизированные образцы должны быть сухими и бессолевыми, чтобы обеспечить точное измерение веса. Обычно ~ 1 мл раствора 1-2 мг / мл достаточно для анализов. Взвесьте не менее 10 мг лиофилизированного образца полисахарида на аналитических весах, используя нестатический шпатель или статический элиминатор. Растворите полисахарид в воде или физиологическом растворе до концентрации (например, 2 мг/мл) таким образом, чтобы сигналы анализа попадали в линейный диапазон стандартной кривой. Перемешайте конец-конец и дайте достаточно времени, чтобы образец полностью растворяется. Выполняют ночную гидратацию в зависимости от молекулярной массы полисахарида. Анализ на полисахариды: метод резорцина/серной кислотыПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующий анализ полисахаридов будет зависеть от углеводного состава полимеров. Оригинальный анализ резорцина/серной кислоты предназначался для гексозных сахаров10. Анализ был модифицирован здесь путем повышения температуры ступени нагрева с 90 °C до 140 °C. При этой более высокой температуре анализ теряет некоторую специфичность, но может быть использован для анализа многих сахаров. Однако все же необходимо определить пригодность анализа для конкретного полисахарида. Для каждой точки рекомендуются трипликаты, но некоторые места могут потребоваться из-за вместимости нагревательного блока.Приготовить 75% серной кислотыПРИМЕЧАНИЕ: Концентрированная серная кислота чрезвычайно коррозионна и может вызвать сильные ожоги. Выполните эту процедуру в химическом вытяжном капюшоне. Всегда наливайте в воду концентрированную кислоту, а не наоборот! Добавьте 50 мл воды в стеклянную бутылку объемом 200 мл. Поместите бутылку в ванну с холодной водой. Медленно добавляйте 150 мл серной кислоты. Закускиваете бутылку так, чтобы она была проветриваемой. Дайте раствору уравновеситься до комнатной температуры. Используйте раствор в течение 3 месяцев. Подготовьте углеводные стандарты Готовят немодифицированный раствор полисахарида в 1 мг/мл для использования в качестве стандарта. Альтернативно, используют смесь отдельных сахаров в соотношении, обнаруженном в повторной единице полисахарида, при 1 мг/мл общей концентрации сахара, в качестве стандарта.ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя сахарная смесь обычно дает тот же результат, что и углеводный полимер с идентичным сахарным составом, это должно быть подтверждено экспериментально. Убедитесь, что нагревательный блок с держателями трубок для 13 x 100 боросиликатных пробирок функционирует. Используйте защитную прокладку под и вокруг нагревательного блока в случае разливов кислоты. Предварительно нагревайте нагревательный блок до 140 °C в течение как минимум 1 ч для достижения стабильной, равномерной температуры через все используемые блоки. Этикетка 13 x 100 боросиликатных пробирок, трипликация для каждого стандарта и каждого образца. Добавьте 0, 2,5, 5, 7,5, 10 мкг (или мкл) из 1 мг/мл углеводного стандарта в соответствующие маркированные стандартные пробирки. Добавьте воду в каждый тюбик, чтобы довести объем до 100 мкл.ПРИМЕЧАНИЕ: Создаваемый цвет зависит от конкретных сахаров. Поскольку некоторые сахара требуют больше массы для создания полного диапазона поглощения, фактические количества, используемые для стандартной кривой, могут варьироваться. Настройте пробоотборники, добавив объем, содержащий ~5 мкг дериватизированного полисахарида, в три пробирки для образцов и доведите общий объем до 100 мкл с водой. Альтернативно, если концентрация полисахарида в образце неизвестна, выполняют серию 4-кратных разведений. Испытание на 100 мкл каждого разведения в трех количествах. Приготовьте свежий резорцин в 6 мг/мл в деионизированной (dI) воде непосредственно перед использованием. Вихрь до тех пор, пока резорцин не будет в растворе. Добавьте 100 мкл 6 мг/мл резорцина в каждый пробирку. Осторожно налейте расчетное количество 75% серной кислоты в небольшой замок.ПРИМЕЧАНИЕ: Носите лабораторный халат, нитриловые перчатки и защитные очки. Будьте осторожны с каплями, разливами и брызгами. Держите влажные бумажные полотенца под рукой, чтобы вытереть любые капли. Поскольку активность серной кислоты изменяется при длительном воздействии воздуха, используйте однородную смесь серной кислоты для всего анализа. Используя повторный пипетатор, равномерно добавляйте 300 мкл 75% серной кислоты в каждую трубку. Вихрь трубок энергично перемешивается, чтобы хорошо перемешать, направляя трубку в сторону во время вихря. Поместите трубки в блок нагревателя в устойчивом темпе в последовательном порядке. Как только все трубки вовремя войдя, установите таймер на 3 минуты. Через 3 мин снимите трубки в устойчивом темпе в том же порядке, и поместите их непосредственно в стойку на ледяной водяной бане. Оставьте трубки до тех пор, пока они не будут ледяными. Снимите трубки и дайте им выравниваться до комнатной температуры в течение ~ 5 мин, чтобы предотвратить конденсацию на кювете во время считывания. Установите спектрофотометр UV/VIS для считывания поглощения при 430 нм с помощью кюветы с 10 мм. Заготовка с нулевой стандартной трубкой. Считывание поглощения всех трубок при 430 нм.ПРИМЕЧАНИЕ: Одноразовые пластиковые кюветы удобны в использовании. Постройте стандартную кривую, построив мкг углеводного стандарта против A430. См. рисунок 4 для типичной стандартной кривой, использующего глюкозу в качестве эталонного стандарта. Используя пробные пробирки со значениями А430, попадающими в линейный диапазон стандартной кривой, рассчитайте количество мкг неизвестного полисахарида в пробных пробирках образца из уравнения стандартной кривой. Определяют концентрацию неизвестного полисахарида из объема неизвестного добавленного, с учетом разбавлений. При необходимости переоформляйте концентрацию в мг/мл или мкМ повторяющихся единиц. Гидразидный анализ с использованием тринитробензолсульфоновой кислоты (TNBS)Готовят 0,9% NaCl, содержащий 0,02% азида натрия (буфер образца), растворяя 9 г NaCl и 200 мг азида натрия в dIH2O до конечного объема 1 л. Готовят 0,1 М бората натрия, рН 9 (буфер анализа), смешивая 100 мл 0,5 М бората натрия, рН 9, с 400 мл dIH2O. Подтвердите, что рН раствора составляет 9 ± 0,1; при необходимости отрегулируйте. Готовят 1% ТНБС путем разбавления 200 мкл 5% 2,4,6-раствора тринитробензола сульфокислота до 1 мл с dIH2O. Пробирку маркируют как 1% ТНБС и хранят при 4 °С в темноте в течение недели. Готовят запас АДГ 50 мМ (что эквивалентно 100 мМ гидразида). Взвесьте 871 мг порошка адипик-дигиразида (АДГ) с помощью аналитических весов. Растворите порошок в бутылке с реагентами, добавив буфер пробы до 100 мл с помощью баланса верхнего загрузчика. Маркируете бутылку как гидразид 100 мМ/50 мМ АДГ. Плотно закуйте флакон и храните при 4 °C в течение 1 года. Подготовьте гидразидные стандарты (гидразид 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 и 0,6 мМ гидразида). Подготовьте 6 стандартов гидразида, разбавляя запас гидразида 100 мМ буфером sample с помощью верхнего баланса погрузчика. Подготовьте 100 мл каждого стандарта, чтобы свести к минимуму погрешность концентрации. Плотно закройте бутылки и храните при 4 °C в течение 1 года. Настройка реакций анализаПРИМЕЧАНИЕ: Анализ TNBS проводится при реакционном объеме 1 мл. Каждая пробирка состоит из 100 мкл образца (или стандарта), 875 мкл буфера анализа и 25 мкл 1% раствора TNBS. Все реакции анализа (как для образцов, так и для стандартов) устанавливаются в трех вариантах. Этикетка 3 боросиликатные стеклянные трубки (12 x 75 мм) для каждого стандарта, включая нулевой стандарт. Отсортируйте и расположите стандартные трубки в трубной стойке в порядке увеличения концентрации. Используйте калиброванную микропипетку 100 мкл или 200 мкл, чтобы точно добавить 100 мкл эталонов в каждую соответствующую трубку. Для нулевого стандарта используйте 100 мкл буфера Sample. Этикетка 3 боросиликатные стеклянные трубки (12 x 75 мм) для каждого разбавленного образца, который необходимо провести анализ. Отсортируйте и расположите пробирки в стойке для трубок соответствующим образом. Используйте калиброванную микропипетку 100 мкл или 200 мкл для точного добавления 100 мкл образца в каждую соответствующую пробирку. Используйте калиброванную микропипетку 1000 мкл, чтобы точно добавить 875 мкл буфера анализа во все пробирки: стандарты и образцы. Чтобы начать реакцию анализа, используйте калиброванную микропипетку 100 мкл, чтобы точно добавить 25 мкл 1% TNBS в каждую пробирку. Начните с нуля стандартных пробирок, перейдите к стандартным пробиркам в порядке повышения концентрации, затем к пробоотборникам согласно заранее определенному порядку. Меняйте наконечники при запуске нового стандарта или нового образца и держите время, затраченное на добавление TNBS во все пробирки, в течение 5 минут. Вихрь всех пробирных трубок в течение 2 с на высокой скорости или на скорости установки, позволяя жидкости внутри пробирной трубки закручиваться вверх, чтобы достичь высоты 1/2 дюйма от отверстия трубки. Запишите время начала анализа и установите таймер на 2 ч. Поместите стойку для пробирки в темное время суток при комнатной температуре на 2 ч. Когда время закончится, еще раз вихрьйте все трубки и приступайте к сбору данных. Сбор данных Позвольте спектрофотометру UV/VIS прогреться, а базовая линия стабилизируется. Установите длину волны обнаружения на уровне 500 нм для гидразидного анализа. Используйте кварцевую кювету объемом 1 мл длиной 1 см для всех измерений поглощения для всего анализа. Начните сбор данных с переноса нулевого стандартного анализа на кювету; заглушить инструмент (установите поглощение равным нулю). Выполните однократное считывание на каждой трубке и запишите значения поглощения в таблицу данных. Удалите остатки жидкости из кюветы перед чтением нового образца. Начните с нулевых норм, переходите к нормам повышения концентрации, а затем к образцам. После запуска выполните все шаги эффективно, не останавливаясь, и прочитайте все трубки в течение 10 минут. Анализ демонстрационных данных Создайте стандартную кривую, построив стандарт гидразида мМ против стандарта А500. Найдите стандартное уравнение кривой в виде y = ax + b, где y представляет гидразид mM, а x представляет A500. Типичная стандартная кривая см. на рисунке 4. Рассчитайте мМ гидразида в образцах, используя стандартное уравнение кривой с поправкой на коэффициенты разрежения. Выбирайте только пробоотборные пробирки со значениями A500, попадающими в линейный диапазон стандартной кривой для расчета. Рассчитайте молярное соотношение гидразида/полисахарида с помощью уравнения (1).Гидразид/полисахарид = ч/с × МВт (1) Где h – гидразид мМ, c – концентрация мг/мл полисахарида, а MW – молекулярная масса полисахарида в кДа. Рассчитать плотность маркировки гидразида на 100 кДа полисахарида по уравнению (2).Плотность маркировки на полисахарид 100 кДа = ч/с × 100 (2)Где h – гидразид mM, а c – концентрация мг/мл полисахарида.ПРИМЕЧАНИЕ: Для удобства полисахариды можно считать имея молекулярную массу 100 000 дальтон. Это позволяет учитывать «плотность маркировки» при сравнении уровня дериватизации различных полисахаридов. Рассчитайте плотность маркировки гидразида в весовом проценте АДГ. Определить эффективную концентрацию МГ/мл АДГ можно с помощью уравнения(3).мг/мл АДГ = (мМ гидразида / 1000) × 174 (3)где 174 — МВт АДГ. Рассчитайте вес % АДГ с помощью уравнения (4).вес % АДГ = (мг/мл АДГ) / (мг/мл полисахарида) × 100 (4)